專利名稱：：具有提高的熱穩(wěn)定性、嗜熱性和嗜堿性的家族6纖維素酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的纖維素酶。更具體地，本發(fā)明涉及具有提高的熱穩(wěn)定性(thermostability)、嗜堿性(alkalophilicity)和/或嗜熱性(thermophilicity)的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶。本發(fā)明還涉及包含編碼經(jīng)修飾家族6纖維素酶的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體，用于從宿主菌林中生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的方法，以及經(jīng)修飾的家族6纖維素酶在纖維素水解中的用途。
背景技術(shù)：
：生物圏中最豐富的多糖一一纖維素由通過p-l,4糖苷鍵在線性鏈中連接在一起的D-葡萄糖單元組成。這些鏈長度可變化，并經(jīng)常由成千上萬個單元組成。纖維素鏈形成了大量分子內(nèi)和分子間氫鍵，這導(dǎo)致形成不溶的纖維素微原纖維。這種結(jié)晶纖維素是天然半衰期超過五百萬年的堅韌材料。為了利用這種重要的可更新碳源，微生物(如細(xì)菌和真菌)產(chǎn)生了將結(jié)晶纖維素分解為葡萄糖的酶混合物。三大類纖維素酶協(xié)同作用，將結(jié)晶纖維素水解為簡單的能源葡萄糖。內(nèi)切-P-1,4-葡聚糖酶(￡〔3.2.1.4)隨機水解結(jié)晶纖維素的無定形區(qū)，產(chǎn)生多種長度的寡糖，并因而產(chǎn)生新鏈末端。纖維二糖水解酶(或外切-p-l，4-纖維二糖水解酶，EC3.2.1.91)從纖維素鏈的一端連續(xù)水解纖維二糖單元。最后，p-l，4-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)將纖維二糖水解為葡萄糖。大部分纖維二糖水解酶和內(nèi)切-P-l,4-葡聚糖酶是由催化核心結(jié)構(gòu)域和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，所述催化核心結(jié)構(gòu)域和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域由柔性的接頭區(qū)隔開。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域促進該酶吸附至纖維素底物區(qū)域(Tomme.P.等1988.Eur.J.Biochem170:575-581:Lehtio.J.等2003Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100:484-489)，而催化核心結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)纖維素的切割。接頭區(qū)可確保核心結(jié)構(gòu)域與纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間最佳的結(jié)構(gòu)域間距離(Srisodsuk.M.等1993.J.Biol.Chem.268:20756-20761)?；诎被嵝蛄邢嗨菩詫⒋呋Y(jié)構(gòu)域歸類為糖苷水解酶家族，該家族包括具有相似的折疊和水解機制但是底物特異性可能不同的酶。里氏木霉(7Wc/io^/7iMr^w/)含有已知的纖維素酶基因，它們是兩種纖維二糖水解酶，即Cel7A(也稱為CBH1,其為家族7的成員)和Cel6A(CBH2);至少八種內(nèi)切-p-l，4-葡聚糖酶，即Cel7B(EGl)、Cel5A(EG2)、Cell2A(EG3)、Cd61A(EG4)、Cel45A(EG5)、Cel74A(EG6)、Cel61B(EG7)和Cel5B(EG8);和至少七種卩-l，4-葡萄糖苷酶，即Cel3A(BGl)、CellA(BG2)、Cel3B(BG3)、Cel3C(BG4)、CellB(BG5)、Cel3D和Cel3E(Foreman.P.K.等2003.J.Biol.Chem.278:31988-31997)。里氏木霉Cel6A(或TrCel6A)是該真菌分泌的兩種主要的纖維二糖水解酶之一，并已顯示在結(jié)晶纖維素的酶促水解中是高效的。TrCel6A是糖苷水解酶家族6的成員，該家族包括通過倒轉(zhuǎn)端基構(gòu)型(anomericconfiguration)而水解p-l，4糖苷鍵的酶，并包括纖維二糖水解酶以及內(nèi)切畫p國1,4-葡聚糖。TrCel6A(Rouvinen.J.等1990.Science249:380-386.Erratum:Science19卯249:1359)、褐色嗜熱裂孢菌(T7^fTM^,y^fl/"sc")內(nèi)p-l，4畫葡聚糖酶Cel6A(TfCel6A,Spezio.M.等1993.Biochemistry.32:9卯6-9916)、特異腐質(zhì)霉C^"挑ico/fl/fwo/^is)纖維二糖7jC解酶Cel6A(HiCd6A，Varrot.A.等.1999Biochem.J.337:297-304)、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切-卩-1，4-葡聚糖酶Cel6B(HiCel6B,Davies.G.J.等2000.Biochem.J.348:201-207)和結(jié)核分枝桿菌(AfycMfl"w/w附H37RvCel6A(MtCel6A,Varrot.A.等.2005.J.Biol.Chem.280:20181-20184)的三維結(jié)構(gòu)是已知的。纖維素酶在工業(yè)過程中有多種應(yīng)用，并已證明在以下用途中可商業(yè)應(yīng)用在紡織工業(yè)中用于牛仔布整理(denimfinishing)和棉花軟化；在家用和工業(yè)去污劑中用于色彩增亮、軟化和污漬去除；在紙漿和造紙工業(yè)中用于平滑纖維、增強排水和脫墨(de-inking);在食品工業(yè)中用于從水果和蔬菜中提取和澄清果汁，和用于糖化(mashing);在動物飼料工業(yè)中用于改善其營養(yǎng)品質(zhì)；以及用于將植物纖維轉(zhuǎn)化為葡萄糖，所述葡萄糖被發(fā)酵和蒸餾用于制造低co2纖維素乙醇，從而降低化石燃料消耗，這是世界范圍內(nèi)的一種新興工業(yè)(例如Gray,K.A.等.2006.Curr.Opin.Chem.Biol.10:141-146)。為了獲得具有提高的穩(wěn)定性特性的酶變體，在本領(lǐng)域中一般使用三種策略l)從生存于極端環(huán)境如極熱或極冷、高鹽濃度或高或低pH條件下的嗜極生物(extremophile)中分離嗜熱酶(例如美國專利No.5,677,151,美國專利申請No.20060053514);2)通過推理性i殳計或定點誘變進行蛋白質(zhì)工程，其使用本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性原理，依賴于蛋白質(zhì)家族內(nèi)的序列同一性和結(jié)構(gòu)比對來鑒定可能有益的突變(在Eijsink.V.G.等2004.J.Biotechnol.113:105-20.中綜述)；和3)定向進化，包括構(gòu)建突變體文庫并進行選擇或篩選以鑒定改進的變體，并包括反復(fù)循環(huán)產(chǎn)生具有期望特性的變體的過程(近期在EijsinkVG等.2005.Biomol.Eng.22:21-30中綜述)。這種方法不需要結(jié)構(gòu)或機理信息，并可揭示意外的有益突變。已證明將上述策略組合在一起是鑒定改進酶的有效方法(Chica.R.A.等.2005.Curr.Opin.Biotechnol.16:378-384)。使用推理性設(shè)計，Zhang等(ZhangS等，2000.Eur.J.Biochem.267:3101-15)使用兩個雙突變在TfCel6B的N端和C端環(huán)之間引入了新的二硫鍵，并選擇四個甘氨酸殘基突變來改進熱穩(wěn)定性。這些突變均未提高該纖維二糖水解酶的熱穩(wěn)定性，并且大部分突變將熱穩(wěn)定性降低5國10匸。讓人驚訝的是，雙突變N233C-D506C顯示r5()降低lO"C(ZhangS等，2000.Eur.J.Biochem.267:3101-15),或7^稍提高約2匸(Ai,Y.C.andWilson,D.B.2002.EnzymeMicrob.Technol.30:804-808)。Wohlfahrt(Wohlfahrt.G.等2003.Biochemistry.42:10095國10103V〉開了通過將羧基-羧酸對替換為酰胺-羧酸對而提高TrCel6A在堿性pH范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性。單突變體E107Q和三重突變體E107Q/D170N/D366N在pH7以上具有提高的rm，但是在野生型TrCel6A的最適pH——pH5下具有更低的2^。這些突變存在于N端和C端環(huán)中或其附近。Hughes等(Hughes.S.R.等2006.ProteomeSci.4:10-23)公開了一種定向進化策略，以在最后四個密碼子中具有定向變異的0r/w7i(柳j;cMPC-2纖維素酶F(OPC2Cel6F)突變克隆中篩選在較低pH下提高的活性，并鑒定了具有提高的熱穩(wěn)定性并在較低pH下具有提高的活性的兩種突變體。描述家族6纖維素酶推理性設(shè)計的上述報道提示，向C端環(huán)中引入氫鍵或二硫鍵不是提高最佳水解條件下熱穩(wěn)定性的良好策略。另外，通過用突變D241C/D249C引入二石充鍵來穩(wěn)定里氏木霉7家族纖維二糖水解酶Cel7A的外環(huán)(其形成活性位點通道的頂部)顯示對熱穩(wěn)定性沒有改進(vonOssowski.I.等.2003.J.Mol.Biol.333:817-829)。具有提高熱穩(wěn)定性的TrCel6A變體描述于美國專利公開No.20060205042中。使用結(jié)構(gòu)信息和建模程序，基于TrCel6A氨基酸序列與八個家族6成員序列的比對鑒定了突變。這種比對作為確定所謂的共有序列的基礎(chǔ)。選擇TrCel6A的3D-結(jié)構(gòu)模型匹配該結(jié)構(gòu)而無擾動并且很可能改進酶的熱穩(wěn)定性的突變作為用于改進TrCel6A熱穩(wěn)定性的替換。413位上絲氨酸到酪氨酸的突變(S413Y)包括在被鑒定為改進TrCel6A熱穩(wěn)定性的突變之中。該突變將在611C下預(yù)孵育1小時后保留的酶活性從母體TrCel6A的20-23%提高至TrCel6A-S413Y的39-43%;然而，在65X:預(yù)孵育1小時后，母體TrCel6A保留其活性的5-9%,而TrCel6A-S413Y保留其活性的6-8%。熔解溫度(或rm)提高了0.2-0.3°C,從母體TrCel6A的66.5。C提高至TrCel6A-S413Y的66.7-66.8。C。盡管在上文和相關(guān)的工業(yè)應(yīng)用中已知纖維素酶的機制和令人期望的屬性，但是開發(fā)具有提高的穩(wěn)定性、催化特性或者同時具有提高的穩(wěn)定性和催化特性的耐熱纖維素酶會是有利的。盡管可以在自然界中發(fā)現(xiàn)嗜熱和耐熱的酶，但是有成本效益地大規(guī)模生產(chǎn)這些酶中的困難限制了它們進入市場用于工業(yè)用途。因此，需要可以通過工業(yè)微生物如里氏木霉以高表達水平經(jīng)濟地生產(chǎn)的穩(wěn)定性提高的纖維素酶。發(fā)明概述本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的家族6纖維素酶。更具體地，本發(fā)明涉及顯示增強的熱穩(wěn)定性、嗜堿性和/或嗜熱性的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶。本發(fā)明還涉及包含編碼經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體，用于從宿主菌林中生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的方法，以及經(jīng)修飾的家族6纖維素酶在纖維素水解中的用途。提供具有提高的熱穩(wěn)定性、嗜熱性和嗜堿性的改進的纖維素酶是本發(fā)明的一個目的。本發(fā)明涉及通過用脯氨酸替換413位的氨基酸來生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族96纖維素酶的方法。氨基酸替換的位置通過所述經(jīng)修飾的纖維素酶與SEQIDNO:1中定義的里氏木霉Cel6A氨基酸序列的序列比對來確定。所述經(jīng)修飾的家族6纖維素酶與產(chǎn)生該家族6纖維素酶的母體家族6纖維素酶相比顯示出增強的熱穩(wěn)定性、嗜堿性、嗜熱性或其組合。所述經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可來自絲狀真菌，如里氏木霉。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述經(jīng)修飾的纖維素酶并不來自于413位(TrCel6A編號)上具有天然存在的脯氨酸殘基的纖維素酶，例如413位上含有脯氨酸殘基的天然家族6纖維素酶(來自O(shè)r/;/"o附j(luò);c"物種PC-2的CeIF)。本發(fā)明還包括這樣的經(jīng)修飾家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸殘基，并且還在選自231、305、410或其組合的位置上包含極性氨基酸。本發(fā)明還涉及這樣的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸，并且還在231位上包含選自絲氨酸或蘇氨酸的替換氨基酸。231位上的替換氨基酸可以是絲氨酸。本發(fā)明還涉及這樣的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸，并且還在305位上包含選自絲氨酸和蘇氨酸的替換氨基酸。本發(fā)明還涉及這樣的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸，并且還在410位上包含選自谷氨酰胺和天冬酰胺的替換氨基酸。本發(fā)明還包括這樣的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸殘基，并且還包括用絲氨酸殘基替換231和305位上的氨基酸(即231S、305S),并將410位氨基酸替換為谷氨酰胺。包含這些突變的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可來自絲狀真菌，例如里氏木霉。本發(fā)明還涉及這樣的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸殘基，并且相對于母體纖維素酶具有提高的熱穩(wěn)定性，通過"7^"來衡量，比相應(yīng)的母體纖維素酶高約5X:到約30"C，或高約9n到約20x:。本發(fā)明還涉及這樣的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸殘基，并且最高活性溫度(T。pt)比母體家族6纖維素酶的T一提高約1.5C到約30C，或高約2.5"C到約20"C。本發(fā)明還涉及這樣的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸殘基，并且其最高活性pH(pH。pt)相對于母體纖維素酶提高約0.5單位到約6.0單位。本發(fā)明還涉及選自下組的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶TrCel6A-S413P(SEQIDNO:12);TrCel6A-G82E-G231S畫固5S畫R410Q畫S413P(SEQIDNO:13);TrCel6A-G231S國S413P(SEQIDNO:14);TrCel6A-廳5S-S413P(SEQIDNO:15);TrCel6A國R410Q國S413P(SEQIDNO:16);TrCel6A隱G231S漏廳5S-S413P(SEQIDNO:17);TrCel6A-G231S-R410Q國S413P(SEQIDNO:18);TrCel6A-廳5S畫R410Q-S413P(SEQIDNO:19);TrCel6A-G231S-廳5S國R410Q國S413P(SEQIDNO:20);HiCel6A國Y420P(SEQIDNO:21);和PcCel6A-S407P(SEQIDNO:22)。本發(fā)明還涉及用于指導(dǎo)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶從宿主微生物中表達和分泌的遺傳構(gòu)建體，所述宿主微生物包括但不限于里氏木霉菌林。本發(fā)明還涉及包含下述DNA序列的遺傳構(gòu)建體，所述DNA序列編碼在413位上包含脯氨酸殘基的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，所述DNA序列與調(diào)節(jié)其從宿主微生物中表達和分泌的DNA序列有效連接。優(yōu)選地，調(diào)節(jié)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶表達和分泌的DNA序列來自用于表達該經(jīng)修飾的纖維素酶的宿主微生物。宿主微生物可以是酵母例如釀酒酵母CSflcc/mfo附j(luò);c"ce/rWsiV^)或者絲狀真菌如里氏木霉。本發(fā)明還涉及包含編碼經(jīng)修飾家族6纖維素酶之DNA序列的遺傳構(gòu)建體，所述經(jīng)修飾的家族6纖維素酶在413位上包含脯氨酸殘基，并且還包含用絲氨酸替換231和305位上的氨基酸以及用谷氨酰胺替換410位上的氨基酸。該DNA序列與調(diào)節(jié)其從宿主微生物中表達和分泌的DNA序列有效連接。優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶表達和分泌的DNA序列來自絲狀真菌，包括但不僅限于里氏木霉。本發(fā)明還涉及經(jīng)遺傳修飾的微生物，其能夠表達和分泌在413位上包含脯氨酸殘基的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，并且包含編碼經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的遺傳構(gòu)建體。在一個實施方案中，所述經(jīng)修飾的家族6纖維素酶還在231位和305位上包含絲氨酸殘基，并在410位上包含谷氨酰胺殘基。優(yōu)選地，所述經(jīng)遺傳修飾的微生物是酵母或絲狀真菌。所述經(jīng)遺傳修飾的微生物可以是酵母屬(5Vi"酞附j(luò);c^)、畢赤酵母屬C/c/r/fl)、漢遜酵母屬(jy"M5e""/fl)、木霉屬(THcAorfmw")、曲霉屬(^4s/7"g"/MS)、鐮孢菌屬CFwsfl"w挑)、腐質(zhì)霉屬Cffwiii/co/fl)、務(wù)么孢菌屬(7VeMms/^fl)或原毛平革菌屬(^P/ifl/imc/ifl^)的物種。本發(fā)明還涉及413位上包含脯氨酸殘基的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶用于處理纖維素底物的用途。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的方法，包括轉(zhuǎn)化酵母或真菌宿主，選擇表達所述經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的重組酵母或真菌菌林，并在誘導(dǎo)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶表達的條件下在深層液體發(fā)酵(submergedliquidfermentation)中培養(yǎng)所選擇的重組菌林。413位上包含脯氨酸殘基的本發(fā)明家族6纖維素酶相對于野生型家族6纖維素酶顯示出提高的熱穩(wěn)定性以及嗜熱性或嗜堿性。不希望受理論的束縳，經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的熱穩(wěn)定性提高是由于通過提高小ci-螺旋的穩(wěn)定性而穩(wěn)定家族6纖維二糖水解酶中C端環(huán)的氨基酸替換。這類纖維素酶可用于需要在高于天然酶的溫度和/或pH值下的酶穩(wěn)定性及活性的多種工業(yè)應(yīng)用中。例如，如本文所述的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可用于以下目的使木質(zhì)纖維原料糖化，以生產(chǎn)可發(fā)酵糖和燃料醇，改進飼料在反芻和非反芻動物中的可消化性，制紙漿和造紙，從牛仔布中釋放染料并使其軟化。本發(fā)明概述不一定描述了本發(fā)明的所有特征。從以下的描述可更加明確本發(fā)明的這些特征和其他特征，其中參考以下附圖，其中圖l顯示家族6纖維素酶之間的氨基酸序列比對。將各個纖維素酶的氨基酸編號與里氏木霉Cel6A(TrCel6A;SEQIDNO:l)的編號相比，如各序列左側(cè)和右側(cè)所指示的。213、305、410和413位(相對于TrCel6A)上的殘基用星號標(biāo)出。與TrCel6A中相應(yīng)氨基酸相同的殘基為黑體。對具有纖維素酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的纖維素酶而言，只展示了其催化核心序列。CfCel6B(SEQIDNO:2);HiCel6A(SEQIDNO:4);HiCel6B(SEQIDNO:ll);MtCel6A(SEQIDNO:9);NpCd6A(SEQIDNO:5);OpC2Cel6F(SEQIDNO:6);PE2Cel6A(SEQIDNO:8);TfCel6A(SEQIDNO:10);TfCel6B(SEQIDNO:3)。圖2描繪了質(zhì)粒載體a)YEp352/PGK91-lA7V/^I-xylss-cM2載體，b)YEpFLAGAf/mlO-cM2，其指^天然和經(jīng)修飾的TrCel6A從重組釀酒酵母中表達和分泌(如果發(fā)現(xiàn)針對克隆進相同載體的TrCel6變體則具有相同的結(jié)構(gòu))，c)YEpFLAGAA)9"l(KPcCWl",其指導(dǎo)天然和經(jīng)修飾的PcCel6A從重組釀酒酵母中表達和分泌(如果發(fā)現(xiàn)針對克隆進相同載體的PcCel6變體則具有相同的組織)，d)YEpFLAGA7T/mlO-/f/CW6J,其指導(dǎo)天然和經(jīng)修飾的HiCel6A從重組釀酒酵母中表達和分泌(如果發(fā)現(xiàn)針對克隆進相同載體的HiCel6變體則具有相同的組織)。圖3描述了用于轉(zhuǎn)化和指導(dǎo)經(jīng)修飾的TrCel6A從重組的里氏木霉中表達和分泌的載體pC/X-S413P-TV。如所示，TrCel6A-S413P基因與(TrCel7A)基因的啟動子、x/"2(TrXylllB)基因的分泌信號肽和天然cM2(TrCel6A)基因的轉(zhuǎn)錄終止子^"效連接。選擇標(biāo)記是粗糙鏈孢霉C/Ve"ns"r"基因。圖4顯示預(yù)孵育溫度對相對殘余活性(％)的影響，其通過在45X:和75匸之間的溫度下孵育15分鐘后在以下溫度下在30分鐘的測定中從p-葡聚糖釋放的還原糖來測量，a)65n，天然TrCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶TrCel6A畫S413P、TrCel6A國R410Q-S413P、TrCel6A畫G231S-N305S-S413P、TrCel6A-G231S-R410Q-S413P、TrCel6A畫N305S-R410Q-S413P和TrCel6A國G231S國N305S-R410Q-S413P;b)60"C,天然PcCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶PcCel6A-S407P;c)65。C,天然HiCel6A和經(jīng)<奮飾的家族6纖維素酶HiCel6A-Y420P。圖5顯示了增加預(yù)孵育時間對相對殘余活性(％)的影響，其通過30分鐘測定中從p-葡聚糖底物釋放的還原糖來測量，a)在601C下孵育0-120分鐘后，65n下天然TrCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶TrCel6A-S413P、TrCel6A醒R410Q畫S413P、TrCel6A-G231S-廳5S-S413P、TrCel6A國G231S畫R410Q國S413P、TrCel6A國N305S國R410Q誦S413P和TrCel6A-G231S-N305S國R410Q-S413P和b)在55"C孵育0-120分鐘后，601C下天然PcCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶PcCel6A-S407P。圖6顯示在pH5.0下孵育30分鐘期間溫度對酶活性的影響，a)天然TrCel6A和經(jīng){務(wù)飾的家族6纖維素酶TrCel6A-S413P、TrCel6A-G82E畫G231S-N305S-R410Q-S413P、TrCel6A國R410Q國S413P,TrCel6A國G231S-固5S-S413P、TrCel6A-G231S-R410Q-S413P、TrCel6A畫N305S國R410Q陽S413P和TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P、b)天然PcCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶PcCel6A-S407P和c)天然HiCel6A和經(jīng)l奮飾的家族6纖維素酶HiCel6A-Y420P的酶活性。將數(shù)據(jù)針對在對各酶的最適溫度下所觀察到的活性進行歸一化。圖7顯示在pH3.95-7.45下孵育30分鐘期間pH對酶活性的影響，a)天然TrCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素^TrCel6A-S413P、TrCel6A國G82E國G231S-廳5S畫R410Q畫S413P、TrCel6A畫R410Q畫S413P、TrCel6A國G231S國固5S畫S413P、TrCel6A-G231S-R410Q隱S413P、TrCel6A-N305S國R410Q畫S413P和TrCel6A畫G231S-N305S-R410Q-S413P、b)天然PcCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶PcCel6A-S407P和c)天然HiCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶HiCel6A-Y420P的酶活性。將數(shù)據(jù)針對各酶在最適pH下所)f見察到的活14性進行歸一化。圖8顯示50X:下在50mM檸檬酸鹽緩沖液pH5.0中不存在底物時預(yù)孵育0、4、20.5、28、40.5、52、68、76和96小時后，包含TrCel6A或TrCel6A-S413P(以及所有其余的天然里氏木霉纖維素酶組分)的完整木霉屬纖維素酶在經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素底物的酶促水解中的相對活性。優(yōu)選的實施方案描述本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的纖維素酶。更具體地，本發(fā)明涉及具有增強的熱穩(wěn)定性、嗜堿性和/或嗜熱性的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶。本發(fā)明還涉及包含編碼經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體，用于從宿主菌林中生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的方法，以及經(jīng)修飾的家族6纖維素酶在纖維素水解中的用途。以下的描述是一個優(yōu)選的實施方案，其僅用于舉例，而不限制實踐本發(fā)明所必需特征的組合。經(jīng)修飾的家族6纖維素酶家族6(先前稱作B家族)纖維素酶是通過倒轉(zhuǎn)化端基異構(gòu)碳的構(gòu)型來水解纖維素中p-l,4糖苷鍵的一組酶(Claeyssens,M.andHenrissat,B.1992，ProteinScience1:1293-1297)。家族6纖維素酶共享廣泛的氨基酸序列相似性(圖1)。如果一種纖維素酶包含其他家族6纖維素酶共有的氨基酸(包括可作為催化殘基的兩個天冬氨酸(D)殘基)，則其被分類為家族6纖維素酶。這些天冬氨酸殘基存在于175和221位(見圖1;基于TrCel6A(里氏木霉Cel6A酶)氨基酸編號)上。迄今為止鑒定的大部分家族6纖維素酶是嗜溫的。然而，該家族也包含來自褐色嗜熱裂孢菌的熱穩(wěn)定纖維素酶(TfCel6A和TfCel6B)和來自特異腐質(zhì)霉的嗜堿纖維素酶(HiCel6A和HiCel6B)。家族6催化結(jié)構(gòu)域的拓樸結(jié)構(gòu)是帶有中心|5桶的a/p桶，含有通過五個a螺旋連接的七條平行的p鏈。家族6纖維二糖水解酶與內(nèi)p-1,4-葡聚糖酶之間一個重要的差異是N端和C端環(huán)的長度，所述N端和C端環(huán)存在于活性位點兩側(cè)并且負(fù)責(zé)它們對纖維素的功能性作用。在纖維二糖水解酶中，廣闊的C端環(huán)與帶有活性位點的N端環(huán)形成通道。這賦予了纖維二糖水解酶攻擊結(jié)晶纖維素末端的獨特特性，其中N端和C端環(huán)將單個纖維素鏈保持在活性位點中，并有利于底物的連續(xù)降解。在內(nèi)切-P-l,4-葡聚糖酶中，C端環(huán)長度減少，N端環(huán)將其拉離活性位點，并且也可以更短，導(dǎo)致更開放的活性位點，允許接近纖維素的內(nèi)部P-l，4糖苷鍵進行水解。通過缺失CW份/o附wfls纖維二糖水解酶Cel6BC端環(huán)的十五個氨基酸來模擬內(nèi)切-P-l，4-葡聚糖酶的性質(zhì)，從而證實了這些環(huán)在6家族酶對纖維素的功能性作用中的功能(Meinke.A.等.1995.J.Biol.Chem.270:4383-4386)。該突變增強了酶對可溶纖維素(例如羧曱基纖維素)的內(nèi)切-p-l，4-葡聚糖酶活性，并改變了其對不溶性纖維素的纖維二糖水解酶活性。可按照本文列出的一般策略和方法修飾的家族6纖維素酶的非限制性實例在下表l中描述。表l:家族6纖維素酶<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>優(yōu)選的家族6纖維素酶的實例(其并非旨在限制)包括里氏木霉Cel6A、特異腐質(zhì)霉Cel6A、黃孢原毛平革菌(i^朋ewc/^e^c/r，os/70f7.M/if)Cel6A、糞月巴纖維單胞菌(CW/^附^m"s^附/)Cel6B、褐色嗜熱裂孢菌Cel6B。更優(yōu)選地，本發(fā)明的經(jīng)修飾纖維素酶包括經(jīng)修飾的里氏木霉Cel6A酶。"經(jīng)修飾的家族6纖維素酶"或"經(jīng)修飾的纖維素酶"指這樣的家族6纖維素酶，其中使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)將413位上的氨基酸(所述位置根據(jù)所述經(jīng)修飾纖維素酶與SEQIDNO:l中定義的里氏木霉Cel6A氨基酸序列之間的序列比對來確定)改變?yōu)楦彼?，并且所述酶顯示超過相應(yīng)未修飾家族6纖維素酶的熱穩(wěn)定性、嗜熱性、嗜堿性或其組合的改進。用于改變氨基酸序列的技術(shù)包括但不限于定點誘變、盒誘變、隨機誘變、合成寡核苷酸構(gòu)建、克隆和其他遺傳工程技術(shù)(EijsinkVG等.2005.Biomol.Eng.22:21-30，通過參考并入本文)。應(yīng)當(dāng)理解，經(jīng)修飾的纖維素酶可衍生自任何家族6纖維素酶。經(jīng)修飾的纖維素酶可衍生自野生型纖維素酶，或者衍生自已含有其他氨基酸替換的纖維素酵。就本發(fā)明目的而言，母體纖維素酶是這樣的纖維素酶，其原始氨基酸中413位上不含有脯氨酸替換(所述位置根據(jù)所述經(jīng)修飾纖維素酶與SEQIDNO:l中定義的里氏木霉Cel6A氨基酸序列的序列比對來確定)，并且在其他方面與該經(jīng)修飾的纖維素酶相同。因此，母體纖維素酶可以是這樣的纖維素酶，其在其他位置上含有通過遺傳工程或其他技術(shù)引入的氨基酸替換。然而，母體纖維素酶不包括其中413位上天然存在的氨基酸是脯氨酸的那些纖維素酶。"TrCel6A編號，，表示以TrCel6A的氨基酸序列(表l;圖1;SEQIDNO:l)為基礎(chǔ)，對應(yīng)于氨基酸位置的編號。如下文所公開并如圖1所示的，家族6纖維素酶顯示顯著的序列相似性程度。因此，通過將氨基酸比對以優(yōu)化纖維素酶之間的序列相似性和通過使用TrCel6A的氨基酸編號作為編號的基礎(chǔ)，可以相對于TrCel6A來確定其他纖維素酶中氨基酸的位置。酶的熱穩(wěn)定性可以通過其熔解溫度(meltingtemperature,rm)、在確定溫度下的半衰期(tm)和孵育確定的時間后喪失50%原始酶活性的溫度(rs。)來定義。與其嗜溫對應(yīng)物相比，嗜熱酶一般顯示被鑒定為對酶熱穩(wěn)定性的貢獻因子(contributingfactor)的共有結(jié)構(gòu)元件(參閱如Sadeghi，M.等.2006.Biophvs.Chem.119:256-270)。這些結(jié)構(gòu)元件包括更高的疏水性、更好的包裝(packing)、增加的極性表面積、環(huán)的缺失或減短、相互作用、更小并且更少量的空腔、(X螺旋穩(wěn)定性、芳族相互作用的提高、額外的二硫鍵或金屬結(jié)合位點和糖基化位點、降低的甘氨酸含量和提高的脯氨酸含量、增加的氫鍵和鹽橋、改善的靜電相互作用、減少的不耐熱殘基以及構(gòu)象應(yīng)變的釋放。就本發(fā)明的目的而言，如果纖維素酶具有與母體纖維素酶的rso相比至少高約4x:或至少高約9x:的r5Q，或例如纖維素酶具有與母體纖維素酶的rso相比高約41C到約30匸或其間任意量，或高約9匸到約30匸或其間任意量，則所述纖維素酶關(guān)于相應(yīng)的母體纖維素酶顯示提高的熱穩(wěn)定性。rso是所述經(jīng)修飾酶或天然酶在預(yù)孵育15分鐘后保留50%殘余活性的溫度，并可通過實施例10.4中詳述的測定法測定。如實施例10.4中所公開的，將65C下30分鐘測定中p-葡聚糖的殘余活性歸一化為100%。所述經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可具有這樣的r5Q，其比相應(yīng)母體纖維素酶的rs。高約4匸到約30r:或其間任何范圍，高約5t:到約20匸或其間任何范圍，高約8匸到約15n或其間任何范圍，或高約9C到約15匸或其間任何范圍。例如，所述經(jīng)修飾的纖維素酶可具有比相應(yīng)母體纖維素酶至少高約4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30n的r50。經(jīng)修飾的家族6纖維素酶也可以被表征為具有高于65"C(或比相應(yīng)母體家族6纖維素酶高至少5匸)的r5。，例如，經(jīng)修飾的纖維素酶可具有從約651C到約卯1C或其間任意量的r5Q。經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可具有高于70"C(或比母體家族6纖維素酶高至少9n)的r5。，例如經(jīng)修飾的纖維素酶可具有從約70x:到約卯ic或其間任意量的r5Q。家族6纖維素酶可具有50、55、60、65、70、75、80、85或90X:或其間任意量的r5Q。就本說明書的目的而言，如果纖維素酶顯示比相應(yīng)母體纖維素酶的最適溫度(T宇)至少高約1.5C的T。pt，則該纖維素酶相對于相應(yīng)母體纖維素酶顯示提高的嗜熱性。例如，如果纖維素酶顯示比相應(yīng)母體纖維素酶的T豐高約1.51C到約30t:或其間任意量的最適溫度(T。pt)，則該纖維素酶具有提高的嗜熱性。最適溫度或T。pt表示纖維素酶顯示其最高活性的最高溫度。就本說明書的目的而言，如實施例10.1中所詳述的，通過測量針對P-葡聚糖底物之活性的溫度曲線來測定家族6纖維素酶的T。pt。纖維素酶活性的溫度曲線在其最適pH下測量。經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可具有比相應(yīng)母體家族6纖維素酶的T。pt至少高約1.5n到約30匸的T。pt。在一個優(yōu)選的實施方案中，經(jīng)^務(wù)飾的家族6纖維素酶的T—比母體家族6纖維素酶的T豐至少高約2.5匸到約20*€。例如，經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可具有比相應(yīng)母體纖維素酶的T豐至少高約1.5、2.5、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0、25.0或30"C的Topt。術(shù)語"熱穩(wěn)定性"和"嗜熱性"在文獻中可相互交換使用。然而，本文所定義術(shù)語的使用是與本領(lǐng)域中這些術(shù)語的用法一致的(Mathrani，I和Ahring,B.K.1992Appl.Microbiol.Biotechnol.38:23-27)。就本發(fā)明的目的而言，如果纖維素酶顯示比母體纖維素酶的pHQpt至少高約0.5個單位的pH。pt，則該纖維素酶相對于相應(yīng)母體纖維素酶顯示提高的嗜堿性。pH。pt表示纖維素酶展示其最高活性的最高pH。就本說明書的目的而言，如實施例10.2中所公開的，通過測量家族6纖維素酶的pH曲線來測定pH。pt。經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可具有比母體家族6纖維素酶的pH—至少高約0.5單位到約6.0單位或其間任意量的pH。pt。在一個優(yōu)選的實施方案中，經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的pH。pt比母體家族6纖維素酶的pH。pt至少高約0.8單位到約5.0單位或其間任意量。例如，纖維素酶的pH。pt可比母體纖維素酶的pH叩t高約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0個單位。如本文進一步詳述的，已制備了顯示增強的熱穩(wěn)定性、嗜熱性、嗜堿性或其組合的若干突變體家族6纖維素酶。表2中展示了若干突變體的列表，這不應(yīng)以任何方式被認(rèn)為是限制性的。表2:經(jīng)修飾的家族6纖維素酶<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>包含經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的遺傳構(gòu)建體本發(fā)明還涉及遺傳構(gòu)建體，其包含編碼經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的DNA序列，所述DNA序列與指導(dǎo)該經(jīng)修飾的家族6纖維素酶從宿主微生物中表達和分泌的調(diào)節(jié)DNA序列有效連接。調(diào)節(jié)序列優(yōu)選地在真菌宿主中發(fā)揮功能。調(diào)節(jié)序列可來自在工業(yè)發(fā)酵條件下在宿主微生物中高度表達和分泌的基因。在一個優(yōu)選的實施方案中，調(diào)節(jié)序列來自任何一個或多個里氏木霉纖維素酶或半纖維素酶基因。如本領(lǐng)域所公知的，遺傳構(gòu)建體可進一步包含選擇標(biāo)記，使得能夠分離用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的經(jīng)遺傳修飾的微生物。選擇標(biāo)記可賦予宿主生物對抗生素的抗性或在缺乏特定營養(yǎng)素的培養(yǎng)基上生長的能力，否則所述宿主生物不能夠在這些條件下生長。本發(fā)明不受限于對選擇標(biāo)記的選擇，技術(shù)人員可容易地確定合適的標(biāo)記。在一個優(yōu)選的實施方案中，選擇標(biāo)記賦予對潮霉素、腐草霉素、卡那霉素、遺傳霉素或G418的抗性，補回宿主微生物在吵、tff*g、/e々、/yW、/>t2、"m3、w/yi5、A/s或基因之一中的缺陷，或賦予在乙酰胺作為唯一氮源時生長的能力。在一個更優(yōu)選的實施方案中，選擇標(biāo)記是編碼乳清苷-5，-脫羧酶的粗糙鏈孢霉/^W基因。包含經(jīng)修飾家族6纖維素酶的經(jīng)遺傳修飾的微生物經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可由經(jīng)遺傳修飾的微生物表達和分泌，所述經(jīng)遺傳修飾的微生物通過用編碼經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主微生物來產(chǎn)生。宿主微生物優(yōu)選是酵母或絲狀真菌，包括但不限于酵母屬、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬、木霉屬、肉座菌屬(gy/^c^a)、曲霉屬、鐮孢菌屬、腐質(zhì)霉屬、脈孢菌屬或原毛平革菌屬的物種。宿主微生物一般是其中編碼任何或所有家族6纖維素酶的基因都已被缺失的微生物。在一個最優(yōu)選的實施方案中，宿主微生物是里氏木霉的工業(yè)菌可通過任何微生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法將遺傳構(gòu)建體引入宿主微生物中，包括但不限于用CaCl2處理細(xì)胞、電穿孔、生物射彈、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合(例如White等，WO2005/093072，其通過參考并入本文)。在選擇了表達經(jīng)修飾家族6纖維素酶的重組真菌菌林后，可在誘導(dǎo)該經(jīng)修飾家族6纖維素酶表達的條件下在深層液體發(fā)酵中培養(yǎng)所選擇的重組菌抹。纖維素底物的水解本發(fā)明還涉及本文描述的經(jīng)修飾家族6纖維素酶用于水解纖維素底物的用途。術(shù)語"纖維素底物"表示來自植物生物量并包含纖維素的任何底物，包括但不限于用于生產(chǎn)乙醇或其他高價值產(chǎn)品的木質(zhì)纖維素(lignocellulosic)原料、動物飼料、林業(yè)廢物如紙漿和木片以及紡織品。術(shù)語"木質(zhì)纖維素原料"表示任何類型的植物生物量，例如但不限于非木本植物生物量；栽培作物，例如但不限于草，例如但不限于C4草,例如柳枝稷(switchgrass)、大米草(cordgrass)、黑麥草(ryegrass)、芒草(miscanthus)、草聲(reedcanarygrass)或其組合；糖加工殘余物，例如但不限于蔗渣、甜菜漿(beetpulp)或其組合；農(nóng)業(yè)殘余物，例如但不限于大豆稈、玉米稈、稻稈、稻殼、大麥稈、玉米芯、麥稈、蕓苔稈、燕麥稈、燕麥殼、玉米纖維或其組合；林業(yè)生物量，例如但不限于再循環(huán)的木漿纖維、鋸屑、硬木(例如白楊)、軟木或其組合。在用于生產(chǎn)乙醇或其他產(chǎn)品的木質(zhì)纖維素原料的糖化中，本發(fā)明的纖維素酶可用于水解經(jīng)預(yù)處理的原料，所述原料例如但不限于通過蒸汽暴破(steamexplosion)產(chǎn)生(見Foody,美國專利No.4,461,648，其通過參考并入本文，并指定讀者參考)。預(yù)處理可包括用蒸汽、酸、或通常用蒸汽和酸的組合來處理原料，從而當(dāng)纖維原料被轉(zhuǎn)化為漿狀的結(jié)構(gòu)時纖維素酶表面積大幅增加，期間幾乎沒有纖維素被轉(zhuǎn)化為葡萄糖。然后本發(fā)明的纖維素酶可被用于在后續(xù)步驟中將纖維素酶水解為葡萄糖。隨后葡萄糖可被轉(zhuǎn)化為乙醇或其他產(chǎn)品?？上蚰緷{或木片中添加本發(fā)明的經(jīng)修飾纖維素酶，以增強木漿的漂白或降低其精制(refining)能量。木漿可通過化學(xué)制漿過程或通過機械精制產(chǎn)生。提高家族6纖維素酶的熱穩(wěn)定性通過在不同的溫度下在無底物時預(yù)孵育酶來比較突變體家族6纖維素酶的熱穩(wěn)定性。15分鐘后，使用可溶性p-葡聚糖作為底物，通過標(biāo)準(zhǔn)測定法測定纖維素酶的殘余活性。通過對經(jīng)修飾的TrCel6A-S413P與母體TrCel6A進行比較研究，測定了S413P突變(單獨或與G231S、N305S和R410Q中一個或多個組合)對家族6纖維素酶熱穩(wěn)定性的影響。在更高的溫度下預(yù)處理高達120分鐘后，前者比后者保留更高的殘余活性(圖5a)。測定使家族6纖維素酶保留50%殘余活性的預(yù)處理溫度r5。。對經(jīng)修飾的家族6纖維素酶TrCel6A-S413P而言，75。為64.1匸，相比之下，母體TrCel6A為59^C(圖4a)。這代表通過引入S413P突變將熱穩(wěn)定性提高超過51C。其他TrCel6A變體的r5Q比野生型TrCel6A至少高3.2°C。PcCel6A-S407P和Hicel6A-Y420P與其各自的母體酶相比也顯示了r5。的提高(圖4b和c)。22提高家族6纖維素酶的嗜熱性通過測量測定溫度對p-葡聚糖水解的影響來測定經(jīng)修飾家族6纖維素酶的嗜熱性。與其各自野生型相比，所有經(jīng)修飾的家族6纖維素酶均顯示對j5-葡聚糖水解而言提高的T。pt，只有變體TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P例外，而在另一方面，該變體顯示在廣闊的溫度范圍內(nèi)具有高于80%的最大活性(圖6)。在所有的TrCel6A變體中，TrCel6A-S413P具有72.2。C的較高最適溫度，與野生型TrCel6A相比嗜熱性提高5.6°C(圖6a)。PcCel6A-S407P和HiCel6A-Y420P與其各自的野生型相比也顯示最適溫度的提高(圖6b和c)。提高家族6纖維素酶的嗜堿性還研究了S413P突變(單獨或與G231S、N305S和R410Q中的一個或多個組合)對家族6纖維素酶pH/活性曲線的影響。所有經(jīng)修飾的家族6纖維素酶與其野生型相比均顯示提高的嗜堿性。對TrCel6A而言，變體TrCel6A-G231S-R410Q-S413P，見察到顯著的遷移(+1.25pH單位)、然后是TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P(+1.01pH單位)。包含與非家族6纖維素酶組合的經(jīng)修飾家族6纖維素酶的纖維素酶系顯示提高的熱穩(wěn)定性。包含TrCel6A-S413P的木霉纖維素酶系在無底物時于50t:下孵育96小時后維持其最高活性的至少80%，而包含母體TrCel6A的相應(yīng)纖維素酶系僅維持其最高活性的50%(圖8)?？偠灾?，本發(fā)明改進的熱穩(wěn)定、嗜堿和/或嗜熱突變體家族6纖維素酶在413位上包含脯氨酸殘基，并可進一步包含一個或多個以下的氨基酸替換(i)231位上的替換氨基酸，如極性氨基酸，包括但不僅限于絲氨酸；(ii)305位上的替換氨基酸，如極性氨基酸，包括但不限于絲氨酸；23(iii)410位上的替換氨基酸，例如極性氨基酸，包括但不限于谷氨酰胺；和(iv)(i)到(iii)中所述的任何上述突變的組合。優(yōu)選的家族6纖維素酶突變體的非限制性實例在表2中給出，其包含與上文所列氨基酸替換組合的S413P。另夕卜，本發(fā)明的經(jīng)修飾家族6纖維素酶可包含與S413P組合的上文未列出的氨基酸替換。上文的描述不旨在以任何方式限制所要求保護的本發(fā)明。另外，對于本發(fā)明的方案而言，所討論的特征組合可能不是絕對必需的。實施例本發(fā)明將在以下的實施例中進一步闡述。然而，應(yīng)當(dāng)理解這些實施例僅用于闡述的目的，并且不應(yīng)被用于以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1描述了以下實施例中使用的菌林和載體。實施例2-5描述了TrCel6A基因的隨機誘變、將隨機誘變文庫克隆進酵母載體以及用于鑒定具有提高的熱穩(wěn)定性的經(jīng)修飾家族6纖維素酶的高通量篩選。實施例6-8描述了在替代酵母載體中克隆、重組和表達經(jīng)修飾的和天然的家族6纖維素酶基因用于更高表達。實施例9描述了經(jīng)修飾家族6纖維素酶的酶特征。實施例10描述了用于在絲狀真菌中表達和分泌經(jīng)修飾家族6纖維素酶的遺傳構(gòu)建體。實施例11描述了用表達經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化真菌原生質(zhì)體。實施例12描述了在深層液體培養(yǎng)中由經(jīng)修飾的微生物生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶。實施例13描述了對完整木霉纖維素酶(包含經(jīng)修飾的家族6纖維素酶與來自其他家族的纖維素酶的組合)的表征。實施例1:菌林和載體釀酒酵母菌林DBY747(Zi/s3-Al/ei/2畫3/ew2-112"ni3-52&/;1-289(琥珀型突變)g"/(s)CUP(r))得自ATCC。釀酒酵母菌林BJ35050^/4::HIS3/w^-A1.6RHIS3/"2誦208^pl畫A101wni3-52g/2c"wl)得自Sigma，并且是氨基端酵母FLAG表達試劑盒的一部分。本文所述的實驗中4吏用來源于RutC30(ATCC#56765;Montenecourt.B.andEveleigh.D.1979.Adv.Chem.Ser.181:289-301)的包含已破壞的天然TrCel6A基因的里氏木霉菌株。大腸桿菌(五scAccA/fl"/,〕菌林HB101(F-/isrfS20(rB-，mB)sii/7E44recA13flr-14/ewB6/;jyA2/"cY1gfl/K2，L20(strr)a^,-5附W-l)和DH5a(F^80/ctcZAM15A(/acZYA國"^F)U169z^cAle"rfAl/^汲17(r"mk+)/7/^A考E44由-1^A96m/A1X)得自Invitrogen。特異腐質(zhì)霉和黃孢原毛平革菌菌林得自ATCC⑧(分別為W2082TM和#201542TM)。YEp352/PGK91-l載體得自國立衛(wèi)生研究院。YEpFLAG-l載體作為氨基端酵母FLAG表達試劑盒的一部分得自Sigma。pALTER-l載體作為AlteredSiteII體外謙變系統(tǒng)的一部分得自Promega。pBluescriptIIKS國載體得自Stratagene。實施例2:將TrCel6A基因克隆進YEp352/PGK91-l中并轉(zhuǎn)化酵母2.1從里氏木霉中分離總RNA并產(chǎn)生總cDNA。在如實施例13中所述的誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)里氏木霉生物量，然后使用50mg生物量，用AbsolutelyRNA⑧小量制備試劑盒(Stratagene)根據(jù)制造商的方法提取總RNA。使用SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)根據(jù)制造商的方法從總RNA產(chǎn)生總cDNA。2.2克隆并轉(zhuǎn)化酵母為了便于使用7VAel和JT/ml限制性酶進行克隆，使用DNA聚合酶I大(Klenow)片段將YEp352/PGK91-l載體1936位上的單一7V/^I位點補平，得到Y(jié)Ep352/PGK91-lANhel。4吏用向編碼序列上游引入5^I-2V/iel位點和向下游引入f/mKB^II-5^1位點的引物C2STU5和C2STU3，通過PCR從總cDNA(如實施例2.1中所述產(chǎn)生)中擴增編碼TrCel6A的c6Zi2基因。平行地，使用向擴增子5'端引入5^H并在3，端引入7V/irf位點的引物，通過PCR從TrXylllB的基因組克隆(pXYN2K2，實施例11.3)中擴增TrXylllB基因的分泌信號肽，隨后使用這些限制性位點將其克隆進pBluescript⑧IIKS-(Stratagene)中，得到質(zhì)粒pXYNSS-Nhe。然后將該擴增子克隆進pXYNSS-Nhe中單一TV/^I和位點中。隨后使用引物(BGL2XYF和C2STU3))通過PCR從其中間構(gòu)建體中擴增片段，該片段包含與5，和3'端具有5g瓜位點的TrXylllB分泌信號肽有效連接的TrCel6A基因。將該擴增子克隆進YEp352/PGK91-lA7V/^1載體的丑g氾位點中，得到Y(jié)Ep352/PGK91-lAA7^I-xylss-cbh2載體(圖2a)，并使用Gietz,R.D.和Woods,R.A.(Gietz.R.D.和Woods,R.A.2002.Meth.Enzvm.350:87-96)所述方法轉(zhuǎn)化酵母菌林DBY747并涂板到SC-Ura平板上。引物序列如下贏IC2STU5:5'GATAGGCCTGCTAGCTGCTCAAGCGTCTGGGGC(SEQIDNO:24)C2STU3:5'ATCAGGCCTAGATCTGGTACCTTACAGGAACGATGG(SEqIDNO:25)BGL2XYF:5'GATCAGATCTATGGTCTCCTTCACCTCCCTC(SEQIDNO:26)SC-Ura平板含有組分g/L不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮源(BD)1.7(NH4)2S04(Sigma)不含尿苷的完全補充培養(yǎng)基(Clontech)瓊脂(BD)葡萄糖(Fisher)5.00.7717.020.0pH5.6實施例3:產(chǎn)生cM2的易錯PCR文庫4吏用兩種方法產(chǎn)生隨機i秀變文庫Mn2+/dITP方法和偏向(biased)核苷酸方法。對]\1112+/(101方法而言，使用上述C2STU3和BGL2XYF引物在兩步式PCR法中從YEp352/PGK91-lAA7^I-xylss-cbh2載體中擴增TrCel6A基因。在第一步中，擴增在20jiMMnCl2存在下進行20個循環(huán)。第二步用相同的引物進行，但是使用來自第一步的產(chǎn)物作為模板，并使用0、25、50、75或100nMdlTP(0fiM作為對照)。對偏向核苷酸方法而言，分別使用1:3、1:5或1:10摩爾比的噪呤堿基和嘧咬堿基進行PCR。為主要得到酶核心中的突變，使用A7^I和X/ml限制性位點將兩種情況下的最終擴增子克隆進YEp352/PGK91-lAA7ieI-xylss-cbh2載體(AT^I恰好在編碼酶連接子中S55密碼子的序列后切割)中并轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌林DBY747。實施例4:產(chǎn)生TrCel6A的定點半隨機文庫甘氨酸殘基不具有P-碳，因此具有顯著更大的主鏈構(gòu)象自由度。通過分析TrCel6A的三維結(jié)構(gòu)，靶向了4個甘氨酸殘基來降低該自由度，即G90、G85、G231和G384。將除G231以外的所有位置飽和，通過大引物PCR將G231隨機突變?yōu)楸彼?、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸，所述PCR使用以下引物CCAACAAAAGGGTTNNNTGAATACGTAGCGG(SEQIDNO:27)CCCAAGGAGTGACNNNAACAAAAGGGTTG(SEQIDNO:28)GGTGACCAACCTCNCNACTCCAAAGTGTG(SEQIDNO:29)CCGCAAACACTNNNGACTCGTTGCTG(SEQIDNO:30)將所有擴增子克隆在如實施例3中所述的YEp352/PGK91-lAiV/^I-xylss-cbh2載體中。實施例5:在TrCel6A基因文庫中篩選具有提高的熱穩(wěn)定性的經(jīng)修飾家族6纖維素酶如下篩選按照實施例3和4產(chǎn)生的總計3371個TrCel6A變體在G9。toXxx:G85toXxx:G231toA/P/S/T:G384toXxx:27Vortemp設(shè)備(Labnet)中，于650rpm和30匸下將每個酵母菌落在96-深孔平板的孔中培養(yǎng)2天，所述孔含有l(wèi)mLYPD(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)培養(yǎng)基和一個1.5mm玻璃珠。將平板以3,000xg離心5分鐘，然后使用Bio-Dot設(shè)備(Bio-Rad)將300jiL上清液各濾過兩張BiodyneB帶正電尼龍膜(PallGelman)。將膜置于含50mM檸檬酸鈉、pH4.8的潮濕(不滴水的)Whatman紙上。將一張在62匸下孵育12分鐘，另一張在室溫下孵育(對照)。然后將膜置于含P-葡聚糖底物的瓊脂平板上，并在潮濕培養(yǎng)箱中于50匸下孵育過夜組分g/L(NH4)2S04(Sigma)5.0(3-葡聚糖(Barley，MediumViscosity;Megazyme)2.0瓊脂(BD)17.0葡萄糖(Fisher)20.0pH5.6然后通過用0.1%(w/v)剛果紅溶液覆蓋瓊脂平板來染色30-60分鐘，然后用軟化水漂洗2-3次以去除未結(jié)合的染料，并用1MNaCl覆蓋10-15分鐘?？梢杂^察亮區(qū)，并在對照和用熱處理膜覆蓋的平板之間進行比較。每塊平板至少由兩個人仔細(xì)察看，與野生型TrCel6A對照相比，每個在62匸下孵育12分鐘后顯示維持其活性的陽性變體都被認(rèn)為可能是陽性的。在微量培養(yǎng)物中再次產(chǎn)生每個可能的陽性克隆，以允許在另外的情況下觀察表型并降低假陰性的可能性。將來自該篩選的五個陽性克隆測序，以鑒定其含有的突變。克隆E6含有S413P突變，克隆G3和F7均含有G231S突變，克隆A3含有N305S突變，克隆7含有連接肽末端的G82E突變以及R410Q突變。實施例6:將經(jīng)修飾的TrCel6A基因克隆進YEpFLAG-l載體中，以用于由釀酒酵母更高地表達為了便于將實施例5中鑒定的經(jīng)修飾TrCd6A基因克隆進YEpPLAG-l載體中從而將這些基因與a接合因子分泌信號肽有效連接，兩種修飾是必需的。首先，去除YEpFLAG-l載體的分泌信號肽序列(bp1457)中存在的單一f/;wl位點。這使用兩個互補的誘變引物(5'-FLAGAiT/ml和3'-FLAGA^/ml)通過PCR完成。然后用Z)/ml將誘變反應(yīng)物在37C下消化1小時，通過將管置于沸水中并允許其緩慢冷卻至室溫而使質(zhì)粒重新環(huán)化。將該反應(yīng)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。對僅用f/ml消化一次的克隆進行測序，以驗證想要的突變，將其用于進一步工作并命名為YEpFLAGA^/;"I。引物序列如下AATp"I5'孔AGAA:/j"I:5'ctaAAGAAGAAGGGGTACATTTGGATAAAAGAGAC(SEQIDNO:31)3'-FLAG崎"I:5'GTCTCTTTTATCCAAATGTACCCCTTCTTCTTTAG(SEQIDNO:32)其次，使用在擴增片段的5，端引入A7^I-7V/^I位點和在3'端引入7T/ml-y^fll位點的引物，通過PCR從pCOR132(實施例11.2)中擴增里氏木霉c6/fl基因。然后將該片段作為A7ioIM/;fll片段插入經(jīng)」V7^I厶4/ml線性化的YEpFLAG-l表達載體中。得到的載體YEpFLAGAI/;w10允許將實施例5中鑒定的經(jīng)修飾TrCel6A基因作為A7iel/X/ml片段插入，從而使編碼區(qū)與a分泌信號肽有效連接。使用從Hoffman和Winston(Hoffman,C.S.和Winston,F.1987.Gene57:267-272)的方法修改而來的方法，從酵母菌林DBY747的轉(zhuǎn)化體中分離含有天然或經(jīng)修飾的TrCel6A基因的YEp352/PGK91-lA7V/^I-xylss-cbh2載體，并將其轉(zhuǎn)化進大腸桿菌HB101化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中。通過用TV/^I和l/ml消化，從YEp352/PGK91-lA7V/ieI-xylss-cbh2載體中移出經(jīng)修飾的TrCel6A基因，并使用相同的限制性酶克隆進YEpFLAGAf/mlO中。使用Gietz和Woods(Gietz，R.D.和Woods,R.A.2002.Meth.Enzym.350:87-96)所述的方法將最終的構(gòu)建體YEpFLAGAf/7"10國cbh2、YEpFLAGA^/mlO-G82E畫R410Q、YEpFLAGA爭10-漏5S、YEpFLAGA爭10-S413P和YEpFLAGAJT/7"10-G231S(圖2b)轉(zhuǎn)化進酵母菌森BJ3505中，并在SC-trp平板上涂板。通過DNA序列分析來驗證所有變體的克隆區(qū)域的完整性。該酵母載體所產(chǎn)生的母體TrCel6A的氨基酸序列(SEQIDNO.23)顯示出含有FLAG肽的C端延伸。然而，通過實驗確定，該小肽延伸不以任何方式促進母體或經(jīng)修飾的TrCel6A纖維素酶的熱穩(wěn)定性、嗜熱性或嗜堿性。SC-trp平板含有組分g/L不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮源(BD)1.7(NH4)2S04(Sigma)5.0無色氨酸的酵母合成缺失培養(yǎng)基補充劑(YeastSynthetic1Drop國OutMediaSupplementwithoutTryptophan)(Sigma)瓊脂(BD)20葡萄糖(Fisher)20實施例7:產(chǎn)生其他TrCel6A變體PcCel6A、PcCel6A-S407P、HiCel6A和HiCel6A-Y420P并將其克隆進YEpFLAG-l載體中7.1產(chǎn)生其他TrCel6A變體。通過TrCel6A-S413P變體的易錯PCR獲得TrCel6A變體R410Q-S413P，使用MutazymeIIDNA聚合酶(Stratagene)克隆進YEp352/PGK91-lA7V/^1中。然后使用引物5'FLAG-Cel6A-GR和3'FLAG-Cel6A-GR將其從該來源中擴增，所述引物分別在7V/^I位點上游和J/7fll位點下游引入與YEpFLAG-l載體同源的序列。使用誘變引物與引物3'FLAG-Cel6A-GR的組合產(chǎn)生以下TrCel6A突變組合的大引物PCR:G231S曙S413P、謂5S-S413P、G231S畫畫5S畫S413P、G231S國R410Q-S413P、廳5S國R410Q畫S413P和G231S-N305S-R410Q-S413P。分離得到的PCR產(chǎn)物，并將其作為反向引物與正向引物5'FLAG-Cel6A-GR組合，產(chǎn)生最終的構(gòu)建體。引物序列如下5'G231SCBH25'GGTGACCAACCTCTCTACTCCAAAGTGTG(SEQIDNO:35)5'畫5SCBH25'CAATGTCGCCAGCTACAACGGG(SEQIDNO:36)5，Cel6A-E82G5'GTACCTCCAGTCGGATCGGGAACCGCT(SEQIDNO:38)5，F(xiàn)LAG-Cel6A-GR5'AGAGACTACAAGGATGACGATGACAAGGAATTCCTCGAGGCTAGCTGCTCAAGCG(SEQIDNO:39)3，F(xiàn)LAG-Cel6A-GR5，GACGGATCAGCGGCCGCTTACCGCGGGTCGACGGGCCCGGTACCTTACAGGAACG(SEQIDNO:40)7.2產(chǎn)生PcCel6A和PcCel6A-S407P。將凍干的黃孢原毛平革菌重懸于300nL無菌水中，并將50jiL涂布在PDA平板上。將平板在24匸孵育4天。用玻璃紙環(huán)(cell叩hanecircle)將黃孢原毛平革菌的孢子接種在PDA平板上，并在241C培養(yǎng)4-6天后收集生物量。然后使用50mg生物量，用AbsolutelyRNA⑧小量制備試劑盒(Stratagene)根據(jù)制造商的方法分離總RNA。使用SuperscriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)根據(jù)制造商的方法從總RNA產(chǎn)生總cDNA。使用以下的引物從cDNA中擴增編碼PcCel6A的基因5，PcCel6A-cDNA5'CTATTGCTAGCTCGGAGTGGGGACAGTGCGGTGGC(SEQIDNO:41)3，PcCel6A-cDNA5'CTATTGAATTCGGTACCCTACAGCGGCGGGTTGGCAGCAGAAAC(SEQIDNO:42)通過TA-克隆，根據(jù)制造商的建議將PCR擴增子克隆進pGEM⑧-TEasy載體中。然后使用引物5'FLAG-PcCel6A-GR和3，F(xiàn)LAG-PcCel6A-GR從該來源擴增編碼PcCel6A的基因，所述引物分別在7V/iel位點的上游和SWII位點的下游引入與YEpFLAG-1載體同源的序列。l吏用i秀變引物5TcCel6A-S407P與引物3'FLAG-PcCel6A-GR的31組合來產(chǎn)生大引物PCR。分離得到的PCR產(chǎn)物，并作為反向引物與正向引物5，F(xiàn)LAG-PcCel6A-GR組合，產(chǎn)生最終的構(gòu)建體。引物序列如下5，F(xiàn)LAG-PcCel6A-GR3，F(xiàn)LAG-PcCel6A-GR5'PcCel6A-S407P5'AAGGATGACGATGACAAGGAATTCCTCGAGGCTAGCTCGGAGTGGGGACAGTGC(SEQIDNO:43)5,TGGGACGCTCGACGGATCAGCGGCCGCTTACCGCGGCTACAGCGGCGGGTTGGC(SEQIDNO:44)5'CCCCGCTACGACCCTACTTGTTCTCTG(SEQIDNO:45)7.3產(chǎn)生HiCel6A和HiCel6A-Y420P。將凍干的特異腐質(zhì)酶重懸于300fiL無菌水中，并將50fiL涂布在EmersonYPSSpH7瓊脂平板(0.4%酵母提取物，0.1%K2HP04、0.05%MgS04'7H20、1.5%葡萄糖、1.5%瓊脂)上。將真菌在451C孵育6天，然后將孢子接種在Novo培養(yǎng)基(按照BarbesgaardUSP#4,435,307)中在100mL生長期培養(yǎng)基(2.4%CSL，2.4%葡萄糖，0.5%大豆油，pH調(diào)節(jié)至5.5，0.5%CaC03)中于37乙下孵育48小時，然后將6mL預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移進100mL生產(chǎn)期培養(yǎng)基(0.25%NH4N03、0.56%KH2P04、0.44%K2HP04、0.075%MgS04'7H20、2%Sigmacell，pH調(diào)節(jié)至7，0.25%CaCO3)，將培養(yǎng)物孵育多達4天之后收集生物量。然后使用50mg生物量，用AbsolutelyRNA⑧小量制備試劑盒(Stratagene)根據(jù)制造商的方法分離總RNA。使用SuperscriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)才艮據(jù)制造商的方法從總RNA產(chǎn)生總cDNA。使用以下的引物從cDNA中擴增編碼HiCel6A的基因5'HiCel6A-cDNA5'CTATTGCTAGCTGTGCCCCGACTTGGGGCCAGTGC(SEQIDNO:46)3，HiCel6A-cDNA5'CTATTGAATTCGGTACCTCAGAACGGCGGATTGGCATTACGAAG(SEQIDNO:47)通過TA-克隆，根據(jù)制造商的建議將PCR擴增子克隆進pGEM-TEasy載體中。然后使用引物5，F(xiàn)LAG-HiCel6A-GR和3'FLAG-HiCel6A-GR從該來源擴增編碼HiCel6A的基因，所述引物分別在7V/iel位點的上游和j/ml位點的下游引入與YEpFLAG-l載體同源的序列。使用誘變引物5，HiCel6A-Y420P與引物3'FLAG-HiCel6A-GR的組合來產(chǎn)生大引物PCR。分離得到的PCR產(chǎn)物，并作為反向引物與正向引物5，F(xiàn)LAG-HiCel6A-GR組合，產(chǎn)生最終的構(gòu)建體。引物序列如下5，F(xiàn)LAG-HiCel6A-GR5'AAGGATGACGATGACAAGGAATTCCTCGAGGCTAGCTGTGCCCCGACTTGGGGC(SEQIDNO:48)3'FLAG-HiCel6A-GR5'AGCGGCCGCTTACCGCGGGTCGACGGGCCCGGTACCTCAGAACGGCGGATTGGC(SEQIDNO:49)5，HiCe6A-Y420P5,GCCCGCTACGACCCTCACTGCGGTCTC(SEQIDNO:50)7.4將其它TrCel6A變體PcCel6A、PcCel6A-S407P、HiCel6A和HiCel6-Y420P克隆進YEpFLAG-l，并轉(zhuǎn)化BJ3505。用TV/^I和j/ml消化YEpFLAGMT/;"10載體(實施例6)，并分離空載體片段。克隆該線性片段和實施例8.1和8.3中產(chǎn)生的最終PCR產(chǎn)物，并通過體內(nèi)重組同時轉(zhuǎn)化(Butler,T.和Alcalde,M.2003.MethodsinMolecularBiology,第231巻(F.H.Arnold和G.Georgiou編輯)，HumanaPressInc.Totowa(NewJersey),17-22頁)。用7V/iel和&氾消化YEpFLAGA^/mlO載體(實施例6)并分離空載體片段?？寺≡摼€性片段和實施例8.2中產(chǎn)生的最終PCR產(chǎn)物，并通過體內(nèi)重組同時轉(zhuǎn)化。實施例8:在酵母中以中等規(guī)模表達天然和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶將含有YEpFLAG-AAp"10-cbh2的一個分離的BJ3505酵母菌落用于接種20mL試管中的5mL液體SC-trp。在30匸和250rpm過夜孵育后，測量600nm處的吸光度，并用最終OD6。。達到0.045所需的酵母量接種250mL錐形瓶中的50mLYPEM液體培養(yǎng)基。在301!和250rpm孵育72小時后，通過3,000xg離心5分鐘的步驟收集上清液。以同樣方式培養(yǎng)表達TrCel6A變體、野生型HiCel6A和變體、野生型PcCel6A和變體以及空YEpFLAG-l載體的BJ3505菌林。SC-trp液體培養(yǎng)基含有與實施例7中提到的SC-trp板相同的組分，但是不含瓊脂。YPEM液體培養(yǎng)基含有組分每升酵母提取物(BD)10g蛋白胨(BD)5.0g葡萄糖(Fisher)10g甘油(Fisher)30mL實施例9:表征來自酵母培養(yǎng)物上清液的經(jīng)修飾家族6纖維素酶9.1比較經(jīng)修飾的TrCel6A與天然TrCel6A的嗜熱性。通過測量不同的溫度下從可溶性P-葡聚糖底物中釋放的還原糖來測定每種酶的嗜熱性。具體地，在300fiLPCR板中，將根據(jù)實施例9獲得的50^L粗制上清液與預(yù)熱的50nL55mM檸檬酸鈉pH5.0中1%(w/v)j5國葡聚糖(Barley,MediumViscosity;Megazyme)在96孑LPCR板中不同的10列中混合。將混合物在成梯度的10個不同溫度(56。C、58.1。C、59.8。C、62.6°C、66。C、70。C、73.4。C、76.2。C、78.1"C和80"C)下孵育30分鐘，然后如下測量所釋放的還原糖向每孔中添加100nLDNS試劑并將平板在95C下孵育20分鐘。DNS試劑含有組分g/L3,5-二硝基水楊酸(Acros)10氫氧化鈉(Fisher)10苯酚(Sigma)2偏亞石克酸鈉(Fisher)0.5一旦溫度降低至低于40n，將135nL每種反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至96孔微孔板的各個孔中，每孔含有65jiLRochelle鹽(40%酒石酸鈉鉀)，并使用裝配有560nm濾光片的FluostarGalaxy微量培養(yǎng)板讀數(shù)器測量OD56。。通過用相同的方式處理來自帶有空載體的菌林的上清液來測量空白值，并從各數(shù)值中減去。然后針對每個變體將活性表述為相對于四參數(shù)多項式擬合最高值的百分比，只有變體TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P例外，針對其使用四參數(shù)對數(shù)正態(tài)擬合(圖6)。所有經(jīng)修飾的家族6纖維素酶與其各自的野生型相比均顯示提高的最適溫度，變體TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P例外，其顯示在寬泛的溫度范圍內(nèi)具有高于80。/。的最大活性(圖6)。在所有TrCel6A變體中，TrCel6A-S413P具有較高的最適溫度72.2°C,與野生型TrCel6A相比提高5.6X:(圖6a)。PcCel6A-S407P和HiCel6A-Y420P與其各自野生型相比時也顯示最適溫度的提高(圖6b和c)。9.2比較經(jīng)修飾TrCel6A與天然TrCel6A的嗜堿性。通過測量不同pH下從可溶性p-葡聚糖底物中釋放的還原糖來測定每種酶的嗜堿性。具體地，在300fiLPCR板中，將根據(jù)實施例9獲得的50nL粗制上清液與預(yù)熱的50jiL1%(w/v)55mM檸檬酸鈉中的卩-葡聚糖(Barley,MediumViscosity;Megazyme)、55mM褲酸鈉pH3.0、4.0、5.0、5.75、6.25、6.75、7.25或8.5^平板不同8列中混合(一旦與上清液混合并在60-65。C下加熱，pH分別為3.95、4.65、5.65、6.25、6.65、6.95、7.15和7.45)。將混合物在65〔(PcCel6A和變體為)下孵育30分鐘，然后根據(jù)實施例10.1測量所釋放的還原糖。通過用相同的方式處理來自帶有空載體的菌林的上清液來測量酵母宿主的背景活性，并從各變體的活性數(shù)值中減去該活性。然后針對每個變體將活性表述為相對于三參數(shù)機械擬合(mechanisticfit)最高值的百分比(圖7)。所有經(jīng)修飾的家族6纖維素酶與其野生型相比均時顯示提高的嗜堿性。對TrCel6A而言，用變體TrCel6A-G231S-R410Q-S413P觀察到顯著的遷移(+1.25pH單位)，然后是TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P(+1.01pH單位)。9.3比較經(jīng)修飾TrCel6A與天然TrCel6A的熱穩(wěn)定性。通過測量在60X:(對PcCel6A和變體為55"C)下將上清液預(yù)孵育不同時間后從可溶性p-葡聚糖底物釋放的還原糖來測定每種酶的熱穩(wěn)定性。具體地，在300nLPCR平板中，將根據(jù)實施例9獲得的50粗制上清液在60n(對PcCel6A和變體為55n)下孵育0、15、30、45、60、75、卯和120分鐘。然后添加50jiL55mM檸檬酸鈉pH5.0中的1%(w/v)p畫葡聚糖(Barley,MediumViscosity;Megazyme),并將混合物在651C(對PcCel6A和變體為60匸)下孵育30分鐘。然后根據(jù)實施例10.1測量釋放的還原糖。通過用相同的方式處理來自帶有空載體的菌株的上清液來測量酵母宿主的背景活性，并從各變體的活性數(shù)值中減去該活性。最后，針對每個變體將活性表述為相對于三參數(shù)單指數(shù)式衰減擬合(singleexponentialdecayfit)最高值的百分比(圖5)。所有TrCel6A變體與野生型TrCel6A相比均顯示提高的熱穩(wěn)定性(圖5a)。S413P突變導(dǎo)致TrCel6A的熱穩(wěn)定性顯著提高。在60匸下60分鐘后TrCel6A-S413P保留其活性的45%，而TrCel6A在60分鐘后僅保留其活性的4%。這代表了與美國專利公開No.2006/0205042中公開的TrCel6A-S413Y變體相比更大的熱穩(wěn)定性提高，該TrCel6A-S413Y變體在類似的條件下平均保留其活性的41%。TrCel6A-R410Q-S413P和TrCel6A國G231S-R410Q國S413P》見察到最高的提高，其在601C下60分鐘后分別保留其活性的58%和60%。與TrCel6A類似，PcCel6A-S407P在55X:下60分鐘后保留其活性的38%，而PcCel6A在60分鐘后僅保留其活性的6%(圖5b)。這些結(jié)果證明，與TrCel6A中413位殘基等同位置上的脯氨酸提高熱穩(wěn)定性。9.4比較經(jīng)修飾TrCel6A與天然TrCel6A的T50。7^在本文中定義為粗制酵母上清液在無底物孵育15分鐘后保留其p-葡聚糖水解活性之50%的溫度。其通過測量在不同的溫度下預(yù)孵育15分鐘后從可溶性p-葡聚糖底物釋放的還原糖來測定。具體地，在300nLPCR板中，將根據(jù)實施例9獲得的50粗制上清液在45。C、49.2。C、53.9。C、57.7。C、59.5。C、60.4。C、62.5。C、64.2。C、66.4'C、68.9。C、72.7"C或75"C孵育15分鐘。然后添加50jtL55mM檸檬酸鈉pH5.0中的1%(w/v)(5-葡聚糖(Barley,MediumViscosity;Megazyme)，并將36混合物在65"C(對PcCel6A和變體為60匸)下孵育30分鐘。然后才艮據(jù)實施例10.1測量釋放的還原糖。通過用相同的方式處理來自帶有空載體的菌林的上清液來測量酵母宿主的背景活性，并從各變體的活性數(shù)值中減去該活性。最后，針對每個變體將活性表述為相對于四參數(shù)S曲線擬合最高值的百分比(圖4)。TrCel6A-S413P的75()被測定為64.1。C，相比之下，母體TrCel6A為59'C(圖4a)。這代表通過引入S413P突變將熱穩(wěn)定性提高超過5"C。這代表與美國專利公開No.2006/0205042的S413Y突變相比酶穩(wěn)定性的顯著提高，所述專利公開顯示TrCel6A-S413Y的rm比TrCel6A只是稍微提高0.2-0.3X:。盡管美國專利公開No.2006/0205042中公開的測定T^的方法與本文公開的rs。測定法不同，但是兩種方法均試圖測定蛋白質(zhì)發(fā)生導(dǎo)致不可逆失活的顯著的和結(jié)構(gòu)上的改變的溫度。其它TrCel6A變體的rso比野生型TrCel6A至少高3.2X:。PcCel6A-S407P和Hicel6A-Y420P與其各自的母體酶相比也顯示150的提高(圖4b和c)。這也支持了家族6纖維素酶中TrCd6A413位殘基的等同位置上的脯氨酸提高熱穩(wěn)定性的主張。實施例10:制造包含經(jīng)修飾的家族6纖維素酶DNA序列的遺傳構(gòu)建體10.1分離里氏木霉基因組DNA并構(gòu)建里氏木霉基因組文庫使用下述包含已破壞的天然TrCel6A基因的來自RutC30的里氏木霉菌林(ATCC#56765;Montenecourt.B.和Eveleigh.D.1979.Adv.Chem.Ser.181:289-301)。RutC30來自里氏木霉Qm6A(ATCC#13631;Mandels.M.和Reese.E.T.1957.J.Bacteriol.73:269-278)。本領(lǐng)域技術(shù)人員十分了解，本文所述的方法、來自這些菌林的遺傳構(gòu)建體以及遺傳構(gòu)建體在這些菌林中的表達適用于所有來自Qm6A的木霉菌林。為了分離基因組DNA,用里氏木霉孢子接種50mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(Difco)，所述孢子通過無菌接種環(huán)從馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上收集。將培養(yǎng)物于28C下在200rpm搖動2-3天。將菌絲體過濾到GFA玻璃微纖維濾紙(Whatman)上并用冷的去離子水洗滌。將真菌餅冷凍在液氮中，用預(yù)冷的研缽和研杵碾成粉末；將0.5g粉碎的生物量重懸于5mL100mMTris、50mMEDTA，pH7.5加上1。/o十二烷基硫酸鈉(SDS)中。將裂解液離心(5000g20分鐘，41C)以沉淀細(xì)胞碎片。用l倍體積緩沖液(IOmMTris，1mMEDTA，pH8.0)飽和的苯酚萃取上清液，然后用1倍體積緩沖液飽和的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)萃取，從而去除可溶的蛋白質(zhì)。通過添加0.1倍體積的3M乙酸鈉，pH5.2和2.5倍體積的冷95。/。乙醇來沉淀DNA。在-20t:下孵育至少1小時后，通過離心沉淀DNA(5000g20分鐘，4"C)，用10mL70%乙醇沖洗，晾干并重懸于lmL10mMTris、1mMEDTA，pH8.0中。通過添加核糖核酸酶A(RocheDiagnostics)至0.1mg/mL的終濃度并在37C下賻育1小時來消化RNA。使用1倍體積緩沖液飽和的苯酚和1倍體積緩沖液飽和的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)先后萃取，從DNA溶液中去除核糖核酸酶。用0.1倍體積的3M乙酸鈉，pH5.2和2.5倍體積的冷95o/。乙醇再次沉淀DNA，離心沉淀，用70%乙醇沖洗，晾干并重懸于50nL10mMTris、1mMEDTA，pH8.0中。通過測量溶液在260nm下的吸光度來測定DNA的濃度(Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborPress1989中第CI頁，其通過參考并入本文，并在下文+稱作Sambrook等)。使用從里氏木霉菌林M2C38分離的基因組DNA構(gòu)建兩種質(zhì)粒文庫和一種噬菌體文庫。如下在載體pUC119(Viera和Messing,MethodsEnzymol.153:3,1987)中構(gòu)建質(zhì)粒文庫在37X:下用2單位/jig5"附H1或五coRl限制性酶將100nL體積中的10fig基因組DNA消化20小時。將經(jīng)消化的DNA在0.75%瓊脂糖凝膠上以0.04MTris-乙酸鹽、1mMEDTA電泳分離并用溴化乙錠染色。切下對應(yīng)于目的基因大小(基于公開的信息和Southern印跡)的凝膠片，并進行電洗脫以回收DNA片段(Sambrook等，6.28-6.29頁)。在含有20-50ng/mLDNA(以2:1的載體插入DNA比例)、1mMATP和5單位T4DNA連接酶的總體積10-15的連接反應(yīng)中，于4"C下16小時將這些富集的DNA級分連接進pUC119中，從而產(chǎn)生基因文庫。使用CellPoratorSystem(Gibco/BRL)，根據(jù)制造商的方案用連接反應(yīng)物對大腸桿菌菌林HB101進行電穿孔，并在含有70ng/mL氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。如下在載體入DASH(Stratagene，Inc.)中構(gòu)建噬菌體文庫用2、1、0.5和0.5單位/ng5"附HI將基因組DNA(3pg)在37"C消化1小時，產(chǎn)生大小9-23kB的片段。如下純化來自每次消化的DNA:用1倍體積的Tris飽和的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:l)萃取，然后用10fiL3M乙酸鈉，pH5.2和250pl95%乙醇(-20"€)沉淀。通過微量離心使經(jīng)消化的DNA沉淀，用0.5mL的冷70%乙醇沖洗，晾干并重懸于10jiL無菌的去離子水中。通過瓊脂糖凝膠電泳驗證大小為9-23kB的DNA片段的富集(0.04MTris-乙酸鹽，1mMEDTA中0.8%瓊脂糖)。將經(jīng)消化的DNA(0.4ng)與用5"附HI(Stratagene)預(yù)消化的1ngXDASH臂在含有2單位T4DNA連接酶和1mMATP的總體積為5pl的反應(yīng)中于4"C下連接過夜。使用GigaPackIIGold包裝提取物(Stratagene)根據(jù)制造商的方案將連接混合物包裝進噬菌體顆粒中。使用大腸桿菌宿主菌林XL1-BlueMRA(P2)滴定文庫，發(fā)現(xiàn)其含有3xl()S個獨立克隆。10.2從pUC119文庫中克隆纖維二糖水解酶I(cbhl)和纖維二糖水解酶II(cbh2)基因通過菌落轉(zhuǎn)移雜交(colonylifthybridization)鑒定帶有來自重組pUC119-丑fl附HI-五"RI文庫的cMJ或克隆的大腸桿菌HB101轉(zhuǎn)化體將l-3xl(^個菌落轉(zhuǎn)移至HyBondTM尼龍膜(Amersham)上；菌落面向上將膜置于用0.5MNaOH、1MNaCl飽和的印跡紙(VWR238)上5分鐘，以裂解細(xì)菌細(xì)胞并變性DNA;然后將膜菌落面向上置于用1.5MTris，pH7.5加1MNaCl飽和的印跡紙(VWR238)上5分鐘以進行中和；將膜晾干30分鐘，然后通過在80C烘烤2小時而將DNA固定在膜上。在含有10-50ng耙標(biāo)DNA和0.2mM每種d(GCT)TP、0.5jiMdATP、20-40jiCia-32P-dATP、10皮摩爾寡核苷酸引物和0.5單位Taq聚合酶的總體積20nL的標(biāo)記反應(yīng)中，對來自5flwHl或五"Rl片段富集庫中的cM7和cM2編碼區(qū)的短片段(0.7-1.5kB)進行PCR擴增，從而制備"P標(biāo)記的探針。對反應(yīng)物進行6-7個循環(huán)的擴增(95X:，2分鐘；56X:,1.5分鐘；70"C，5分鐘)。通過添加0.5mL10%(w/v)三氟乙酸和0.5mg酵母tRNA來沉淀擴增的32P標(biāo)記DNA。通過微量離心使DNA沉淀，用1mL70。/。乙醇洗滌兩次，晾干并重懸于1MTrispH7.5、1mMEDTA中。在熱封的袋子中，將固定有重組pUC119質(zhì)粒的尼龍膜于60-65。C下在1MNaCl、1%SDS、50mMTris、1mMEDTApH7.5中與100Hg/mL變性的斷裂鮭精DNA預(yù)雜交l小時。雜交在熱密封袋中在相同的緩沖液中于60-65X:下進行16-20小時，所述相同的緩沖液僅含有50fig/mL變性的斷裂鮭精DNA和5x106-5x107cpm變性的cM7或cM2探針。將膜用1MNaCl、0.5%SDS在60C下洗滌一次(15分鐘)，用0.3MNaCl、0.5%SDS在60"C下洗滌兩次(每次15分鐘)，并用0.03MNaCl、0.5%SDS在55X:下洗滌一次(15分鐘)。將膜再次置于熱封的袋子中，并在-70n下使KodakRPX射線膠片曝光16-48小時。根據(jù)制造商的方案將X-射線膠片顯影。挑出顯示強或弱信號的菌落，并在補充有70ng/mL氨卡青霉素的2XYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用堿裂解方法(Sambrook等.，1.25-1.28頁)從這些培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA，并通過限制性消化、Southern雜交(Sambrook等.，9.38-9.44頁)和PCR分析(Sambrook等.，14.18-14,19頁)來分牙斤。通過pUC119-丑"附Hl文庫與使用下述寡核苷酸引物制備的0.7kb探針之間的菌落轉(zhuǎn)移雜交來鑒定帶有cMJ基因的克隆，所述寡核苷酸引物被設(shè)計成擴增已公開的序列的bp597-1361(Shoemaker等，Bio/Technology1:691-696,1983;其通過參^"并入本文)。分離cMJ克隆pCOR132，該克隆含有對應(yīng)于啟動子(4.7kb)和1kb的cMJ結(jié)構(gòu)基因(2.3kb)的5.7kb5"柳H1片段。從其中將含有cMJ啟動子(2.1kb)和cM/編碼區(qū)5'末端(0.4kb)的2.5kb五coRl片段亞克隆進pUC119中，得到pCB152。通過pUC119-￡"Rl文庫與^^用下述寡核普酸引物制備的1.5kbcM2探針之間的菌落轉(zhuǎn)移雜交來鑒定帶有cM2基因的克隆，所述寡核苷酸引物被設(shè)計用于擴增已公開c6Zi2序列的bp580國2114(Chen等Bio/Technology5:274-278，1987)。分離含有4.8kbEcoRl片段的cM2克隆pZUK600，所述片段對應(yīng)于啟動子(600bp)、結(jié)構(gòu)基因(2.3kb)和終止子(1.9kb)。10.3從XDASH文庫中克隆木聚糖酶II(x/fi2)基因使用DIG標(biāo)記和檢測試劑盒(RocheDiagnostics)并按照制造商的方案，通過隨機引物標(biāo)記而從PCR擴增的x/"2基因編碼區(qū)中制備以地高辛-ll-dUTP標(biāo)記的探針。通過與3J)ASH文庫的噬斑轉(zhuǎn)移雜交來鑒定含有x/w2基因的基因組克隆。對每個目的基因而言，將lxl(^個克隆轉(zhuǎn)移至Nytran(SchleicherandSchull)尼龍膜。將膜噬斑面向上置于用0.5MNaOH、1MNaCl飽和的印跡紙(VWR238)上5分鐘，以裂解噬菌體顆粒并變性噬菌體DNA。然后通過將膜噬斑面向上置于用1.5MTris，pH7.5加1MNaCl飽和的印跡紙上5分鐘來進行中和，隨后將其晾干30分鐘。然后通過在80n烘烤2小時將DNA固定在膜上。在熱封袋中，將膜在6xSSPE、5xDenhardt，s、1%SDS中加上100ng/mL變性的斷裂鮭精DNA于65C下預(yù)雜交2小時。然后將膜在熱密封的袋中，在含有50jig/mL變性的斷裂鮭精DNA和0.5jig地高辛-dUTP標(biāo)記探針的相同溶液中，于65匸下雜交過夜。將膜在2xSSPE、0.1%SDS中于室溫下15分鐘洗滌兩次，在0.2xSSPE、0.1%SDS中于65X:下15分鐘洗滌兩次，并在2xSSPE中5分鐘洗滌一次。根據(jù)制造商的方案，通過與抗地高辛/堿性磷酸酶抗體綴合物、5-溴-4-氯-3-吲咮磷酸和4-硝基氯化四唑藍(RocheDiagnostics)反應(yīng)來鑒定陽性雜交克隆。通過用以地高辛-dUTP標(biāo)記的探針進行第二輪篩選來進一步純化陽性雜交克隆。如Sambrook等2.118-2.121頁中所述分離個體克隆并純化噬菌體DNA，只是將CsCl梯度步驟替換為用1倍體積的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)和1倍體積的氯仿:異戊醇(24:1)萃取。用0.1倍體積的3M乙酸鈉，pH5.2和2.5倍體積的冷95%乙醇沉淀DNA。用0.5mL冷70%乙醇洗滌已沉淀的噬菌體DNA，晾干并重懸于50nL10mMTris，1mMEDTApH8.0中。通過對純化的噬菌體DNA進行限制性消化和Southern印跡雜交(Sambrook等.，9.38-9.44頁)來鑒定含有目的基因的限制性片段，所述Southern印跡雜交使用與篩選XDASH文庫所用相同的以地高辛-dUTP標(biāo)記的探針。將膜雜交并通過與噬斑轉(zhuǎn)移中相同的方法使陽性雜交片段顯影。一旦鑒定了來自各個XDASH克隆的期望的限制性片段，則重復(fù)限制性消化，將片段在TAE中的0.8%瓊脂糖凝膠中分離并切下想要的條帶。使用SephaglasBandPrep試劑盒(Pharmacia)根據(jù)制造商的方案將DNA從凝膠片上洗脫。通過將XDASH文庫與探針進行菌落轉(zhuǎn)移雜交(實施例7)來鑒定帶有jc/"2基因的克隆，所述探針包含已公開jc/h2序列的bp100-783(Saarelainen等，Mol.Gen.Genet.241:497-503，1993)。通過對從XDASH克隆中純化的噬菌體DNA進行限制性消化來分離含有x/w2基因的啟動子(2.3kb)、編碼區(qū)(0.8kb)和終止子(2.6kb)的5.7kbjfiT/wI片段。將該片段亞克隆進pUC119的f/ml位點中，得到質(zhì)粒pXYN2K-2。10.4構(gòu)建指導(dǎo)經(jīng)修飾家族6纖維素酶在里氏木霉中表達的載體。使用特異性引物和pUC反向引物(目錄號18432-013,Gibco/BRL)，用戶m聚合酶從基因組亞克隆pXYN2K-2(實施例7)中擴增含有x/w2基因的啟動子和分泌信號的2.3kb片段(bp-2150到+99，其中+1表示ATG起始密碼子，+97-99代表TrXylll分泌信號肽之后的第一個密碼子)，所述x/"2特異性引物在密碼子33的Gln下游緊鄰處含有7V/^1，所述pUC反向引物與x/m2基因5'端的JT/ml位點下游退火。將該jc/"2PCR聲物作為平末端片段以下述方向插入pUC119多聚接頭(polylinker)的5Vwal位點中，其取向使得該多聚接頭的5fl附HI位點位于7V/^I位點的3，；這產(chǎn)生了質(zhì)粒pUC/XynPSS(Nhe)。通過用五coRl(其作為pUC119多聚接頭的一部分從pXYN2K-2中擴增)和丑"附HI消化，從pUC/XynPSS(7V/ie)中再分離相同的jc/"2PCR產(chǎn)物，并插入也用五"RI和5awHI消化的質(zhì)粒pBR322L(pBR322的衍生物，在bp565和650處的原始SpAl和5W1位點之間含有5^A1-A^1-5W1連接子(adaptor))中，得多j質(zhì)粒pBR322LXN。為了便于高水平表達經(jīng)修飾的木嚴(yán)糖酶，用通過歷"孤I消化pCOR132而分離的含有啟動子bp-1399到-204的1.2kbH,"^HI>段來代替pBR322LXN中含有jc/"2啟動子bp-1400到畫121的1.3kbH/"flfinA段；這產(chǎn)生質(zhì)粒pBR322LC/XN。最后，用Klenow將pBR322LXC的五coRl位點補平，并添加5^el接頭(目錄號1086，NewEnglandBiolabs)，得到pBR322SpXC。通過7V/iel和iT/ml消化從YEpFLAGAKpwlO-cbh2載體(在上文實施例6中描述)中分離含有TrCel6A-S413P基因的片段，并插入用TV/^I和5"附HI消化的pCB219N-N中，產(chǎn)生pS413P/C2ter。為了產(chǎn)生pCB219N-N,使用與已公開的cM2基因(Chen等，1987)3'非翻譯區(qū)bp2226-2242同源的引物以及pUC正向引物(目錄號1224，NewEnglandBiolabs)從pZUK600(上文實施例7中描述)中擴增cM2終止子片段，所述同源引物含有在5'末端包含A^al-7V/^KBfl附HI-5"挑flKfiT/ml位點的短多聚接頭，所述pUC正向引物在pZUK600中3'末端五"R1位點上游退火。將該片段在改造的AT^iI和￡"R1位點處消化，并插入pUC119的相應(yīng)位點中，產(chǎn)生pCB219。將五coRl-A^1連接子(目錄號35310-010，Gibco/BRL)插入pCB219中的單一五coRl位點中，產(chǎn)生pCB219N。通過用iV/^I和7VWI消化，從pS413P/C2ter中分離包含TrCel6A基因和cM2終止子的片段，并插入用TV/^I和7Vort消化的pBR322SpXC中，產(chǎn)生表達盒pc/xS413P-EC。含有選擇盒的質(zhì)粒pNCBglNSNB(r)來自含有粗糙鏈孢霉/;j^/的質(zhì)粒pFB6(Radford，A.，Buston，F(xiàn).P"Newbury,S.F.和Glazebrook,J.A.(1985)RegulationofpyrimidinemetabolisminNeurospora.InMolecularGeneticsofFilamentousFungi(Timberlake，W.E.編輯),AlanR，Liss(NewYork),127-143頁)。將來自pFB6的3.2kb5g/11片段克隆進被修飾為在多聚接頭中(五"RI和Sfld之間)含有A^I、Smal、A7iel和5gfll位點的pUC119的忍fl附HI位點中，得到pNCBgl-NSNB(r)，所述Bg/II片段含*粗糙鏈孢霉的pj;M基因(GenBank登錄號M13448)及其啟動子、終止子和一些5，UTR序列。從表達盒載體pc/xS413P-EC中分離Spel/JVort片段并插入用7V/iel(5^I和A7iel具有兼容的5'突出端序列)和7VWI消化的pNCBgl-NSNB(r)中，得到p7x-S413P-TV，所述Spel/Wort片段包含與啟動子、x/"2分泌信號肽和cM2轉(zhuǎn)錄終止子有效連接的TrCel6A-S413P基因。在轉(zhuǎn)化里氏木霉之前，用7VWl將該最終構(gòu)建體線性化。實施例11:轉(zhuǎn)化里氏木霉。11.1分離/y;"營養(yǎng)缺陷型為了使用粗糙鏈孢霉/y;"基因作為選擇標(biāo)記，如下分離自發(fā)的營養(yǎng)缺陷型將1x106個里氏木霉的孢子涂布在如前述的含5mM尿苷和0.15%(w/v)尿苷類似物5-氟乳清酸(FOA)的基本培養(yǎng)基上，用于選擇里氏木霉的/^"營養(yǎng)缺陷型(Berges.T.和Barreau.C.1991CurrGenet.19(5):359-65)。在含F(xiàn)OA的培養(yǎng)基上生長的能力會允許選擇在編碼乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的；^2基因或編碼乳清普5'-磷酸脫羧酶的/^W基因中發(fā)生破壞的突變體。對自發(fā)的FOA抗性菌落在含和不含尿苷的基本培養(yǎng)基上進行第二輪選擇。然后用pNCBglNSNB(r)(在實施例11.4中描述)轉(zhuǎn)化不能在基本培養(yǎng)基上生長的FOA抗性菌落的孢子，并針對在基本培養(yǎng)基上的生長進行選擇。只有被pNCBglNSNB(r)中的粗糙鏈孢霉/;f4基因補回的菌林會在基本培養(yǎng)基上生長，并且是真正的/7J"營養(yǎng)缺陷型。使用這些方法獲得了里氏木霉的穩(wěn)定/^W營養(yǎng)缺陷型。11.2轉(zhuǎn)化里氏木霉/y;W營養(yǎng)缺陷型的原生質(zhì)體。將5x106個里氏木霉的孢子涂布在補充有5mM尿苷的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上的無菌玻璃紙上，并在30"C孵育20小時以便于孢子萌發(fā)和菌絲體生長。將帶有菌絲體的玻璃紙盤轉(zhuǎn)移至10mL原生質(zhì)體化溶液中，該溶液在含0.6M硫酸銨的50mM磷酸氫二鉀緩沖液pH6.5(緩沖液P)中含有7.5g/L崩潰酶(Driselase)和125單位的無蛋白酶卩-葡聚糖酶(InterSpexProductsInc.,目錄號分別為0465-1和0410-3)。通過在60rpm搖動5小時消化菌絲體塾。通過以無菌No.30MIRACLOTHTM過濾將原生質(zhì)體與未消化的菌絲體分離，收集在無菌的50mL圓底離心管中并通過在室溫下1000-1500xg離心10分鐘回收。用5mL緩沖液P洗滌原生質(zhì)體，并在室溫下1000-1500xg再次離心IO分鐘。將原生質(zhì)體重懸于lmLSTC緩沖液(1.2M山梨醇、10mMCaCl2、10mMTris-HCL，pH7.5)中。為進行轉(zhuǎn)化，將0.1mL重懸的原生質(zhì)體與10jig載體DNA和25nLPEG溶液(25%PEG4000、50mMCaCl2、10mMTris-HCl,pH7.5)合并。在水水浴中孵育30分鐘后，添加1mLPEG溶液，并將混合物在室溫下孵育5分鐘。用2mLPEG溶液中1.2M山梨醇稀釋轉(zhuǎn)化混合物，將整個混合物添加進冷卻至約47IC的25mL熔化的MMSS瓊脂培養(yǎng)基(見下文)，并將原生質(zhì)體懸液倒在MMSS瓊脂上。將平板在30C孵育直到菌落生長可見。將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移至含有MM瓊脂的個體平板并允許孢子形成。收集孢子并以高稀釋度涂布在MM瓊脂上，以分離同核體轉(zhuǎn)化體，然后將同核體轉(zhuǎn)化體涂布在PDA上，允許其生長并充分形成孢子，以如下文實施例13中所述接種篩選培養(yǎng)物?；九囵B(yǎng)基(MM)瓊脂含有以下組分試劑每LKH2P0410g(NH4)2S046g檸檬酸鈉'211203gFeS04.7H205mgMnS04.H20.6mgZnS047H201.4mgCaCl2.2H202mg瓊脂20g20。/。葡萄糖f,s.50mL1MMgS04'7H20f.s.4mLpH調(diào)節(jié)至5.5MMSS瓊脂含有與MM瓊脂相同的組分，再加上1.2M山梨醇、1g/LYNB(來自DIFCO目錄號291940的無氨基酸的酵母氮源)和0.12g/L氨基酸(來自BDBiosciences目錄號630416的-UraDO補充劑)。實施例12:在液體培養(yǎng)物中生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶將木霉的個體菌落轉(zhuǎn)移至PDA平板用于擴增每種培養(yǎng)物。孢子形成對于均勻接種微量培養(yǎng)物是必需的，所述微量培養(yǎng)物用于測試培養(yǎng)物產(chǎn)生具有提高的熱穩(wěn)定性的經(jīng)修飾TrCelA變體的能力。培養(yǎng)基由以下組成組分g/L412.7KH2P048.00MgS04'7H204.00CaCl22H201.02玉米浸出液5,00CaC0320.00碳源**30-35微量元素*2mL/L*微量元素溶液含有5g/LFeS04.7H20;1.6g/LMnS04H20;1.4g/LZnS04.7H20。**葡萄糖、Solkafloc、乳糖、纖維二糖、槐糖、玉米糖漿或Avicel。碳源可作為水溶液在pH2到7下獨立滅菌，并在最開始時添加到其余的培養(yǎng)基中，或在發(fā)酵過程中添加。將個體轉(zhuǎn)化體在上述培養(yǎng)基中于24孔微孔板中的1mL培養(yǎng)物中培養(yǎng)。初始pH為5.5，并在接種前將培養(yǎng)基于121X:下蒸汽高壓滅菌30分鐘。對天然的和經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，都從PDA平板中分離孢子，懸浮于水中，并將每mL104-105個孢子用于接種每份培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物在30"C的溫度下于500rpm搖動6天時間。通過在12,000rpm離心，從含有所分泌蛋白質(zhì)的濾液中分離生物量。使用Bio-Rad蛋白質(zhì)測定法(目錄號500-0001)測定蛋白質(zhì)濃度。如實施例14中所述測定TrCelA-S413P的表達。實施例13:表征包含經(jīng)修飾家族6纖維素酶的里氏木霉培養(yǎng)物濾液通過SDS-PAGE凝膠的Western印跡雜交來測定里氏木霉轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)濾液中的TrCel6A-S413P表達。具體地，將來自TrCel6A-S413P轉(zhuǎn)化體、母體菌株P(guān)107B和表達天然的未修飾TrCel6A的菌林(菌林BTR213)的10-20nL培養(yǎng)物濾液中等量的總分泌蛋白質(zhì)加入等體積的2xLaemmli緩沖液(0.4gSDS/2mL甘油/1mL1MTris-HCl,pH6.8/0.3085gDTT/2mL0.5%溴酚藍/0.25mL卩-巰基乙醇/10mL總體積)中。在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離10nL每種制備的樣品，使用24mMTris、192mM甘氨酸pH6.8、10mMSDS作為電泳緩沖液。在含20%曱醇的25mMTris/192mM甘氨酸緩沖液中，將分離的蛋白質(zhì)從丙烯酰胺凝膠上電轉(zhuǎn)移至用曱醇預(yù)濕潤的PVDF膜上。隨后在30mLBLOTTO緩沖液(50mMTris-HCl，pH8.0中5%脫脂乳粉)中洗滌膜。用30mLTrCel6A特異性多克隆抗體的1:20,000稀釋液在BLOTTO中室溫過夜標(biāo)記該膜，在室溫下用等體積的BLOTTO再洗滌兩次，每次10分鐘，然后在室溫下用山羊抗兔/堿性磷酸酶綴合物的1:3000稀釋液在BLOTTO中標(biāo)記1小時。最后，將該膜在室溫下用過量的50mMTris-HCl,pH8.0洗滌兩次，每次15分鐘。如下使含有TrCel6A的雜交復(fù)合物顯影室溫下用10mL含有45fil4-硝基氯化四唑藍(RocheDiagnostics)和35fiL5畫溴國4畫氯畫3-P引咮磷酸(RocheDiagnostics)的100mMNaCl/100niMTris-HCl，pH9.5緩沖液處理膜，直到條帶清晰可見。在來自多數(shù)轉(zhuǎn)化體、陽性對照菌林BTR213的培養(yǎng)物上清液中觀察到60kDa的陽性雜交條帶，但是來自菌林P107B的培養(yǎng)物上清液中則沒有。轉(zhuǎn)化體P474B表達和分泌了與對照菌林BTR213所表達和分泌的未經(jīng)修飾TrCel6A量大致相同水平的TrCel6A-S413P。如下評價含有TrCel6A或TrCel6A-S413P的木霉纖維素酶的穩(wěn)定性將纖維素酶在50mM檸檬酸鹽緩沖液，pH4.8中于50。C下孵育多達96小時，然后通過濁度法測量纖維素酶的殘余活性(Enari.T.M.和Niku畫Paavola.ML.1988.Meth.Enzym.160:117-126)。盡管未處理的TrCel6A和TrCe16A-S413P纖維素酶的纖維素水解速率是相同的，但是在無底物條件下孵育多達96小時后，TrCel6A-S413P纖維素酶比TrCel6A纖維素酶維持高得多的活性(圖8)。因此，TrCel6A熱穩(wěn)定性的提高也提高了包含經(jīng)修飾家族6纖維素酶和其它組分的整體木霉纖維素酶系的熱穩(wěn)定性。已通過優(yōu)選的實施方案描述了本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，可進行大量變更和修改，而不偏離本文所述本發(fā)明的范圍。所有的參考文獻和引用內(nèi)容均通過參考并入本文。參考文獻Ai，Y.C.andWilson,D.B.2002.EnzymeMicrob.Technol.30:804-808.Atomi,H.2005.Curr.Opin.Chem.Biol.9:166-173.Berges,T.andBa訂eau，C.1991CurrGenet.19(5):359-65Bhat,M.K.2000.Biotechnol.Adv.18:355-383.Butler,T.andAlcalde,M.2003.InMethodsinMolecularBiology,vol.231:(F，H.ArnoldandG.Georgiou,editors),HumanaPressInc.Totowa(NewJersey),pages17-22.Chica，R.A,etal.2005.Curr.Opin.Biotechnol.16:378-384.Claeyssens,M.andHenrissat,B.1992，ProteinScience1:1293-1297).Claeyssens,M.,etal.1997.Eds.;TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge.Davies,G丄，etal.2000.Biochem.J.348:201-207.Eijsink,V.G.,etal.2004.JBiotechnol.113:105-20.EijsinkVG，etal.2005.Biomol.Eng.22:21-30.Foreman,P.K.，etal.2003.J.Biol.Chem.278:31988-31997.Gietz，R.D.andWoods,R.A.2002.Meth,Enzym.350:87-96.Gray,K.A.,etal.2006.Curr.Opin.Chem.Biol.10:141-146.Hoffinan，C.S.,andWinston,F.1987.Gene57:267-272.Hughes,S.R.，etal.2006.ProteomeSci.4:10-23.Lehtio,J.，etal.2003.ProcNatlAcadSciUSA.100:484-489.Li,W.F.，etal.2005Biotechnol.Adv.23:271-281.Lin，Y.andTanaka，S.2006.Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642.Mathrani,IandAhring，B.K.1992Appl.Microbiol.Biotechnol.38:23-27.Meinke，A.,etal.1995.J.Biol.Chem.270:4383-4386.Radford,A,，etal.1985.InMolecularGeneticsofFilamentousFungi(Timberlake,W.E.，editor),AlanR.Liss(NewYork),pages127-143Rouvinen,J"etal.19%.Science249:380-386.Erratumin:Science1990249:1359.Saarelainen，R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