專利名稱：水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚病原菌－嗜水氣單胞菌pcr檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物—?jiǎng)ξ掺~的病原菌的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，特別涉及一種嗜水氣單胞菌的基因檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法，適用于水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)微生物監(jiān)測(cè)、基因工程技術(shù)等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和重要支撐條件，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括陸生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。由于水域環(huán)境的特殊性，水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為水域污染的“監(jiān)測(cè)器”，具有陸生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無可替代的優(yōu)勢(shì)。隨著近年來環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，我國(guó)水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)得到了迅猛發(fā)展。RR-B系劍尾魚(Xiphophorus helleri)由近交選育的方式，已培育到第26代，是我國(guó)培育的第一個(gè)水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系。
水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要滿足清潔級(jí)、無特定病原體級(jí)(SPF)要求，細(xì)菌的早期監(jiān)測(cè)技術(shù)是非常重要的。嗜水氣單胞菌(Xiphophorus helleri)屬弧菌科氣單胞菌屬，是淡水水體中的常見細(xì)菌，嗜水氣單胞菌產(chǎn)生的毒素引起劍尾魚出血、潰瘍等癥狀，為觀賞用途養(yǎng)殖劍尾魚的常見病原菌；也是劍尾魚純系培育系統(tǒng)需重點(diǎn)防范的細(xì)菌，是水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚早期監(jiān)測(cè)最重要的細(xì)菌。
目前，對(duì)劍尾魚感染嗜水氣單胞菌的檢測(cè)主要采用常規(guī)生物化學(xué)檢測(cè)。常規(guī)生化檢測(cè)技術(shù)容易出現(xiàn)過多的假陽(yáng)性、假陰性現(xiàn)象；需要將待測(cè)菌株進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，檢測(cè)周期長(zhǎng)，通常要五到七天才能完成一次待測(cè)樣品。因而需要發(fā)展靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱PCR技術(shù))是上世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，由于具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，所以這種方法建立后，很快被應(yīng)用于實(shí)踐中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用劍尾魚病原菌嗜水氣單胞菌氣溶素基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，采用PCR反應(yīng)體系，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化和設(shè)計(jì)，提供水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物—?jiǎng)ξ掺~的嗜水氣單胞菌的PCR檢測(cè)試劑盒及方法。該試劑盒簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便快速、特異性好、靈敏度高，可用于劍尾魚培育各階段的細(xì)菌跟蹤監(jiān)測(cè)，也可用于培育水體的環(huán)境監(jiān)測(cè)，避免培育的水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被嗜水氣單胞菌污染，具有較高的實(shí)用價(jià)值。
本發(fā)明的劍尾魚嗜水氣單胞菌PCR檢測(cè)試劑盒包括下列部件(1)1號(hào)液，樣品稀釋液，1管，內(nèi)裝1×PBS，pH7.4。
(2)2號(hào)液，PCR反應(yīng)液，1管，內(nèi)裝PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，包括ddH2O，含Mg2+的10×Buffer，dNTP，引物Ah01，Ah02和TaqE。
(3)3號(hào)液，陽(yáng)性對(duì)照液，1管，內(nèi)裝從劍尾魚分離的嗜水氣單胞菌的總DNA。
(4)4號(hào)液，陰性對(duì)照液，1管，內(nèi)裝從劍尾魚分離的溫和氣單胞菌的總DNA。
(5)盒子，可裝上述1～4號(hào)液。
上述劍尾魚病原菌嗜水氣單胞菌PCR檢測(cè)試劑盒中所述的一對(duì)引物Ah01和Ah02是根據(jù)嗜水氣單胞菌氣溶素前肽基因的堿基排列順序而設(shè)計(jì)的，其DNA序列分別如下Ah015’-CCA AGG GGT CTG TGG CGA CA-3’Ah025’-TTT CAC CGG TAA CAG GAT TG-3’用本試劑盒檢測(cè)水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚的病原菌嗜水氣單胞菌的方法，按下列步驟進(jìn)行(1)取新鮮待檢樣品，加入1號(hào)液稀釋10-20倍，于無菌勻漿器中冰浴勻漿。
(2)6000-8000r/min離心5-10min。
(3)取上清200μL，煮沸15min，立刻放于冰上5-10min。
(4)6000-8000r/min離心10min，上清作PCR提取。
(5)分別取模板、3號(hào)液(陽(yáng)性對(duì)照液)和4號(hào)液(陰性對(duì)照液)，加入到2號(hào)液(PCR反應(yīng)液)中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR反應(yīng)儀上。
(6)按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增95℃10min，1個(gè)循環(huán)；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min 1個(gè)循環(huán)。
(7)反應(yīng)結(jié)束后，取5-10μL加入到2μL溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳20-30min后，于紫外儀上觀察，若在209bp處出現(xiàn)明亮的發(fā)應(yīng)條帶，則為嗜水氣單胞菌陽(yáng)性；若無反應(yīng)條帶出現(xiàn)，則為陰性。
本發(fā)明的意義本發(fā)明的水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚的病原菌—嗜水氣單胞菌的PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，是根據(jù)從劍尾魚中分離的嗜水氣單胞菌氣溶素前肽基因的堿基排列順序設(shè)計(jì)合成的一對(duì)引物為主體而研制的。利用該對(duì)引物，可以特異性擴(kuò)增攜帶嗜水氣單胞菌的待測(cè)樣品的氣溶素基因片段，所建立的優(yōu)化PCR檢測(cè)體系保證檢測(cè)結(jié)果的快速性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。使用本發(fā)明的試劑盒及檢測(cè)方法，一般只需要3-4個(gè)小時(shí)就可以對(duì)一組待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，待檢樣品中只要有10個(gè)左右的嗜水氣單胞菌菌體就可檢測(cè)到存在，克服了常規(guī)生化檢測(cè)周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，提高了檢測(cè)的靈敏和準(zhǔn)確度。本檢測(cè)試劑盒可以簡(jiǎn)便、快速、靈敏而特異地檢測(cè)感染嗜水氣單胞菌的劍尾魚，還可檢測(cè)水環(huán)境中的嗜水氣單胞菌，極大地方便了水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚培育系統(tǒng)中嗜水氣單胞菌的早期監(jiān)測(cè)。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實(shí)施例1；水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚病原菌—嗜水氣單胞菌PCR檢測(cè)試劑盒該試劑盒由下列部分構(gòu)成(10樣份)(1)1號(hào)液，樣品稀釋液，1管，5mL/管，內(nèi)裝1×PBS，pH7.4。
(2)2號(hào)液，PCR反應(yīng)液，1管，250uL/管，內(nèi)裝PCR擴(kuò)增反應(yīng)液(25uL體系)，包括ddH2O，含Mg2+的10×Buffer，dNTP，引物Ah01，Ah02和TaqE。
(3)3號(hào)液，陽(yáng)性對(duì)照液，1管，20uL/管，內(nèi)裝從劍尾魚分離的嗜水氣單胞菌JY-1的總DNA，作為陽(yáng)性模板。
(4)4號(hào)液，陰性對(duì)照液，1管，20uL/管，內(nèi)裝從劍尾魚分離的溫和氣單胞菌J-21的總DNA。
(5)長(zhǎng)方體盒子，9.0×6.0×6.4cm3。
(6)一塊泡沫板，其大小與盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四個(gè)孔，孔徑1.3cm；第二排五個(gè)孔，孔徑1.0cm；第三和四排分別為7個(gè)孔，孔徑0.6cm。上述各小管分別對(duì)應(yīng)放置于這些小孔中，裝于長(zhǎng)方體盒子中。
該試劑盒中一對(duì)引物Ah01和Ah02的DNA序列為Ah015’-CCA AGG GGT CTG TGG CGA CA-3’Ah025’-TTT CAC CGG TAA CAG GAT TG-3’PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25uL體系)為ddH2O 21uL10×Buffer1.8uLdNTP 0.4uL引物Ah01 0.3uL引物Ah02 0.3uLTaqE 0.2uL實(shí)施例2水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚病原菌—嗜水氣單胞菌PCR檢測(cè)方法使用實(shí)施例1的試劑盒，按下列步驟進(jìn)行(1)用無菌操作方法，取新鮮劍尾魚肝臟組織0.05克，加入樣品稀釋液(1號(hào)液)500uL稀釋10倍，于無菌勻漿器中冰浴勻漿；(2)6000r/min離心6min。
(3)取上清200μL，煮沸15min，立刻放于冰上5-10min。
(4)6000r/min離心10min，上清作PCR模板。
(5)分別取模板、3號(hào)液(陽(yáng)性對(duì)照液)和4號(hào)液(陰性對(duì)照液)，加入到2號(hào)液(PCR反應(yīng)液)中，混勻后離心8sec，置于PCR反應(yīng)儀上。
(6)按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增95℃10min，1個(gè)循環(huán)；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min 1個(gè)循環(huán)。
(7)反應(yīng)結(jié)束后，取5-10μL加入到2μL溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳20-30min后，于紫外儀上觀察，若在209bp處出現(xiàn)明亮的發(fā)應(yīng)條帶，則為嗜水氣單胞菌陽(yáng)性；若無反應(yīng)條帶出現(xiàn)，則為陰性(見

圖1)。
實(shí)施例3劍尾魚培育水體中嗜水氣單胞菌的檢測(cè)使用實(shí)施例1的試劑盒，按下列步驟進(jìn)行(1)吸取待測(cè)水體水樣。
(2)涂布于水樣于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)。
(3)挑取待測(cè)菌落于500uLPBS中，吹打均勻。
(4)12000r/min離心5min，PBS重懸，洗滌2次。
(5)洗滌后的沉淀加入雙蒸水50uL，煮沸5min，立刻放于冰上5-10min。
(6)12000r/min離心5min，上清作PCR模板。
(7)分別取模板、3號(hào)液(陽(yáng)性對(duì)照液)和4號(hào)液(陰性對(duì)照液)，加入到2號(hào)液(PCR反應(yīng)液)中，混勻后離心8sec，置于PCR反應(yīng)儀上。
(8)按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增95℃10min，1個(gè)循環(huán)；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min 1個(gè)循環(huán)。
(9)反應(yīng)結(jié)束后，取5-10μL加入到2μL溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳20-30min后，于紫外儀上觀察，若在209bp處出現(xiàn)明亮的發(fā)應(yīng)條帶，則為嗜水氣單胞菌陽(yáng)性；若無反應(yīng)條帶出現(xiàn)，則為陰性(見圖1)。
圖1為感染嗜水氣單胞菌的劍尾魚肝臟組織及培育水體的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
其中1.溫和氣單胞菌J-21(陰性對(duì)照)；2.劍尾魚肝臟組織樣品A；3.劍尾魚肝臟組織樣品B；4.培育水體樣品C；5.培育水體樣品D；6.嗜水氣單胞菌JY1(陽(yáng)性對(duì)照)；7.分子量標(biāo)準(zhǔn).
權(quán)利要求
1.水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚病原菌—嗜水氣單胞菌的PCR檢測(cè)試劑盒，其特征是包括下列部件(1)1號(hào)液，樣品稀釋液，1管，內(nèi)裝1×PBS，pH7.4。(2)2號(hào)液，PCR反應(yīng)液，1管，內(nèi)裝PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，包括ddH2O，含Mg2+的10×Buffer，dNTP，引物Ah01，Ah02和TaqE；Ah01為5’-CCA AGG GGT CTG TGGCGA CA-3’；Ah02為5’-TTT CAC CGG TAA CAG GAT TG-3’。(3)3號(hào)液，陽(yáng)性對(duì)照液，1管，內(nèi)裝從劍尾魚分離的嗜水氣單胞菌的總DNA。(4)4號(hào)液，陰性對(duì)照液，1管，內(nèi)裝從劍尾魚分離的溫和氣單胞菌的總DNA。(5)盒子，可裝上述1～4號(hào)液。
2.一種檢測(cè)水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚的病原菌—嗜水氣單胞菌的方法，其特征是使用權(quán)利要求1所述試劑盒，按下列步驟進(jìn)行(1)取新鮮待檢樣品，加入1號(hào)液稀釋10-20倍，于無菌勻漿器中冰浴勻漿。(2)6000-8000r/min離心5-10min。(3)取上清200μL，煮沸15min，立刻放于冰上5-10min。(4)6000-8000r/min離心10min，上清作PCR提取。(5)分別取模板、3號(hào)液(陽(yáng)性對(duì)照液)和4號(hào)液(陰性對(duì)照液)，加入到2號(hào)液(PCR反應(yīng)液)中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR反應(yīng)儀上。(6)按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增95℃10min，1個(gè)循環(huán)；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min 1個(gè)循環(huán)。(7)反應(yīng)結(jié)束后，取5-10μL加入到2μL溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳20-30min后，于紫外儀上觀察，若在209bp處出現(xiàn)明亮的發(fā)應(yīng)條帶，則為嗜水氣單胞菌陽(yáng)性；若無反應(yīng)條帶出現(xiàn)，則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚(Xiphophorus helleri)的病原菌-嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。本方法是根據(jù)從劍尾魚中分離的嗜水氣單胞菌的氣溶素基因設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，對(duì)水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚及其培育的水體環(huán)境的嗜水氣單胞菌特異的氣溶素基因進(jìn)行定性檢測(cè)，簡(jiǎn)便快速、特異性好、靈敏度高?？捎糜趧ξ掺~培育各階段的細(xì)菌跟蹤監(jiān)測(cè)，也可用于培育水體的環(huán)境監(jiān)測(cè)，避免培育的水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被嗜水氣單胞菌污染，具有較高的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1978665SQ200510101749
公開日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月2日
發(fā)明者潘厚軍, 吳淑勤, 李寧求, 石存斌 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所