專利名稱：用于胃癌檢測的標(biāo)記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥的檢測。具體而言，本發(fā)明涉及用于癌癥檢測的遺傳標(biāo)記物和/或蛋白質(zhì)標(biāo)記物的用途，并且更加具體而言涉及到遺傳標(biāo)記物和/或蛋白質(zhì)標(biāo)記物用于胃 癌檢測的用途。
背景技術(shù)：
癌癥的早期檢測和治療能顯著提高癌癥患者的存活。以胃癌為例，診斷為疾病早期的患者5年存活率為90%，而診斷為疾病晚期的患者5年存活率約為10%。然而，絕大多數(shù)胃癌患者通常處于疾病晚期。因此，開發(fā)胃癌早期診斷方法能夠改善患者的預(yù)后。在包括體液如血液、尿液、腹膜灌洗液和糞便提取物在內(nèi)的生物標(biāo)本中的特異性癌癥相關(guān)標(biāo)記物的鑒定能提供有價(jià)值的癌癥早期診斷方法，以便早期治療并改善預(yù)后。特異性癌癥標(biāo)記物還能提供用于監(jiān)測疾病進(jìn)展的方法，從而能跟蹤外科手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療的功效。然而，對(duì)于許多主要癌癥，可利用的標(biāo)記物缺乏足夠的敏感性和特異性。例如，用于胃癌的最常用標(biāo)記物cal9_9、ca72_4和癌胚抗原(CEA)僅檢測到大約15-50%的任何階段的胃腫瘤，對(duì)于疾病早期的檢測則降至大約2-11%。因此，出現(xiàn)假陰性檢測的頻率非常高，這導(dǎo)致患者和健康護(hù)理工作者認(rèn)為不存在疾病，而事實(shí)上，患者可能患有嚴(yán)重的需要立即注意的癌癥。而且，使用這些標(biāo)記物可能對(duì)高達(dá)1/3的患有良性胃疾病個(gè)體給出假陽性信號(hào)。發(fā)明簡述因此，迫切需要更好的檢測癌癥存在的方法。本發(fā)明方面提供了能夠檢測早期癌癥和降低假陽性和假陰性測試結(jié)果頻率的方法、成分和裝置。在某些實(shí)施方案中，可以使用分子分析來鑒定與非惡性胃組織相比在胃腫瘤組織中過表達(dá)的基因。此分析包括微陣列和定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)方法。癌基因和由那些基因編碼的蛋白質(zhì)在本文中稱作胃腫瘤標(biāo)記物(GTM)。需要理解的是術(shù)語GTM并不要求標(biāo)記物僅僅對(duì)于胃腫瘤是特異的。而是應(yīng)當(dāng)解釋為GTM可以在包括惡性或非惡性腫瘤在內(nèi)的其他類型腫瘤中表達(dá)增加，其中所述腫瘤除此之外包括胃癌、膀胱癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、皮膚癌(例如黑素瘤)、肝癌、食道癌、子宮內(nèi)膜癌和腦癌。無論如何應(yīng)當(dāng)這樣理解，即術(shù)語GTM不包括在先技術(shù)標(biāo)記物cal9-9、ca72_4和CEA。一些GTM的過表達(dá)足以高度可靠地診斷胃癌，而且在其它情況下，兩種或多種GTM的過表達(dá)能提供胃癌的可靠診斷。
在某些實(shí)施方案中，可以用微陣列方法來檢測一種或多種癌相關(guān)基因的過表達(dá)模式。在其它實(shí)施方案中，可以用定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)來鑒定腫瘤或其它生物樣品中過表達(dá)標(biāo)記物的存在。在本文公開的一些GTM檢測的實(shí)施方案中，GTM在腫瘤細(xì)胞內(nèi)以高度選擇方式過表達(dá)而在非腫瘤細(xì)胞即使表達(dá)也是很少，從而能夠只檢測一種過表達(dá)的GTM來對(duì)癌癥進(jìn)行敏感和精確檢測。在其它實(shí)施方案中，可以在樣品中檢測兩種、三種或更多GTM的過表達(dá)并從而能提供更大的診斷確定性。所選擇基因編碼的蛋白質(zhì)能夠被細(xì)胞分泌出來或從細(xì)胞中穿透出來。這些蛋白質(zhì)可以單獨(dú)或彼此聯(lián)合用作診斷胃癌的血清或體液標(biāo)記物或者作為監(jiān)測所確定疾病進(jìn)展的標(biāo)記物。可以使用本領(lǐng)域已知的方法開展蛋白質(zhì)標(biāo)記物的檢測，并且所述方法包括單克隆抗體、多克隆抗血清等的使用。·附圖簡述關(guān)于其特定實(shí)施方案和圖在本發(fā)明中進(jìn)行了描述，其中圖I描述了本發(fā)明的胃癌標(biāo)記物及其寡核苷酸序列列表。圖2描述了用微陣列方法進(jìn)行研究獲得的結(jié)果列表。圖3描述了用定量PCR進(jìn)行研究獲得的結(jié)果列表。圖4a_4d描述了用微陣列方法和qPCR方法獲得的倍數(shù)的log2數(shù)值結(jié)果之間的關(guān)系，其中對(duì)于四種胃癌標(biāo)記物數(shù)據(jù)集中于中間的正常值?；疑綁K對(duì)應(yīng)非惡性腫瘤(“正?！?樣品，而黑色三角對(duì)應(yīng)腫瘤樣品。圖4a =ASPN0圖4b =SPPl0圖4c :SPARC。圖4d MMP12。圖5a_5w描述了顯示從定量PCR研究獲得的多種腫瘤標(biāo)志物的相對(duì)頻率對(duì)變化倍數(shù)的 log2 數(shù)值的柱狀圖。圖 5a =ASPN ;圖 5b :CST1、2 和 4 ;圖 5c CSPG2 ;圖 5d IGFBP7 ;圖5e :INHBA ;圖 5f L0XL2 ;圖 5g :LUM ;圖 5h SFRP4 ;圖 5i :SPARC ;圖 5j SPP1 ;圖 5k THBS2 ；圖 51 TIMP1 ;圖 5m adlican ;圖 5n PRS11 ;圖 5o ASAH1 ;圖 5p SFRP2 ;圖 5q :GGH ;圖 5r MMP12 ;圖 5s KLK10 ;圖 5t =LEPREl ;圖 5u :TG ;圖 5v EFEMP2 和圖 5w TGFBL·圖6是顯示表達(dá)高于中間正常表達(dá)的第95百分位數(shù)的腫瘤標(biāo)記物數(shù)量的柱狀圖。結(jié)果以qPCR數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)并分別顯示了每一份腫瘤樣品的結(jié)果。圖7a_7c描述了與腫瘤標(biāo)記物CEA基因表述相比，在單個(gè)腫瘤樣品和非惡性腫瘤樣品中標(biāo)記物的相對(duì)的log2表達(dá)圖。CEA是當(dāng)前最常用的用于監(jiān)測胃癌進(jìn)展的血清標(biāo)記物。圖8顯示的是圖3的補(bǔ)充列表。圖8總結(jié)了用qPCR檢測候選腫瘤標(biāo)記物的表達(dá)水平，但是使用的是配對(duì)數(shù)據(jù)(即腫瘤(“T”)和非惡性腫瘤(“N”)樣品來自同一個(gè)體)從而提供T : N比。圖8還包括了圖3中未包括的其它標(biāo)記物，即麗 2，061 11，丁6 81，？051(5，SERPINB5, SERPINH1。為了比較，也顯示了已經(jīng)建立的血清標(biāo)記物基因CEACAM5 (CEA)的表達(dá)水平。在29個(gè)標(biāo)記物中有27個(gè)具有高于或等于CEA的T N差異中值。此外，與CEA相比，全部29個(gè)標(biāo)記物在配對(duì)樣品中具有較高的百分比，其中在腫瘤樣品中標(biāo)記物的表達(dá)超過在正常樣品中的表達(dá)。CST1，2，4、ASPN和SFRP4三種標(biāo)記物在配對(duì)的腫瘤樣品和正常樣品之間的表達(dá)顯示出100%的差異。本文顯示了這三種標(biāo)記物的基因序列以及用來檢測它們的引物和探針位置。圖9a_9d描述了 29種胃癌標(biāo)記物在40位患者的配對(duì)樣品中的單個(gè)的及中值的T N變化倍數(shù)數(shù)據(jù)。圖IOa-IOad描述了 CEA和本發(fā)明中其它GTM表達(dá)在腫瘤分期和變化倍數(shù)的log2數(shù)值間的關(guān)系圖。圖 IOa adlican ;圖 IOb :ASPN ;圖 IOc CSPG2 ;圖 IOd :CST1，2，4 ;圖 IOe EFEMP2 ;圖 IOf :GGF ;圖 IOg :INHBA ;圖 IOh IGFBP7 ;圖 IOi =KLKlO ;圖 IOj =LEPREl ;圖 IOk :LUM ；圖 101 L0XL2 ；圖 IOm =MMPl2 ；圖 IOn ；TIMP1 ；圖 IOo =ASAHl ；圖 IOp =SPPl ;圖 IOq :SFRP2 ；圖 IOr SFRP4 ；圖 IOs =SPARC ；圖 IOt =PRSSll ；圖 IOu THBS2 圖 IOv TG ;圖 IOw :TGFBI ;圖 IOx =CGRll ;圖 IOy SERPINH1 ;圖 IOz MMP2 ;圖 IOaa PCSK5 ;圖 IOab SERPINB5 ；圖 IOac : TGFBI 和圖 IOad CEA (CEACAM5)。圖I la-1 Iad描述了本發(fā)明的29種GTM和CEA表達(dá)在腫瘤類型(擴(kuò)散型⑶和腸型(I))和變化倍數(shù)的log2數(shù)值間的關(guān)系圖。圖Ila adlican ;圖lib :ASPN ;圖lie CSPG2 ;圖lid :CST1，2，4 ;圖 lie EFEMP2 ;圖 Ilf :GGH ;圖 Ilg :INHBA ;圖 Ilh IGFBP7 ;圖 Ili =KLKlO ；·圖 Ilj =LEPREl :圖 Ilk :LUM ;圖 111 L0XL2 ;圖 Ilm =MMPl2 ;圖 Iln =TIMPl ;圖 Ilo =ASAHl ；圖 lip =SPPl ;圖 Ilq SFRP2 ;圖 Ilr SFRP4 :圖 Ils ；SPARC ;圖 lit =PRSSll :圖 Ilu THBS2 ；圖 Ilv :TG ;圖 Ilw :TGFBI ;圖 Ilx =CGRll ;圖 Ily SERPINH1 ;圖 Ilz MMP2 ;圖 Ilaa PCSK5 ；圖 Ilab SERPINB5 ;圖 Ilac =TGFBl 和圖 Ilad CEA(CEACAM5)。

圖12描述了顯示三種標(biāo)記物SERPINH1、CST1，2，4和INHBA在一系列胃腫瘤樣品和非惡性腫瘤胃樣品中表達(dá)的三維圖。圖13描述了顯示多重標(biāo)記物對(duì)精確區(qū)分腫瘤組織和非惡性腫瘤組織能力的影響的表。此表來自qPCR數(shù)據(jù)的正態(tài)分布。圖14是來源于腫瘤和非腫瘤組織的4種腫瘤標(biāo)記物的Western印跡。圖15是胃癌組織和血清中腫瘤標(biāo)志物SPARC的Western印跡。圖16是胃細(xì)胞系A(chǔ)GS上清中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN的免疫印跡。發(fā)明詳述定義在詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方案之前，提供本文使用的一些術(shù)語的定義是有用的。術(shù)語“GTM”或“胃腫瘤標(biāo)記物”或“GTM家族成員”指與胃癌有關(guān)的基因、基因片段、RNA、RNA片段、蛋白質(zhì)或相關(guān)蛋白質(zhì)片段或者其它鑒別分子，其中不包括在先技術(shù)已知的與胃癌相關(guān)的分子cal9-9、ca72-4和CEA。下文包括了 GTM實(shí)例。述語“標(biāo)記物”指在數(shù)量和質(zhì)量上與生物現(xiàn)象的存在相關(guān)的分子。“標(biāo)記物”的實(shí)例為GTM，然而，“標(biāo)記物”還包括與不良狀況形成機(jī)制直接相關(guān)或者間接相關(guān)的代謝產(chǎn)物、副產(chǎn)物。術(shù)語“qPCR”指定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。術(shù)語“表達(dá)”包括mRNA從基因或基因部分的產(chǎn)生，并且包括由RNA或基因或基因部分所編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，還包括與表達(dá)相關(guān)的檢測物質(zhì)的出現(xiàn)。例如，結(jié)合配體(如抗體)與基因或其它寡核苷酸、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的結(jié)合以及結(jié)合配體的顯色都包括在術(shù)語“表達(dá)”的范圍內(nèi)。因此，在免疫印跡如Western印跡上斑點(diǎn)密度的增加也處于以生物學(xué)分子為基礎(chǔ)的術(shù)語“表達(dá)”的范圍內(nèi)。
術(shù)語“CPN2”指人羧肽酶N多肽2 (83kDa的鏈)和羧肽酶N。術(shù)語“HAPLN4”指人透明質(zhì)酸糖蛋白連接蛋白4。術(shù)語“MMP12”指人基質(zhì)金屬蛋白酶12。術(shù)語“INHBA”指人抑制素β A(還包括激活蛋白A、激活蛋白AB或α多肽)。術(shù)語“IGFBP7”指人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7。術(shù)語“GGH”指人Y谷氨酰水解酶(也稱作結(jié)合酶、葉酰聚Y谷氨酰水解酶)。術(shù)語“LEPRE1”指人富含亮氨酸脯氨酸的蛋白多糖(也稱作I印recanl)。術(shù)語“CST4”指人半胱氨酸蛋白酶抑制劑S。 術(shù)語“SFRP4”指人分泌型frizzled相關(guān)蛋白4。術(shù)語“ASPN” 指人 asporin (也稱作 I 類 LRR)。術(shù)語“CGREF1”或“CGR11”指具有EF手型結(jié)構(gòu)域I的人細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子。除非另外說明，術(shù)語“KLK”指人激肽釋放酶10變體I、或者人激肽釋放酶10變體2、或者兩者。術(shù)語“TIMP1”指人金屬蛋白酶組織抑制劑I (也稱作促紅細(xì)胞活性劑(erythroidpotentiating activity)或膠原酶抑制劑)。術(shù)語“SPARC”指富含半胱氨酸的人分泌型酸性蛋白質(zhì)(也稱作骨粘連蛋白)。術(shù)語“TGFBI”指68kDa的人轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)蛋白(transforming growthfactor, beta-induced,68kDa)。術(shù)語“EFEMP2”指包含EGF的纖蛋白樣細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)2。術(shù)語“LUM”指人光亮蛋白聚糖。術(shù)語“SNN” 指人 stannin。術(shù)語“SPP1”指人分泌型磷蛋白I (也稱作骨橋蛋白或骨唾液酸蛋白I或早期T-淋巴細(xì)胞活化劑I)。術(shù)語“CSPG2”指人硫酸軟骨素蛋白聚糖2(也稱作多功能蛋白聚糖)。術(shù)語“ASAHl ”指人N-?；拾贝减０匪饷缸凅wI，或者N-?；拾贝减０匪饷缸凅w2，或者N-?；拾贝减０匪饷缸凅wI和2 (也稱作酸性神經(jīng)酰胺酶I變體I和2)。術(shù)語“PRSS11”指人絲氨酸蛋白酶11 (也稱作IGF結(jié)合絲氨酸蛋白酶)。術(shù)語“SFRP2”指人分泌型frizzled相關(guān)蛋白2。術(shù)語“PLA2G12B”指人XIIB組磷脂酶A2。術(shù)語“SP0N2”指人細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)spondin 2。術(shù)語“0LFM1 ”指人嗅介蛋白I。術(shù)語“TSRC1 ”指人包含重復(fù)的血小板反應(yīng)蛋白I (thrombospondin repeatcontaining I)。術(shù)語“THBS2”指人血小板反應(yīng)蛋白2。術(shù)語“adlican，，指DKFZp564I1922。術(shù)語“CST2”指人半胱氨酸蛋白酶抑制劑SA。術(shù)語“CST1”指人半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN。術(shù)語“L0XL2”指人賴氨酰氧化酶樣酶2。
術(shù)語“TG”指人甲狀腺球蛋白。術(shù)語“TGFB1”指人轉(zhuǎn)化生長因子，β I。術(shù)語“SERPINH1”指人絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)化枝Η(也稱作熱休克蛋白47成員I或膠原結(jié)合蛋白I)。術(shù)語“SERPINB5”指人絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)化枝B (也稱作卵清蛋白成員5)。術(shù)語“CEACAM5”或“CEA”指人癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子5。術(shù)語“ΜΜΡ2”指人基質(zhì)金屬蛋白酶2 (也稱作明膠酶A或72kDa明膠酶或72kDa IV型膠原酶)。 術(shù)語“PCSK5”指人前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin類型5 (proproteinconvertase subtilisin/kexin type 5)。應(yīng)當(dāng)理解，上述術(shù)語可以指蛋白質(zhì)、DNA序列和/或RNA序列。還應(yīng)當(dāng)理解，上述術(shù)語還可以指具有與本文所述相同序列的非人類蛋白質(zhì)、DNA和/或RNA。本發(fā)明實(shí)施方案詳述本發(fā)明提供了在檢測胃癌方面比在先技術(shù)的標(biāo)記物可靠性更高的用于檢測和評(píng)價(jià)腫瘤(包括胃癌)的標(biāo)記物。術(shù)語“可靠性”包括不存在假陽性和/或假陰性。因此，標(biāo)記物的可靠性越高，與使用此標(biāo)記物所作出的診斷相關(guān)的假陽性和/或假陰性就越少。所以，在某些實(shí)施方案中，提供了允許胃癌檢測可靠性比為50 %左右的先技術(shù)標(biāo)記物可靠性更高的標(biāo)記物。在其它實(shí)施方案中，提供了可靠性大于70%左右的標(biāo)記物；在其它實(shí)施方案中，提供了可靠性大于73%左右的標(biāo)記物；還是在其它實(shí)施方案中，提供了可靠性大于80%左右的標(biāo)記物；在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了可靠性大于90%左右的標(biāo)記物；還是在其它實(shí)施方案中，提供了可靠性大于95 %左右的標(biāo)記物；在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了可靠性大于98%左右的標(biāo)記物并且在某些實(shí)施方案中，提供了可靠性為大約100%的標(biāo)記物。因此，我們已經(jīng)意外發(fā)現(xiàn)了許多其存在與胃腫瘤相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)。因此，對(duì)基因產(chǎn)物(例如寡核苷酸諸如mRNA)以及從該寡核苷酸翻譯而來的蛋白質(zhì)和肽的檢測能用來診斷腫瘤，如胃腫瘤。對(duì)來自胃腫瘤患者的腫瘤組織和同一受試者非惡性腫瘤組織的樣品進(jìn)行陣列分析，意外地發(fā)現(xiàn)在很多胃腫瘤中某些基因過表達(dá)的特定模式與疾病相關(guān)。還可以使用抗癌標(biāo)記物的抗體檢測癌標(biāo)記物。通過分析多個(gè)癌標(biāo)記物的存在和表達(dá)量從而能提高診斷敏感性同時(shí)降低假陽性和/或假陰性結(jié)果的頻率。癌癥檢測的一般方法以下方法是使用GTM家族成員檢測包括胃癌在內(nèi)的癌癥的非限定性方法?！な褂脤?duì)GTM基因產(chǎn)物具有選擇性的寡核苷酸探針的微陣列方法。 使用標(biāo)記物特異性引物和探針對(duì)腫瘤樣品和正常樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)。·酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。·使用抗標(biāo)記物的抗體對(duì)胃腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。·使用抗標(biāo)記物的抗體對(duì)其它腫瘤進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，其中所述的其它腫瘤包括但不限于結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝癌、食道癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌和腦癌。 對(duì)胃癌患者手術(shù)切除腫瘤之前和之后留取血清中的標(biāo)記物家族成員進(jìn)行免疫檢測?！?duì)健康個(gè)體和患有非惡性腫瘤疾病(例如胃炎、潰瘍、胃上皮化生和發(fā)育異常)個(gè)體血清中的標(biāo)記物家族成 員進(jìn)行免疫檢測?！?duì)其它癌癥患者中的標(biāo)記物家族成員進(jìn)行免疫檢測，其中所述的其它癌癥包括但不限于結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝癌、食道癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌和腦癌?！?duì)體液中的標(biāo)記物進(jìn)行檢測，其中所述的體液包括血清、淋巴液、腹膜液、腦脊液、滑液等。·對(duì)胃癌患者胃液、腹膜灌洗液、尿液和糞便中的標(biāo)記物家族成員進(jìn)行免疫檢測。使用陣列方法和/或qPCR。 使用計(jì)算機(jī)對(duì)陣列數(shù)據(jù)或qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。收集原始數(shù)據(jù)并通過比較胃腫瘤基因表達(dá)水平和同一基因在非腫瘤組織中的表達(dá)水平進(jìn)行變化倍數(shù)分析。提供用于斷定表達(dá)增加的閾值(例如，I. 5倍增加、2倍增加，并且在備選的實(shí)施方案中為3倍增加、4倍增加或5倍增加)。應(yīng)該意識(shí)到，用于斷定已發(fā)生表達(dá)增加的其它閾值可以在不脫離本發(fā)明的范圍內(nèi)選擇。對(duì)腫瘤基因表達(dá)的進(jìn)一步分析包括將呈現(xiàn)出表達(dá)增加的那些基因與已知胃腫瘤表達(dá)譜相匹配以便診斷腫瘤。在某些方面，本發(fā)明提供了檢測癌癥的方法，其包括(a)準(zhǔn)備生物學(xué)樣品；和(b)檢測GTM豕族成員在所述樣品中的過表達(dá)。在其它方面，本發(fā)明包括檢測GTM mRNA過表達(dá)的步驟。在其他方面，本發(fā)明包括檢測GTM蛋白質(zhì)過表達(dá)的步驟。在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括檢測GTM肽過表達(dá)的步驟。在仍然進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括檢測GTM的裝置，其包括其上具有GTM捕獲試劑的基質(zhì)；和與所述基質(zhì)關(guān)聯(lián)的檢測器，所述檢測器能夠檢測與所述捕獲試劑相關(guān)的GTM，其中捕獲試劑包括寡核苷酸或抗體。另外的方面包括用于檢測癌癥的試劑盒，其包含基質(zhì)；GTM捕獲試劑，其包含一種或更多GTM特異性寡核苷酸和GTM特異性抗體；和使用說明書。本發(fā)明更進(jìn)一步的方面包括使用qPCR檢測GTM的方法，其包括對(duì)所述GTM特異的正向引物；對(duì)所述GTM特異的反向引物；PCR 試劑；反應(yīng)小管；和使用說明書。本發(fā)明的另外方面包括檢測GTM蛋白質(zhì)或肽存在的試劑盒，其包含
具有針對(duì)所述GTM蛋白質(zhì)或妝的捕獲試劑的基質(zhì)；對(duì)所述GTM蛋白質(zhì)或肽特異的抗體；能夠?qū)︶槍?duì)所述GTM蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合抗體進(jìn)行標(biāo)記的試劑；和使用說明書。在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括檢測胃癌的方法，其包括步驟
從懷疑患有胃癌的患者準(zhǔn)備樣品；用ELISA方法測定GTM蛋白質(zhì)的存在。如本文所描述，腫瘤檢測可以通過測定一種或更多腫瘤特異性標(biāo)記物的表達(dá)來完成。我們已經(jīng)意外發(fā)現(xiàn)GTM的增強(qiáng)表達(dá)與所診斷胃癌存在之間的相關(guān)性非常高。檢測到的最小顯著相關(guān)性的P值約1.6X10'許多相關(guān)性在P值小于10_2°時(shí)具有意義。由于具有如此高的顯著性，就不必檢測一種以上GTM的增強(qiáng)表達(dá)。然而，本發(fā)明過多的GTM能夠提高胃癌檢測的可靠性。本文提供的方法還包括高敏感性的測定法。qPCR非常靈敏從而能用來檢測樣品中拷貝數(shù)非常低(例如，1-100)的基因產(chǎn)物。這樣的敏感性使得對(duì)胃癌相關(guān)事件的極早檢測成為可能。方法下面的普通方法用來評(píng)價(jià)用于胃癌相關(guān)標(biāo)記物分子鑒定的多種方法的適宜性。腫瘤收集從韓國的首爾大學(xué)醫(yī)院和新西蘭的Dunedin醫(yī)院手術(shù)切除樣品中收集胃腫瘤樣品和非惡性胃組織。胃癌診斷是基于癥狀、體檢發(fā)現(xiàn)和對(duì)組織的組織學(xué)檢查做出的。RNA 提取在一些實(shí)施方案中，通過測定腫瘤樣品中RNA的變化分析胃癌相關(guān)基因的表達(dá)。將冰凍的手術(shù)樣品包埋入OCT介質(zhì)中。使用切片機(jī)從組織塊中切出60 μ M厚的切片，放入TriReagent :水(3 I)混合物中勻衆(zhòng),再用氯仿抽提。然后用Rneasy 方法(Qiagen)從水相中純化總RNA。同樣也從16種癌細(xì)胞系中提取RNA并且合并后作為參考RNA。微陣列玻片制備環(huán)氧樹脂包被的玻片從MWG Biotech AG (Ebersberg,德國)獲得，并且使用GeneMachines微陣列機(jī)器人并根據(jù)廠商提供的方法在上面印上 30，000條50mer寡核苷酸。圖2顯不了相關(guān)募核昔酸的參考號(hào)(MWG oligo#)以及NCBI mRNA和蛋白質(zhì)參考序列。下文還顯示了本發(fā)明GTM的全部DNA序列。RNA標(biāo)記和雜交用Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)在包含5_(3_氨燒基)_2’ _脫氧尿苷-5’ -三磷酸的反應(yīng)中將10 μ g總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Microcon柱去離子之后，與Cy3或Cy5在碳酸氫緩沖液中室溫孵育I小時(shí)。經(jīng)Qiaquick柱(Qiagen)去除未結(jié)合的染料，并在SpeedVac中濃縮樣品至15 μ L。然后，Cy3和Cy5標(biāo)記的cDNA與AmbionULTRAhyb緩沖液混合，100°C變性2分鐘，在雜交盒中與微陣列玻片于42°C雜交16小時(shí)。然后洗滌玻片并用Axon 4000A掃描儀在兩種功率設(shè)置下進(jìn)行兩次掃描產(chǎn)生基因表達(dá)的初步熒光數(shù)據(jù)。
歸一化方法為比較腫瘤組織和非癌組織中癌基因的表達(dá)，應(yīng)用Genepix軟件檢測的平均熒光強(qiáng)度通過減去局部背景熒光強(qiáng)度得以校正。背景校正強(qiáng)度少于零的點(diǎn)被排除。為了易于歸一化，將強(qiáng)度比和總體點(diǎn)強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)數(shù)(log)轉(zhuǎn)換。對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的強(qiáng)度比通過用L0CFIT 軟件包進(jìn)行局部回歸來校正著色誤差(dye bias)和空間誤差(spatial bias)。對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的強(qiáng)度比同時(shí)對(duì)總體點(diǎn)強(qiáng)度和位置回歸。局部回歸殘差提供了經(jīng)校正的變化倍數(shù)對(duì)數(shù)值。對(duì)于質(zhì)量控制，每個(gè)歸一化微陣列的比率對(duì)于點(diǎn)強(qiáng)度和位置進(jìn)行了繪圖。隨后肉眼檢測圖中可能的殘余假象。另外，應(yīng)用方差分析(ANOVA)模型來檢測針尖誤差(pin-tip bias)。將所有歸一化結(jié)果和參數(shù)插入Postgres數(shù)據(jù)庫進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
在腫瘤樣品對(duì)正常組織中基因表達(dá)中的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義變化可通過測定陣列之間的變化倍數(shù)進(jìn)行鑒定。為實(shí)現(xiàn)此鑒定，將log2(比率)按比例調(diào)整至每個(gè)陣列具有相同的總體標(biāo)準(zhǔn)差。此標(biāo)準(zhǔn)化步驟減少了平均的組織種類內(nèi)變異性。對(duì)于每一個(gè)寡核苷酸，將log2( t匕率)進(jìn)一步轉(zhuǎn)換至中位數(shù)值為零的結(jié)果從而易于肉眼檢察。然后應(yīng)用以變化倍數(shù)為基礎(chǔ)的秩檢驗(yàn)改善噪音魯棒性。此檢驗(yàn)由兩個(gè)步驟組成(i)計(jì)算陣列內(nèi)變化倍數(shù)的等級(jí)(rankof fold change) (Rfc),和(ii)將腫瘤組織的中值(Rfc)減去正常組織的中值(Rfc)。兩個(gè)中值等級(jí)的差異限定了圖2中給出的變化倍數(shù)等級(jí)的范圍。另外兩個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)也根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)進(jìn)行I)進(jìn)行和不進(jìn)行Bonferroni調(diào)整的兩組樣品student' s t_檢驗(yàn)；和2)ffilcoxon 檢驗(yàn)。標(biāo)記物組合的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為了確定使用兩種或三種標(biāo)記物組合區(qū)分腫瘤和非惡性腫瘤樣品的數(shù)值，對(duì)來自40份配對(duì)樣品(來自同一患者的腫瘤樣品和非惡性腫瘤樣品)的qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行下面的分析。使用樣品平均值和標(biāo)準(zhǔn)差得到非惡性腫瘤樣品和腫瘤樣品的正態(tài)分布。然后確定來自腫瘤表達(dá)數(shù)據(jù)的值可能超過非惡性腫瘤分布中所規(guī)定閾值(例如，大于50%、70%、73%、80%、90%、95%、98%、99%或100% )的可能性(即敏感性)。對(duì)于標(biāo)記物組合，確定了至少一種標(biāo)記物表達(dá)超過閾值的可能性。
權(quán)利要求
1.用于檢測胃癌的方法，其包括 (a)準(zhǔn)備生物學(xué)樣品；和 (b)檢測上述樣品中GTM家族成員的過表達(dá)。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述GTM家族成員選自羧肽酶N，多肽2，83kDa鏈(CPN2)、基質(zhì)金屬蛋白酶12(MMP12)、抑制素(“INHBA”)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(“IGFBP7”)、￥-谷氨酰水解酶(“66!1”)、富含亮氨酸脯氨酸的蛋白多糖(“1^ 1 1”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑 S (“CST4”)、分泌型 frizzled 相關(guān)蛋白 4 (“SFRP4”)、asporin (“ASPN”)、具有 EF 手型結(jié)構(gòu)域I的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子(“CGREF1”)、激肽釋放酶10(KLK10)、金屬蛋白酶組織抑制劑I (“ ΜΡ1”)、富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白質(zhì)(“SPARC”)、轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)蛋白(“TGFBI”)、包含EGF的纖蛋白樣細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)2 (“EFEMP2”)，光亮蛋白聚糖(“LUM”)，stannin (“SNN”)、分泌型磷蛋白I (“SPP1 ”)、硫酸軟骨素蛋白聚糖2 (“CSPG2”)、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(“ASAH1”)、絲氨酸蛋白酶11 (“PRSS11”)、分泌型frizzled相關(guān)蛋白2(“SFRP2”)、XIIB 組磷脂酶 A2(“PLA2G12B”)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì) spondin 2(“SP0N2”)、嗅介蛋白1(“0LFM1”)、包含重復(fù)的血小板反應(yīng)蛋白1(“TSRC1”)、血小板反應(yīng)蛋白2(“THBS2”)、adlican、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SA (“CST2”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN (“CST1”)、賴氨酰氧化酶樣酶2 (“L0XL2”)、甲狀腺球蛋白(“TG”)、轉(zhuǎn)化生長因子β I (“TGFBI”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)化枝H (“SERPINH1”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)化枝B(“SERPINB5”)、基質(zhì)金屬蛋白酶2 (“ΜΜΡ2”)、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin類型5(“PCSK5”)和透明質(zhì)酸糖蛋白連接蛋白4 (“HAPLN4”)。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述檢測步驟通過檢測GTMmRNA的過表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
4.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述檢測步驟通過檢測GTMcDNA的過表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述檢測步驟使用與所述GMTcDNA的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸實(shí)現(xiàn)。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述檢測步驟使用利用正向引物和反向引物的qPCR方法實(shí)現(xiàn)。
7.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述檢測步驟通過檢測GTM蛋白質(zhì)的過表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
8.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述檢測步驟通過檢測GTM肽的過表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述檢測步驟使用抗所述GTM的抗體實(shí)現(xiàn)。
10.權(quán)利要求7-9中任意一項(xiàng)的方法，其中所述檢測步驟使用夾心型免疫測定法實(shí)現(xiàn)。
11.權(quán)利要求7-10中任意一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
12.權(quán)利要求7-10中任意一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是多克隆抗血清。
13.檢測GTM的裝置，其包括 在其上具有GTM捕獲試劑的基質(zhì)；和 與所述基質(zhì)關(guān)聯(lián)的檢測器，所述檢測器能夠檢測與所述捕獲試劑有關(guān)的GTM。
14.權(quán)利要求13的裝置，其中所述GTM捕獲試劑是寡核苷酸。
15.權(quán)利要求13的裝置，其中所述GTM捕獲試劑是對(duì)GTM寡核苷酸、GTM蛋白質(zhì)或者GTM肽特異性的抗體。
16.檢測癌癥的試劑盒，其包括 在其上具有GTM捕獲試劑的基質(zhì)；用于顯現(xiàn)所述GTM捕獲試劑和GTM的復(fù)合物的裝置； 試劑；和 使用說明書。
17.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述GTM捕獲試劑是GTM特異性寡核苷酸。
18.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述GTM捕獲試劑是對(duì)GTM寡核苷酸、GTM蛋白質(zhì)或者GTM肽具有選擇性的GTM特異性抗體。
19.檢測胃癌的方法，其包括步驟 從懷疑患有胃癌的患者制備測試樣品； 測定所述測試樣品中GTM蛋白質(zhì)的存在；和 將所述測試樣品中存在的GTM數(shù)量與來自未患有胃癌的受試者的對(duì)照樣品中的數(shù)值相比較。
20.篩選胃癌的方法，其包括步驟 從測試受試者制備測試樣品； 測定所述測試樣品中GTM的存在；和 將所述測試樣品中存在的GTM數(shù)量與來自未患有胃癌的受試者的對(duì)照樣品中的數(shù)值相比較。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述GTM是GTM蛋白質(zhì)或肽。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述GTM是對(duì)GTM特異性的寡核苷酸。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述寡核苷酸是DNA。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述寡核苷酸是RNA。
25.權(quán)利要求18-24中任意一項(xiàng)的方法，其中所述測定步驟使用ELISA測定法。
26.權(quán)利要求19-21中任意一項(xiàng)的方法，其中所述測試樣品從血漿中獲得。
27.權(quán)利要求19-21中任意一項(xiàng)的方法，其中所述測試樣品從組織、尿液、胃液、血清和糞便中獲得。
全文摘要
腫瘤的早期檢測是患有腫瘤(包括胃腫瘤)的患者存活的主要決定因素。GTM基因家族成員在胃腫瘤組織和其它腫瘤組織中過表達(dá)，因此其可以用作胃癌和其它類型癌癥的標(biāo)記物。GTM蛋白質(zhì)可以從癌細(xì)胞中釋放出來，并在血清和/或其它體液中達(dá)到足夠高的濃度從而得以檢測它們。因此，用于GTM檢測和定量的方法和檢測試劑盒能夠提供胃癌診斷的有價(jià)值的工具。
文檔編號(hào)C12M1/34GK102899398SQ201210297560
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2004年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月17日
發(fā)明者P·J·吉爾福德, A·J·霍利約克 申請(qǐng)人:環(huán)太平洋生物技術(shù)有限公司