專(zhuān)利名稱(chēng)：血樣的測(cè)定方法及測(cè)定裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血樣的測(cè)定方法及測(cè)定裝置，該血樣的測(cè)定方法及測(cè)定裝置可以將幼稚白細(xì)胞特別是骨髓原始細(xì)胞與其他血細(xì)胞精確地區(qū)分開(kāi)并計(jì)數(shù)。
背景技術(shù)：
血液的細(xì)胞成份大致分為血小板、白細(xì)胞和紅細(xì)胞，白細(xì)胞又分為粒細(xì)胞(嗜酸性細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞)、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。這些細(xì)胞在骨髓中生成，從未成熟細(xì)胞分化、成熟，移動(dòng)到末梢血液。正常健康人末梢血中不會(huì)出現(xiàn)未發(fā)育成粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等正常血液中白細(xì)胞(以下有時(shí)稱(chēng)這些細(xì)胞為“成熟白細(xì)胞”)的未成熟白細(xì)胞(幼稚白細(xì)胞)，但是白血病、癌細(xì)胞骨髓轉(zhuǎn)移和重癥感染病患者的末梢血中會(huì)出現(xiàn)骨髓原始細(xì)胞等幼稚白細(xì)胞。特別是檢出骨髓原始細(xì)胞對(duì)于診斷所述的疾病很重要。
臨床檢查、健康診斷等時(shí)常采用的血液自動(dòng)測(cè)定方法有應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)的測(cè)定方法。流式細(xì)胞技術(shù)將細(xì)胞膜和核等經(jīng)熒光染色的試樣放入流動(dòng)室，向通過(guò)流動(dòng)室的細(xì)胞照射色素的勵(lì)起光，獲取關(guān)于從通過(guò)流動(dòng)室的各個(gè)細(xì)胞發(fā)出的散射光和熒光的有關(guān)信息，根據(jù)這些信息測(cè)定細(xì)胞的種類(lèi)和個(gè)數(shù)等。
在應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)的血樣測(cè)定方法中，提供了各種方法來(lái)區(qū)別于其他血液細(xì)胞檢測(cè)血液中所含血細(xì)胞特別是血細(xì)胞類(lèi)疾病時(shí)出現(xiàn)的幼稚白細(xì)胞和變形血細(xì)胞等。
比如，根據(jù)WO2004/001408所述技術(shù)，血液中的血細(xì)胞按以下(1)～(3)步驟分類(lèi)。(1)先在以前向散射光峰值和前向散射光幅度為二軸的二維散點(diǎn)圖中將血小板凝集與白細(xì)胞和紅細(xì)胞血影區(qū)別開(kāi)。(2)再將在(1)中識(shí)別出的白細(xì)胞和紅細(xì)胞血影在以前向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度為二軸的二維散點(diǎn)圖展開(kāi)，區(qū)分白細(xì)胞和紅細(xì)胞血影。(3)再將在(2)區(qū)分出來(lái)的白細(xì)胞以熒光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度為二軸的二維散點(diǎn)圖展開(kāi)，將白細(xì)胞細(xì)分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、骨髓原始細(xì)胞和幼稚粒細(xì)胞。
然而，根據(jù)WO2004/001408所述技術(shù)，雖然在所述的(3)中可以對(duì)骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)，但如果測(cè)定含少量血小板凝集的試樣，則血小板凝集在(1)步驟中可能出現(xiàn)在白細(xì)胞和紅細(xì)胞血影的區(qū)域，在(3)中可能出現(xiàn)在骨髓原始細(xì)胞區(qū)域。因此，人們希望開(kāi)發(fā)出更精確測(cè)定骨髓原始細(xì)胞的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的范圍只由后附權(quán)利要求書(shū)所規(guī)定，在任何程度上都不受這一節(jié)發(fā)明內(nèi)容的陳述所限。
本發(fā)明是基于以上情況所開(kāi)發(fā)的技術(shù)，其目的是提供一種測(cè)定裝置和測(cè)定方法，它能夠在應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)的血樣測(cè)定中，不受以血小板凝集為首的試樣中的其他成份的影響，更準(zhǔn)確地分類(lèi)、計(jì)數(shù)骨髓原始細(xì)胞。
本發(fā)明的發(fā)明者們找出了將骨髓原始細(xì)胞與其他血細(xì)胞區(qū)分測(cè)定的方法，完成了本發(fā)明。即，破損血樣中成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜，使其比幼稚白細(xì)胞更強(qiáng)烈地染色，然后將其放入流式細(xì)胞儀檢測(cè)，根據(jù)所得角度不同的二種散射光信息和熒光信息，根據(jù)所述的二種散射光信息，特定含骨髓原始細(xì)胞的細(xì)胞群，以排除血小板凝集，再根據(jù)一種散射光信息和熒光信息特定含骨髓原始細(xì)胞細(xì)胞群，以進(jìn)一步區(qū)分成熟白細(xì)胞。
即，本發(fā)明的血樣測(cè)定方法當(dāng)中，第一個(gè)測(cè)定方法包括以下步驟試樣處理步驟，破損血樣中所含紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜，收縮細(xì)胞膜受損的血細(xì)胞，用能對(duì)核酸染色的熒光色素進(jìn)行染色處理；信息獲取步驟，用光束照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、來(lái)源于角度與第一散射光不同的散射光的第二散射光信息及熒光信息；第一特定步驟，根據(jù)所述的第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群；第二特定步驟，根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的熒光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群；以及計(jì)數(shù)步驟，對(duì)既含在所述的第1細(xì)胞群又含在所述的第2細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
在所述的計(jì)數(shù)步驟中，也可以將所述的既含在第1細(xì)胞群又含在第2細(xì)胞群的細(xì)胞在以所述的熒光信息和所述的第二散射光信息為二軸的散點(diǎn)圖中展開(kāi)，對(duì)出現(xiàn)在所述的散點(diǎn)圖的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
所述的第一測(cè)定方法中的第二特定步驟也可以根據(jù)所述的第1細(xì)胞群的第一散射光信息和熒光信息，從所述的第1細(xì)胞群中特定第2細(xì)胞群?；蛘咚龅牡谝粶y(cè)定方法中的所述的第一特定步驟也可以根據(jù)所述的第2細(xì)胞群的第一散射光信息和熒光信息從所述的第2細(xì)胞群中特定第1細(xì)胞群(第二測(cè)定方法)。
在所述的第一和第二測(cè)定方法中，最好所述的第一特定步驟在以所述的第一散射光信息和所述的第二散射光信息為二軸的第一散點(diǎn)圖中劃定骨髓原始細(xì)胞出現(xiàn)候補(bǔ)區(qū)域，將出現(xiàn)在所述的候補(bǔ)區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞群特定為所述的第1細(xì)胞群；所述的第二特定步驟則在以所述的第一散射光信息和所述的熒光信息為二軸的第二散點(diǎn)圖中劃定骨髓原始細(xì)胞出現(xiàn)候補(bǔ)區(qū)域，將出現(xiàn)在所述的候補(bǔ)區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞群特定為所述的第2細(xì)胞群。
本發(fā)明的血樣測(cè)定方法也可以第一特定步驟和第二特定步驟同時(shí)進(jìn)行。即，第三測(cè)定方法包括以下步驟試樣處理步驟，破損血樣中所含紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜，收縮細(xì)胞膜受損的血細(xì)胞，用能夠染色核酸的熒光色素進(jìn)行染色處理；信息獲取步驟，用所述的熒光色素的勵(lì)起光照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、角度不同于第一散射光的第二散射光信息和熒光信息；特定步驟，根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群，同時(shí)根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的熒光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群；以及計(jì)數(shù)步驟，將既存在于所述的第1細(xì)胞群又存在于所述的第2細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
本發(fā)明的血樣測(cè)定方法的第四測(cè)定方法適用于非特定含有骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群、取而代之特定含全白細(xì)胞的第3細(xì)胞群作為根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的熒光信息特定的細(xì)胞群的情況。即，第四測(cè)定方法包括試樣處理步驟，破損血樣中所含紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜，收縮細(xì)胞膜受損的血細(xì)胞，用能夠染色核酸的熒光色素進(jìn)行染色處理；信息獲取步驟，用所述的熒光色素的勵(lì)起光照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、角度不同于第一散射光的第二散射光信息和熒光信息；第一特定步驟，根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群；第三特定步驟，根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的熒光信息特定血影群以外的細(xì)胞群作為第3細(xì)胞群；第四特定步驟，根據(jù)所述的第3細(xì)胞群的第二散射光信息和熒光信息，從所述的第3細(xì)胞群中特定至少實(shí)際上不含成熟白細(xì)胞的第4細(xì)胞群；以及計(jì)數(shù)步驟，對(duì)既存在于所述的第1細(xì)胞群又存在于所述的第4細(xì)胞群的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
在本發(fā)明的所述的血樣測(cè)定方法中，最好所述第一散射光信息是前向散射光強(qiáng)度，所述第二散射光信息是側(cè)向散射光強(qiáng)度，所述熒光信息是熒光強(qiáng)度。
所述的處理步驟最好是將用于破損紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞細(xì)胞膜的表面活性劑、收縮受損血細(xì)胞的增溶劑、染色核酸的熒光色素和血樣混合起來(lái)。
本發(fā)明的骨髓原始細(xì)胞和血小板凝集區(qū)分法即區(qū)分血樣中所含骨髓原始細(xì)胞和血小板凝集的方法，包括以下步驟破損所述的試樣中所含紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜，收縮細(xì)胞膜受損的血細(xì)胞；光照經(jīng)過(guò)所述的處理的試樣，獲取由此產(chǎn)生的前向散射光信息和側(cè)向散射光信息；以及根據(jù)所述的前向散射光信息和側(cè)向散射光信息區(qū)分所述的骨髓原始細(xì)胞和血小板凝集。
本發(fā)明的血樣測(cè)定裝置包括試樣處理系統(tǒng)，用于破損血樣中所含紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜，收縮細(xì)胞膜受損的血細(xì)胞，用能夠?qū)怂崛旧臒晒馍剡M(jìn)行染色處理；信息獲取系統(tǒng)，用于用所述的熒光色素的勵(lì)起光照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、來(lái)源于角度與第一散射光不同的散射光的第二散射光信息及熒光信息；第一特定系統(tǒng)，根據(jù)所述的第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群；第二特定系統(tǒng)，根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的熒光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群；以及計(jì)數(shù)系統(tǒng)，對(duì)既含在所述的第1細(xì)胞群又含在所述的第2細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
最好所述的第1細(xì)胞群是出現(xiàn)在以所述的第一散射光信息和所述的第二散射光信息為二軸的第一散點(diǎn)圖中劃定的骨髓原始細(xì)胞出現(xiàn)候補(bǔ)區(qū)域的細(xì)胞群；第2細(xì)胞群是出現(xiàn)在以所述的第一散射光信息和所述的熒光信息為二軸的第二散點(diǎn)圖中劃定的骨髓原始細(xì)胞出現(xiàn)候補(bǔ)區(qū)域的細(xì)胞群。
所述的計(jì)數(shù)系統(tǒng)最好將既含在所述的第1細(xì)胞群又含在所述的第2細(xì)胞群的細(xì)胞在以所述的熒光信息和所述的第二散射光信息為二軸的第三散點(diǎn)圖中展開(kāi)，對(duì)出現(xiàn)在所述的第三散點(diǎn)圖中的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
本發(fā)明的測(cè)定裝置也可以配備顯示器，用于顯示有既含在所述的第1細(xì)胞群又含在所述的第2細(xì)胞群的細(xì)胞出現(xiàn)的散點(diǎn)圖以及所述的骨髓原始細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果中的至少一項(xiàng)，還可配備發(fā)射所述的勵(lì)起光的光源。
所述第一特定系統(tǒng)為根據(jù)所述第2細(xì)胞群的第一散射光信息和第二散射光信息從所述第2細(xì)胞群中特定第1細(xì)胞群。
所述第二特定系統(tǒng)為根據(jù)所述第1細(xì)胞群的第一散射光信息和熒光信息從所述第1細(xì)胞群中特定出第2細(xì)胞群。
所述第一特定系統(tǒng)和所述第二特定系統(tǒng)為根據(jù)所述第一散射光信息和所述第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群、并根據(jù)所述第一散射光信息和所述熒光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群的單獨(dú)特定系統(tǒng)。
所述第一散射光信息為前向散射光強(qiáng)度，所述第二散射光信息為側(cè)向散射光強(qiáng)度，所述熒光信息為熒光強(qiáng)度。
所述試樣處理系統(tǒng)用于將破損紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞細(xì)胞膜的表面活性劑、收縮受損紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的增溶劑、給核酸染色的熒光色素與血樣混合起來(lái)。
本發(fā)明還提供一種血樣測(cè)定裝置，其包括試樣處理系統(tǒng)，破損血樣中所含紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜，收縮細(xì)胞膜受損的血細(xì)胞，用能夠染色核酸的熒光色素進(jìn)行染色處理；
信息獲取系統(tǒng)，用光束照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、角度不同于第一散射光的第二散射光信息和熒光信息；第一特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第一散射光信息和所述第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群；第三特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第一散射光信息和所述熒光信息特定血影群以外的細(xì)胞群作為第3細(xì)胞群；第四特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第3細(xì)胞群的第二散射光信息和熒光信息，從所述第3細(xì)胞群中特定至少實(shí)際上不含成熟白細(xì)胞的第4細(xì)胞群；計(jì)數(shù)系統(tǒng)，對(duì)既存在于所述第1細(xì)胞群又存在于所述第4細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)。
本發(fā)明所謂“幼稚白細(xì)胞”指存在于普通骨髓、不存在于末梢血液的未成熟細(xì)胞。比如指骨髓原始細(xì)胞、前骨髓細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、后骨髓細(xì)胞。前骨髓細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、后骨髓細(xì)胞有時(shí)統(tǒng)稱(chēng)為幼稚粒細(xì)胞。另外，原始細(xì)胞以前的分化階段中的骨髓系干細(xì)胞、嗜中性-巨噬細(xì)胞系干細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞系干細(xì)胞等白細(xì)胞系造血祖細(xì)胞也包含在本發(fā)明的幼稚白細(xì)胞范圍內(nèi)。
本發(fā)明所謂“成熟白細(xì)胞”指成熟淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞(嗜中性、嗜酸性、嗜堿性細(xì)胞)。
本發(fā)明所謂“血小板凝集”指血小板凝聚了2個(gè)以上者。
本發(fā)明所謂“細(xì)胞膜破損”指在細(xì)胞膜上打開(kāi)能通過(guò)特定物質(zhì)的微孔。
本發(fā)明所謂“血樣”主要指末梢血液，但此外也指包含骨髓液、單采血液成份技術(shù)回收的血液成份的試樣或腹腔液、尿樣等含白細(xì)胞成份的生物試樣。
本發(fā)明的血樣測(cè)定方法在用通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)得的血樣熒光信息和兩種散射光信息區(qū)分細(xì)胞群時(shí)，可以排除血小板凝集的影響，特定含有骨髓原始細(xì)胞的細(xì)胞群，因此，與可區(qū)分含骨髓原始細(xì)胞細(xì)胞群和成熟白細(xì)胞細(xì)胞群的特定方法適當(dāng)組合，即可準(zhǔn)確分類(lèi)并計(jì)數(shù)骨髓原始細(xì)胞。
本發(fā)明的血樣測(cè)定裝置適用本發(fā)明的血樣測(cè)定方法，故可精確地測(cè)定骨髓原始細(xì)胞。


圖1為說(shuō)明第1細(xì)胞群的散點(diǎn)圖。
圖2為說(shuō)明第2細(xì)胞群的散點(diǎn)圖。
圖3為說(shuō)明既含在第1細(xì)胞群又含在第2細(xì)胞群的細(xì)胞的散點(diǎn)圖。
圖4為說(shuō)明第3細(xì)胞群的散點(diǎn)圖。
圖5為說(shuō)明第4細(xì)胞群的散點(diǎn)圖。
圖6為本發(fā)明測(cè)定裝置外觀的示意圖。
圖7為本發(fā)明測(cè)定裝置使用的流式細(xì)胞儀的示意。
圖8為用于本發(fā)明測(cè)定裝置的控制部分的結(jié)構(gòu)框圖。
圖9為本發(fā)明測(cè)定裝置采用的信息處理一例的流程示意圖。
圖10為本發(fā)明測(cè)定裝置采用的信息處理其他例的流程示意圖。
圖11為本發(fā)明測(cè)定裝置采用的信息處理其他例的流程示意圖。
圖12為本發(fā)明測(cè)定裝置采用的信息處理其他例的流程示意圖。
圖13(A)為從實(shí)施例1制備的測(cè)定用試樣測(cè)得的第一散點(diǎn)圖；(B)為從同樣測(cè)定用試樣測(cè)得的第二散點(diǎn)圖。
圖14為就實(shí)施例1中第1細(xì)胞群和第2細(xì)胞群二者都含有的細(xì)胞繪制的第三散點(diǎn)圖。
圖15(A)為從實(shí)施例2制備的測(cè)定用試樣測(cè)得的第一散點(diǎn)圖；(B)為從同樣測(cè)定用試樣測(cè)得的第二散點(diǎn)圖。
圖16為就實(shí)施例2的測(cè)定用試樣中第1細(xì)胞群和第2細(xì)胞群二者都含有的細(xì)胞繪制的第三散點(diǎn)圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的血樣測(cè)定方法包括試樣處理步驟，破損血樣中所含紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜，收縮細(xì)胞膜受損的血細(xì)胞，用能對(duì)核酸染色的熒光色素進(jìn)行染色處理；信息獲取步驟，用所述的熒光色素的勵(lì)起光照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、來(lái)源于角度與第一散射光不同的散射光的第二散射光信息及熒光信息；特定步驟，用取得的熒光信息和兩種散射光信息，排除血小板凝集的影響，區(qū)別與其他血細(xì)胞特定含骨髓原始細(xì)胞的細(xì)胞群；計(jì)數(shù)步驟，對(duì)得以特定的骨髓原始細(xì)胞群作為骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
以下具體說(shuō)明。
本發(fā)明的測(cè)定方法中的試樣處理步驟最好通過(guò)將血樣和后面所述處理試劑混合來(lái)進(jìn)行。該處理試劑指破損血樣中所含紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞細(xì)胞膜、收縮細(xì)胞膜受損的血細(xì)胞并能夠?qū)怂崛旧脑噭＞唧w而言即含有能破損試樣中所含血細(xì)胞細(xì)胞膜的表面活性劑和能對(duì)核酸進(jìn)行熒光染色的熒光色素。
本發(fā)明使用的表面活性劑能夠破損紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜。其作用機(jī)制尚不明確，但可以認(rèn)為是通過(guò)抽出特定細(xì)胞膜脂質(zhì)成份的一部分，打開(kāi)足以讓特定物質(zhì)通過(guò)的細(xì)孔(將此稱(chēng)為破損)。熒光色素可以滲透到被表面活性劑破損的細(xì)胞內(nèi)部對(duì)核酸染色。
表面活性劑也可損傷幼稚白細(xì)胞，但損傷時(shí)間比紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞長(zhǎng)。因此，在血樣與處理試劑混合后的一定時(shí)間內(nèi)，受損的成熟白細(xì)胞比未受損的骨髓原始細(xì)胞和幼稚粒細(xì)胞等更易被染色。如此一來(lái)，骨髓原始細(xì)胞和幼稚粒細(xì)胞與受損并核染色的成熟白細(xì)胞相比，幾乎不能被用于染色核酸的熒光色素染色，因此比成熟白細(xì)胞熒光強(qiáng)度低。
本發(fā)明所用表面活性劑為聚氧乙烯非離子型表面活性劑。具體而言為以R1R2(CH2CH2O)nH表示的非離子型表面活性劑。式中R1代表碳原子9～25的烷基、烯基或炔基，R2為-O-或-COO-或 n為10～40的整數(shù)。
作為碳原子數(shù)9～25的烷基比如有壬基、癸基、十一烷基、十二(烷)基、十三烷基和十四烷基等。作為碳原子數(shù)9～25的烯基有十二碳烯基、十四碳烯基等。作為碳原子數(shù)9～25的炔基有十二炔基、十三炔基、十四炔基等。
具體而言，有聚氧乙烯(20)月桂醚、聚氧乙烯(15)油烯基醚、聚氧乙烯(16)油烯基醚等等。
表面活性劑可以以水溶液的形態(tài)使用。比如關(guān)于聚氧乙烯非離子型表面活性劑的水中濃度，因所用表面活性劑的種類(lèi)不同而各異，但前述聚氧乙烯(16)油烯基醚可以在5～50g/l(最好15～35g/l)范圍內(nèi)使用。聚氧乙烯非離子型表面活性劑如果疏水基的碳原子數(shù)相同，則n的值越小，損傷細(xì)胞的能力越強(qiáng)，n的值越大，損傷細(xì)胞的能力越弱。如果n的值相同，則損傷細(xì)胞的能力隨疏水基的碳原子數(shù)減少而增強(qiáng)?？紤]到這一點(diǎn)，以所述的值為目標(biāo)，必要的表面活性劑濃度通過(guò)實(shí)驗(yàn)適當(dāng)求得即可。
本發(fā)明使用的熒光色素為能對(duì)核酸染色的色素。對(duì)于細(xì)胞膜受損的成熟白細(xì)胞，熒光色素透過(guò)其細(xì)胞膜對(duì)核酸染色。
具體而言，有溴化乙錠、碘化丙啶、moleculer公司銷(xiāo)售的溴化乙錠-吖啶異(源)二聚體、二迭氮乙錠、乙錠同型二聚體-1、乙錠同型二聚體-2、一迭氮乙錠、TOTO-1、TO-PRO-1、TOTO-3、TO-PRO-3等。當(dāng)以He-Ne和紅色半導(dǎo)體激光等為光源時(shí)，作為合適的色素可以使用下述結(jié)構(gòu)式(1)表示的色素。
式中，R3為氫原子、低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基，R4為氫原子、?；虻图?jí)烷基，R5為氫原子或可被取代的低級(jí)烷基，R6為氫原子或低級(jí)烷基，R7為氫原子、低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基，Z為硫原子、氧原子或低級(jí)烷基取代的碳原子，m為1或2，X為陰離子。
R3、R4、R5、R6和R7中的低級(jí)烷基意指碳原子1～6的直鏈或支鏈烷基，比如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、仲丁基、叔丁基、苯基、辛基等，其中尤以甲基、乙基為宜。
R3和R7中的低級(jí)烷氧基指碳原子1～6烷氧基，比如甲氧基、乙氧基、丙氧基等，其中尤以甲氧基和乙氧基為宜。另外，R3和R7最好是氫原子。
R4中的?；詈脼橹咀宕妓嵫苌孽；?，比如乙酰、丙酰等等，其中尤以乙?；鶠橐恕?br> R5中的可被取代的低級(jí)烷基指可以用1～3個(gè)氫氧基、鹵原子(氟、氯、溴或碘)取代的低級(jí)烷基，其中以用1個(gè)氫氧基取代的甲基、乙基為官。
Z中的低級(jí)烷基即Z最好是硫原子。
X-中的陰離子有鹵離子(氟、氯、溴或碘離子)、鹵化硼離子(BF4-、BCl4-、BBR4-等)、磷化合物離子、鹵氧酸離子、氟硫酸離子、甲硫酸離子以及芳香環(huán)中有鹵或含鹵的烷基作為置換基的四苯基硼化物離子。最好為溴離子或BF4-。
作為所述的結(jié)構(gòu)式(1)中色素的具體舉例，以下述色素A、色素B、色素C為宜。
色素濃度可根據(jù)所用色素適當(dāng)決定。試劑中的濃度以0.01～500ppm為宜，最好為0.1～200ppm。
細(xì)胞膜因所述的表面活性劑受損，細(xì)胞內(nèi)的一部分因此而排出細(xì)胞外從而引起細(xì)胞收縮，或細(xì)胞膜表面狀態(tài)的變化引起細(xì)胞收縮，為了使白細(xì)胞以外的血細(xì)胞特別是紅細(xì)胞成為不提供有用的散射光信息和熒光信息的血影團(tuán)，最好在試劑中添加增溶劑以讓受損細(xì)胞充分收縮。
作為增溶劑具體而言可以使用以下結(jié)構(gòu)式(2)所表示的酰基氨衍生物或其鹽； 式中，R10為碳原子10～22的烷基，P為1～5的整數(shù)；以下結(jié)構(gòu)式(3)所表示膽酸衍生物； 式中，R11為氫原子或氫氧基；及選自以下結(jié)構(gòu)式(4)所表示的甲基葡萄糖之一或更多。
式中，q為5～7。
作為碳原子10～22的烷基有癸基、十二烷基、十四烷基和油烯基等。具體而言有N-月桂酰肌氨酸鈉、月桂甲β-丙氨酸鈉、月桂酰肌氨酸、CHAPS(3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基-氨基]丙磺酸)、CHAPSO(膽汁酸誘導(dǎo)體膠束)、MEGA8(辛?；?N-甲基葡萄糖)、MEGA9(N-壬?；?N-甲基葡萄糖)和MEGA10(N-癸酰基-N-甲基葡萄糖)等。
至于增溶劑的濃度，酰肌氨酸衍生物或其鹽為0.2～2.0g/l，膽酸衍生物為0.1～0.5g/l，甲基葡萄糖為1.0～8.0g/l。
作為增溶劑，除所述的外，還可用辛基葡萄糖苷、蔗糖單癸酸酯和N-甲酸基甲基亮氨酰丙胺酸等，最好以0.01～50.0g/l濃度使用。
另外，最好含有用于調(diào)節(jié)試劑pH值的pH調(diào)節(jié)劑和緩沖液，根據(jù)需要最好含有滲透壓調(diào)整劑。
作為緩沖劑可以使用HEPES等良好緩沖劑和磷酸緩沖液等?？梢允褂脷溲趸c等作為pH調(diào)節(jié)劑。作為滲透壓調(diào)整劑可以使用糖、氨基酸、有機(jī)溶劑和氯化鈉等。作為糖可以使用葡萄糖、木糖醇、甘露糖醇、樹(shù)膠醛醣、核糖醇等。氨基酸可以使用氨基丙酸、脯氨酸、甘氨酸、纈氨酸等。有機(jī)溶劑可以使用乙二醇、丙三醇等。試劑中的滲透壓調(diào)節(jié)劑濃度根據(jù)分子量適當(dāng)調(diào)節(jié)，比如當(dāng)使用木糖醇時(shí)濃度以10～75g/l為宜，使用丙三醇時(shí)以5～45g/l為宜，使用甘氨酸時(shí)最好5～45g/l。
有以上成份的處理試劑以pH5.0～9.0、滲透壓150～600mOSm/kg為宜。
另外，處理試劑也可以既是含有表面活性劑、色素和其他成份的混合型試劑，也可以將含有熒光的染色液和含有所述的表面活性劑的溶液(溶血?jiǎng)?分別裝入不同的容器，做成試劑盒。此時(shí)，為了提高色素的保存穩(wěn)定性，最好用乙二醇等水溶性有機(jī)溶劑作為熒光色素的溶劑。

通過(guò)將含有所述的處理試劑的溶液和血樣混合，制備測(cè)定用試樣。如果使用所述的試劑盒，首先將含表面活性劑的溶液(溶血?jiǎng)?和血樣混合，再混合染色劑制備測(cè)定用試樣。
血樣和處理試劑混合時(shí)，以試樣處理試劑的比為1∶10～1∶1000、反應(yīng)溫度20～40℃、反應(yīng)時(shí)間3秒～5分為宜，最好為4秒～1分。
在如此制備的測(cè)定用試樣中，紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞細(xì)胞收縮變小。特別是紅細(xì)胞無(wú)核，細(xì)胞膜受損所帶來(lái)的溶血和細(xì)胞收縮更甚，熒光色素?zé)o法染色，因此，前向散射光、側(cè)向散射光和熒光都變?nèi)?，可以作為血影?duì)待。
另一方面，成熟白細(xì)胞雖然也因試樣和試劑反應(yīng)一定時(shí)間后細(xì)胞膜受損，而引起細(xì)胞收縮，但是，核實(shí)際上并不收縮，因此，不會(huì)象紅細(xì)胞那樣變小。而且，熒光色素可以穿透受損的膜，從而使核染色。
幼稚白細(xì)胞比成熟白細(xì)胞和紅細(xì)胞對(duì)溶血?jiǎng)└心托?，要破損細(xì)胞膜需要時(shí)間。因此，在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)細(xì)胞收縮實(shí)際上不發(fā)生，加上熒光色素不能穿透，因此，核幾乎不被染色。
關(guān)于一個(gè)一個(gè)的血小板細(xì)胞，用處理試劑處理和幼稚白細(xì)胞一樣破損細(xì)胞膜需要時(shí)間，而且色素不會(huì)進(jìn)入血小板內(nèi)對(duì)血小板本身染色，而血小板凝集體不同，色素會(huì)物理性地吸附于凝集體的周?chē)?，從而染色?br> 用流式細(xì)胞儀測(cè)定制備的測(cè)定用試樣，獲取試樣中所含細(xì)胞和血小板等的散射光信息和熒光信息。
獲取信息最好是將測(cè)定用試樣加入到流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室，向流經(jīng)該流動(dòng)室的試樣照射能夠勵(lì)起所述的熒光色素的勵(lì)起光。這樣即可獲取流經(jīng)流動(dòng)室的細(xì)胞發(fā)出的散射光信息和熒光信息。
照射光一般包含能勵(lì)起所用熒光色素的波長(zhǎng)的光。也可以根據(jù)所用流式細(xì)胞儀所配光源的光的波長(zhǎng)，選擇能用該光束勵(lì)起的熒光色素。
散射光信息，一般是獲取角度不同的兩種散射光。具體而言，最好將前向散射光和側(cè)向散射光組合使用。
在這里，所謂前向散射光可以認(rèn)為是反映細(xì)胞大小的信息。即，細(xì)胞越大前向散射光也越強(qiáng)。所謂側(cè)向散射光指對(duì)于前向散射光來(lái)說(shuō)角度相差80～100度、最好相差85～95度的散射光。從側(cè)向散射光可以獲得細(xì)胞內(nèi)部信息、特別是核的信息。當(dāng)試樣含有顆?；蚝俗冃螘r(shí)，側(cè)向散射光變強(qiáng)。
在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，熒光色素幾乎無(wú)法進(jìn)入血小板內(nèi)部，因此，血小板本身幾乎不會(huì)被染色。但是，熒光色素會(huì)結(jié)合到血小板凝集體周?chē)脱“逯g連接的部分，因此，在測(cè)定試樣中，凝集體越大，熒光強(qiáng)度就越大。而當(dāng)血小板凝集少或小的時(shí)候，側(cè)向散射光變?nèi)?，吸附的熒光色素減少，結(jié)果是熒光強(qiáng)度也變小。
用獲取的散射光信息和熒光信息特定目標(biāo)細(xì)胞群，對(duì)骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。本發(fā)明的測(cè)定方法從特定步驟的角度看可以分為以下第一測(cè)定法～第四測(cè)定法。下面依次說(shuō)明。
(1)第一測(cè)定法在第一測(cè)定法中，根據(jù)獲取的第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群(第一特定步驟)，再根據(jù)獲取的第一散射光信息和熒光信息，特定含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群(第二特定步驟)，然后對(duì)既存在于第1細(xì)胞群又存在于所述的第2細(xì)胞群的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)作為骨髓原始細(xì)胞。第一特定步驟和第二特定步驟的順序無(wú)一定，誰(shuí)先都可。
(1-1)第1細(xì)胞群第1細(xì)胞群根據(jù)獲取的兩種散射光信息、最好是前向散射光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度來(lái)特定。特定第1細(xì)胞群最好是在以這兩種散射光信息為二軸繪制的散點(diǎn)圖(第一散點(diǎn)圖)中，劃定骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的區(qū)域。由于因樣品的不同，骨髓原始細(xì)胞的染色程度和大小都會(huì)不同，因此，最好不同的樣品分別劃定第1細(xì)胞群出現(xiàn)的區(qū)域。
關(guān)于第1細(xì)胞群出現(xiàn)區(qū)域的具體劃定方法，首先，當(dāng)在以?xún)煞N散射光信息為二軸繪制的散點(diǎn)圖中骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的位置上確認(rèn)有細(xì)胞群時(shí)，特定此細(xì)胞群的中心。然后，將骨髓原始細(xì)胞的細(xì)胞群中心與其他細(xì)胞群出現(xiàn)區(qū)域之間從該中心處到骨髓原始細(xì)胞群的細(xì)胞出現(xiàn)截止的位置可以劃定為第1細(xì)胞群出現(xiàn)區(qū)域的界限。同樣，如果確認(rèn)其他細(xì)胞群(幼稚粒細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)可能出現(xiàn)的位置上有細(xì)胞群，則可以在特定各細(xì)胞群中心的同時(shí)，特定其出現(xiàn)區(qū)域。這些區(qū)域也可根據(jù)各種大小的骨髓原始細(xì)胞針對(duì)所用色素和濃度累積的數(shù)據(jù)預(yù)先劃定。
本發(fā)明使用的測(cè)定用試樣，當(dāng)在縱軸為前向散射光強(qiáng)度(第一散射光信息)、橫軸為側(cè)向散射光強(qiáng)度(第二散射光信息)的散點(diǎn)圖中劃定各細(xì)胞可能出現(xiàn)的區(qū)域時(shí)，一般如圖1所示。圖1中，「BlAST」為骨髓原始細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域，「IG」為幼稚粒細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域，「GRAn」為粒細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域，「Ly」為淋巴細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域，「MO」為單核細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域。
骨髓原始細(xì)胞因側(cè)向散射光強(qiáng)度較弱，一般出現(xiàn)在散點(diǎn)圖中比較偏左的區(qū)域，而粒細(xì)胞和幼稚粒細(xì)胞因其核形態(tài)變形，一般出現(xiàn)在側(cè)向散射光較強(qiáng)的右側(cè)，這些細(xì)胞群均出現(xiàn)在遠(yuǎn)離骨髓原始細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域的區(qū)域。因此，作為第1細(xì)胞群的出現(xiàn)區(qū)域，只要?jiǎng)澏ㄓ脟@BlAST部分的長(zhǎng)短虛線(xiàn)表示的區(qū)域即可。
血小板凝集因凝集方式不同，側(cè)向散射光強(qiáng)度有小有大，且凝集體的大小也從幾個(gè)到幾十個(gè)不等，前向散射光強(qiáng)度也有大有小。但是，凝集體的大小和變形有相關(guān)性，因此，在圖1所示散點(diǎn)圖中，會(huì)出現(xiàn)在從左下方向右上方的區(qū)域(虛線(xiàn)區(qū)域)，不會(huì)與BlAST區(qū)域(第1細(xì)胞群出現(xiàn)區(qū)域)重疊。
根據(jù)圖1，也可以認(rèn)為，第1細(xì)胞群因?yàn)榕c血小板凝集及其他血細(xì)胞成份區(qū)分開(kāi)，可以將其作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)。然而，有的試樣會(huì)含有大個(gè)淋巴細(xì)胞，雖然不多，但是淋巴細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域的一部分會(huì)與第1細(xì)胞群的出現(xiàn)區(qū)域重疊。
(1-2)第2細(xì)胞群第2細(xì)胞群依據(jù)獲取的第一散射光信息和熒光信息、最好根據(jù)前向散射光信息和熒光信息特定。第2細(xì)胞群為在以前向散射光信息和熒光信息為二軸的散點(diǎn)圖(第二散點(diǎn)圖)中骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的區(qū)域中的細(xì)胞群。
骨髓原始細(xì)胞和幼稚粒細(xì)胞在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)細(xì)胞膜實(shí)際上都不會(huì)因處理試劑而受損，核不被染色，都會(huì)出現(xiàn)在熒光強(qiáng)度低的左側(cè)區(qū)域。因此，骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的區(qū)域有時(shí)也會(huì)有其他幼稚白細(xì)胞出現(xiàn)。另一方面，粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)會(huì)被處理試劑損傷細(xì)胞膜而使核染色，因此，出現(xiàn)在熒光強(qiáng)度高的右側(cè)區(qū)域，從而明確地區(qū)分出在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)實(shí)際上未進(jìn)行核染色的幼稚白細(xì)胞團(tuán)。也就是說(shuō)，包括骨髓原始細(xì)胞在內(nèi)的幼稚白細(xì)胞的出現(xiàn)區(qū)域?qū)嶋H上沒(méi)有成熟白細(xì)胞出現(xiàn)。
因此，作為第2細(xì)胞群出現(xiàn)區(qū)域的具體特定方法，首先，當(dāng)確認(rèn)在散點(diǎn)圖中骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的位置有細(xì)胞群出現(xiàn)時(shí)，特定此細(xì)胞群中心。然后，將骨髓原始細(xì)胞的細(xì)胞群中心到成熟白細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)區(qū)域之間從細(xì)胞中心到骨髓原始細(xì)胞群細(xì)胞出現(xiàn)截止的部分可以劃定為第2細(xì)胞群出現(xiàn)區(qū)域的界限。同樣，如果確認(rèn)其他細(xì)胞群(幼稚粒細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)出現(xiàn)的位置上有細(xì)胞群，也可以在特定各細(xì)胞群中心的同時(shí)，特定其出現(xiàn)區(qū)域。這些區(qū)域也可根據(jù)各種大小的骨髓原始細(xì)胞相對(duì)于所用色素和濃度累積的數(shù)據(jù)預(yù)先劃定。
具體而言，如圖2所示，當(dāng)在以熒光強(qiáng)度為橫軸、前向散射光強(qiáng)度為縱軸的散點(diǎn)圖中，第2細(xì)胞群為出現(xiàn)在熒光強(qiáng)度較低的左側(cè)區(qū)域中長(zhǎng)短虛線(xiàn)區(qū)域中的細(xì)胞群。圖2中，「BlAST」為骨髓原始細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域，「IG」為幼稚粒細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域，「GRAn」為粒細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域，「Ly」為淋巴細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域，「MO」為單核細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域。
另外，血小板凝集染色只是一種物理性吸附，故出現(xiàn)在左側(cè)區(qū)域。且依凝集的程度，可能有大于或小于骨髓原始細(xì)胞的細(xì)胞，因此，如圖2所示，出現(xiàn)在從前向散射光強(qiáng)度小的位置到大的位置縱向伸長(zhǎng)的區(qū)域。
(1-3)骨髓原始細(xì)胞的計(jì)數(shù)既包含在如上特定的第1細(xì)胞群也存在于第2細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)。
有可能包含在第1細(xì)胞群的淋巴細(xì)胞未包含在第2細(xì)胞群，而可能包含在第2細(xì)胞群的血小板凝集和幼稚白細(xì)胞未包含在第1細(xì)胞群。因此，既包含在如上特定的第1細(xì)胞群又存在于第2細(xì)胞群的細(xì)胞不包括淋巴細(xì)胞、血小板凝集和幼稚白細(xì)胞，可以說(shuō)實(shí)際上只有骨髓原始細(xì)胞。因此，通過(guò)將既包含在如上特定的第1細(xì)胞群也存在于第2細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)，可以正確地計(jì)數(shù)骨髓原始細(xì)胞。
另外，也可以將所述的既包含在如上特定的第1細(xì)胞群又存在于第2細(xì)胞群的細(xì)胞在以熒光信息和第二散射光信息為二軸的散點(diǎn)圖(第三散點(diǎn)圖)中展開(kāi)。出現(xiàn)在此第三散點(diǎn)圖中的細(xì)胞實(shí)際上就是僅含骨髓原始細(xì)胞的細(xì)胞群。
第一散射光信息最好是前向散射光強(qiáng)度，第二散射光信息最好是側(cè)向散射光強(qiáng)度。關(guān)于既包含在如上特定的第1細(xì)胞群又存在于第2細(xì)胞群的細(xì)胞，在以熒光信息和第二散射光信息為二軸的散點(diǎn)圖(第三散點(diǎn)圖)中展開(kāi)，則得到如圖3所示散點(diǎn)圖。此散點(diǎn)圖中僅出現(xiàn)既包含在如上特定的第1細(xì)胞群又存在于第2細(xì)胞群的細(xì)胞、即實(shí)際上為骨髓原始細(xì)胞，因此，也可以將出現(xiàn)在此區(qū)域的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)。
(2)第二測(cè)定法在第一測(cè)定法和第二測(cè)定法中，第一特定步驟和第二特定步驟均為分別進(jìn)行，分別特定第1細(xì)胞群和第2細(xì)胞群，但是也可以先特定第1細(xì)胞群(或第2細(xì)胞群)，再?gòu)南忍囟ǖ牡?細(xì)胞群(或第2細(xì)胞群)中特定第2細(xì)胞群(或第1細(xì)胞群)。
即，第二測(cè)定法是根據(jù)獲取的第一散射光信息和熒光信息，特定含有骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群(第二特定步驟)，然后根據(jù)特定的第2細(xì)胞群的第一散射光信息和第二散射光信息，從所述的第2細(xì)胞群中特定第1細(xì)胞群(當(dāng)特指第二測(cè)定法時(shí)，則將此特定步驟稱(chēng)為“第1’特定步驟”，在第1’特定步驟特定的第1細(xì)胞群稱(chēng)為第1’細(xì)胞群)，并將此第1’細(xì)胞群作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)?；蛘吒鶕?jù)第一散射光信息和第二散射光信息，特定含有骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群(第一特定步驟)，然后根據(jù)特定的第1細(xì)胞群的第一散射光信息和熒光信息，從所述的第1細(xì)胞群中特定第2細(xì)胞群(當(dāng)特指第二測(cè)定法時(shí)，則將此特定步驟稱(chēng)為“第2’特定步驟”，在第2’特定步驟特定的第2細(xì)胞群稱(chēng)為“第2’細(xì)胞群)，并將此第2’細(xì)胞群作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)。
第一特定步驟及在此步驟特定的第1細(xì)胞群和第二特定步驟及在此步驟特定的第2細(xì)胞群分別根據(jù)在信息獲取步驟中獲取的散射光信息和熒光信息特定，其具體方法同前述第一測(cè)定法，故在此省略說(shuō)明。
(2-1)第2’細(xì)胞群的特定及骨髓原始細(xì)胞的計(jì)數(shù)第2’特定步驟先根據(jù)已特定的第1細(xì)胞群的第一散射光信息(最好是前向散射光信息強(qiáng)度)和熒光信息(最好是熒光強(qiáng)度)從所述的第1細(xì)胞群中特定含骨髓原始細(xì)胞的細(xì)胞群(第2’細(xì)胞群的特定)。如此特定的第2’細(xì)胞群是在第一測(cè)定法和第二測(cè)定法中既包含在第1細(xì)胞群又包含在第2細(xì)胞群的細(xì)胞。
第2’細(xì)胞群的特定具體如下進(jìn)行。
首先以第一散射光信息和第二散射光信息為軸繪制散點(diǎn)圖(第一散點(diǎn)圖)，在此散點(diǎn)圖展開(kāi)所有有形成份(細(xì)胞、血小板等)。在此第一散點(diǎn)圖中劃定骨髓原始細(xì)胞的候補(bǔ)區(qū)域，特定出現(xiàn)在此區(qū)域內(nèi)的第1細(xì)胞群。然后，以第一散射光信息和熒光信息為二軸繪制散點(diǎn)圖(第2’散點(diǎn)圖)，在此散點(diǎn)圖中只展開(kāi)第1細(xì)胞群，在第2’散點(diǎn)圖中，出現(xiàn)在骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的區(qū)域中的細(xì)胞群即為第2’細(xì)胞群。在以第一散射光信息和熒光信息為二軸的第2’散點(diǎn)圖中，成熟白細(xì)胞和幼稚白細(xì)胞被明確分開(kāi)，因此，即使第1細(xì)胞群含有淋巴細(xì)胞，展開(kāi)在第2’散點(diǎn)圖中的第2’細(xì)胞群也不會(huì)含有淋巴細(xì)胞。也就是說(shuō)第2’細(xì)胞群實(shí)際上是不含血小板凝集、淋巴細(xì)胞等其他成份的骨髓原始細(xì)胞群。因此，只要將包含在第2’細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)即可。
(2-2)第1’細(xì)胞群的特定及骨髓原始細(xì)胞的計(jì)數(shù)第1’特定步驟先按第二特定步驟特定第2細(xì)胞群，根據(jù)特定的第2細(xì)胞群的第一散射光信息(最好是前向散射光強(qiáng)度)和第二散射光信息(最好是側(cè)向散射光強(qiáng)度)從所述的第2細(xì)胞群中特定含骨髓原始細(xì)胞的細(xì)胞群(第1’細(xì)胞群的特定)。如此特定的第1’細(xì)胞群是在第一測(cè)定法和第二測(cè)定法中既包含在第1細(xì)胞群又包含在第2細(xì)胞群的細(xì)胞。
第1’細(xì)胞群的特定具體如下進(jìn)行。首先將第一散射光信息(最好是前向散射光強(qiáng)度)和熒光信息(最好是熒光強(qiáng)度)繪制成以第一散射光信息和熒光信息為二軸的散點(diǎn)圖(第二散點(diǎn)圖)，在此散點(diǎn)圖展開(kāi)所有有形成份(細(xì)胞、血小板等)。在此第二散點(diǎn)圖中劃定含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群的候補(bǔ)區(qū)域。然后，以第一散射光信息和第二散射光信息為二軸繪制散點(diǎn)圖(第1’散點(diǎn)圖)，在此散點(diǎn)圖中只展開(kāi)所述的特定的第2細(xì)胞群。在第1’散點(diǎn)圖中，出現(xiàn)在骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的區(qū)域中的細(xì)胞群即為第1’細(xì)胞群。在以第一散射光信息和第二散射光信息為二軸的第1’散點(diǎn)圖中，幼稚白細(xì)胞和血小板凝集出現(xiàn)在可以明確區(qū)別于骨髓原始細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域的區(qū)域，因此，第1’細(xì)胞群實(shí)際上是不含血小板凝集、淋巴細(xì)胞和幼稚白細(xì)胞等其他成份。因此，只要將包含在第1’細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)即可。
(3)第三測(cè)定法在第一和第二測(cè)定法中，特定第1細(xì)胞群(或第1’細(xì)胞群)和第2細(xì)胞群(或第2’細(xì)胞群)時(shí)無(wú)論哪個(gè)步驟都是根據(jù)兩種信息分別特定各細(xì)胞群后，再特定既含在第1細(xì)胞群又含在第2細(xì)胞群的細(xì)胞群，并以此作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)。但是本發(fā)明的血樣測(cè)定方法也可以用獲取的第一散射光信息、第二散射光信息和熒光信息在一個(gè)步驟中特定第1細(xì)胞群和第2細(xì)胞群，確定同時(shí)含在第1細(xì)胞群和第2細(xì)胞群二者中的細(xì)胞，并以此為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)。
即，根據(jù)第三測(cè)定法，在根據(jù)獲取的第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群的同時(shí)，根據(jù)獲取的第一散射光信息和熒光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群，將既含在第1細(xì)胞群又含在第2細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)。
具體而言，將第一散射光信息、第二散射光信息和熒光信息展開(kāi)在以三者為軸繪制的三維散點(diǎn)圖中，在根據(jù)第一散射光信息(最好是前向散射光強(qiáng)度)和第二散射光信息(最好是側(cè)向散射光強(qiáng)度)特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群的同時(shí)，根據(jù)獲取的第一散射光信息(最好是前向散射光強(qiáng)度)和熒光信息(最好是熒光強(qiáng)度)特定含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群。此時(shí)的第1細(xì)胞群的特定方法和第2細(xì)胞群的特定方法可以和第一測(cè)定法的步驟相同。
總之，在三維散點(diǎn)圖中，可以同時(shí)特定第1細(xì)胞群和第2細(xì)胞群，還可以特定既含在第1細(xì)胞群又含在第2細(xì)胞群的細(xì)胞。如在第一測(cè)定法中所述，既含在第1細(xì)胞群又含在第2細(xì)胞群的細(xì)胞實(shí)際上不含血小板凝集、淋巴細(xì)胞等其他細(xì)胞成份。因此，在三維散點(diǎn)圖只要將既含在第1細(xì)胞群又含在第2細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)，即可非常精確地對(duì)骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)。
(4)第四測(cè)定法第四測(cè)定法適用于不是根據(jù)獲取的第一散射光信息和熒光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群，而是取而代之特定含血影群以外細(xì)胞(本發(fā)明中使用的測(cè)定用試樣中紅細(xì)胞由于細(xì)胞收縮而變成血影細(xì)胞群，因此實(shí)際上為全白細(xì)胞)的第3細(xì)胞群的情況。
即，第四測(cè)定法是根據(jù)獲取的第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群(第一特定步驟)，根據(jù)第一散射光信息和熒光信息特定含全白細(xì)胞的第3細(xì)胞群(第三特定步驟)，根據(jù)所述的第3細(xì)胞群中的第二散射光信息和熒光信息，從所述的第3細(xì)胞群中特定至少實(shí)際上不含成熟白細(xì)胞的第4細(xì)胞群(第四特定步驟)，對(duì)既含在所述的第1細(xì)胞群又含在所述的第4細(xì)胞群的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
第一特定步驟和第1細(xì)胞群同第一測(cè)定法，在此省略說(shuō)明。
(4-1)第三特定步驟和第3細(xì)胞群第3細(xì)胞群是在以前向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度為二軸的散點(diǎn)圖中出現(xiàn)在除紅細(xì)胞血影群出現(xiàn)區(qū)域之外的區(qū)域的細(xì)胞群、即實(shí)際上為全白細(xì)胞群。具體而言，如果以熒光強(qiáng)度為橫軸、前向散射光強(qiáng)度為縱軸繪制散點(diǎn)圖，則如圖4所示，出現(xiàn)在長(zhǎng)短虛線(xiàn)區(qū)域的細(xì)胞群即為第3細(xì)胞群。第3細(xì)胞群出現(xiàn)區(qū)域如圖2所示，還包含血小板凝集。
(4-2)第四特定步驟及第4細(xì)胞群第4細(xì)胞群根據(jù)第3細(xì)胞群的第二散射光信息和熒光信息、最好是側(cè)向散射光信息和熒光信息特定。當(dāng)在以熒光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度為二軸的散點(diǎn)圖中展開(kāi)第3細(xì)胞群時(shí)，成熟白細(xì)胞出現(xiàn)的區(qū)域和幼稚白細(xì)胞出現(xiàn)的區(qū)域會(huì)明確分開(kāi)，因此，如果要在以熒光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度為二軸的散點(diǎn)圖中特定可能含骨髓原始細(xì)胞的區(qū)域，可以特定含幼稚白細(xì)胞細(xì)胞群、進(jìn)而特定含骨髓原始細(xì)胞細(xì)胞群出現(xiàn)的區(qū)域。在此，骨髓原始細(xì)胞候補(bǔ)區(qū)域的特定與第1細(xì)胞群和第2細(xì)胞群的特定一樣，最好每個(gè)樣品分別進(jìn)行。另外，也可以根據(jù)各種大小的骨髓原始細(xì)胞和成熟白細(xì)胞按不同使用色素和濃度積累的數(shù)據(jù)預(yù)先劃定。
在以側(cè)向散射光強(qiáng)度為橫軸、熒光強(qiáng)度為縱軸的散點(diǎn)圖中，展開(kāi)第3細(xì)胞群，則如圖5所示，成熟白細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及粒細(xì)胞)因?yàn)楹吮蝗旧霈F(xiàn)在上方，可以和實(shí)際上核未被染色的幼稚白細(xì)胞明確區(qū)分。成熟白細(xì)胞按核的形態(tài)等從左起依次為淋巴細(xì)胞群(Ly)、單核細(xì)胞群(MO)、粒細(xì)胞群(GRAn)。血小板凝集自左向右出現(xiàn)在下方。因此，在側(cè)向散射光強(qiáng)度低的左側(cè)區(qū)域，只要將位于從熒光強(qiáng)度較低的位置到熒光強(qiáng)度中等位置、長(zhǎng)短虛線(xiàn)區(qū)域內(nèi)的含骨髓原始細(xì)胞細(xì)胞群作為第4細(xì)胞群特定即可。骨髓原始細(xì)胞和幼稚粒細(xì)胞核的形態(tài)、復(fù)雜性均不同，因此，可以根據(jù)側(cè)向散射光強(qiáng)度的大小來(lái)區(qū)分二者，但是當(dāng)應(yīng)用區(qū)分二者的設(shè)門(mén)法有困難時(shí)，也可以將出現(xiàn)在骨髓原始細(xì)胞和幼稚粒細(xì)胞都有的幼稚粒細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域的細(xì)胞群作為第4細(xì)胞群。
(4-3)骨髓原始細(xì)胞的特定及計(jì)數(shù)對(duì)既含于如上特定的第1細(xì)胞群又含于第4細(xì)胞群的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。第1細(xì)胞群不含血小板凝集，第4細(xì)胞群不含成熟白細(xì)胞，因此，既含于第1細(xì)胞群又含于第4細(xì)胞群的細(xì)胞實(shí)為不含血小板凝集和成熟白細(xì)胞的骨髓原始細(xì)胞或幼稚白細(xì)胞的細(xì)胞群。即，即使第1細(xì)胞群含有淋巴細(xì)胞，既含于第1細(xì)胞群又含于第4細(xì)胞群的細(xì)胞也不包括淋巴細(xì)胞，故實(shí)際上可以精確地對(duì)骨髓原始細(xì)胞或幼稚白細(xì)胞計(jì)數(shù)。
本發(fā)明的區(qū)分血樣所含骨髓原始細(xì)胞和血小板凝集的方法，是通過(guò)以下步驟區(qū)分含有骨髓原始細(xì)胞的細(xì)胞群和血小板凝集本發(fā)明測(cè)定方法中的試樣處理步驟；光照經(jīng)所述的處理的試樣，取得由此產(chǎn)生的前向散射光信息和側(cè)向散射光信息；根據(jù)所述的前向散射光信息和所述的側(cè)向散射光信息特定含有骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群。
如上所述，在以前向散射光信息和側(cè)向散射光信息為二軸的散點(diǎn)圖中，當(dāng)特定了骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的區(qū)域，就與血小板凝集可能出現(xiàn)的區(qū)域明確分開(kāi)了，從而可以區(qū)分血樣中所含骨髓原始細(xì)胞和血小板凝集。
本發(fā)明的測(cè)定裝置包括以下系統(tǒng)試樣處理系統(tǒng)，用于破損血樣中所含紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜，收縮細(xì)胞膜受損的血細(xì)胞，用能夠?qū)怂崛旧臒晒馍剡M(jìn)行染色處理；信息獲取系統(tǒng)，用于用所述的熒光色素的勵(lì)起光照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、來(lái)源于角度與第一散射光不同的散射光的第二散射光信息及熒光信息；第一特定系統(tǒng)，根據(jù)所述的第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群；第二特定系統(tǒng)，根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的熒光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群；以及計(jì)數(shù)系統(tǒng)，對(duì)既含在所述的第1細(xì)胞群又含在所述的第2細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
本發(fā)明的測(cè)定裝置從其外觀上來(lái)說(shuō)，例如有如圖6所示外觀。圖6所示裝置包括測(cè)定單元1、分析單元2、連接分析單元2和測(cè)定單元1的信號(hào)線(xiàn)3。本發(fā)明測(cè)定裝置的試樣處理系統(tǒng)和信息獲取系統(tǒng)包含在測(cè)定單元1中，分析單元2則包括本發(fā)明的第一特定系統(tǒng)、第二特定系統(tǒng)及計(jì)數(shù)系統(tǒng)。
測(cè)定單元1有供操作者進(jìn)行各種設(shè)定輸入的液晶觸摸屏10、用于開(kāi)始測(cè)定的啟動(dòng)開(kāi)關(guān)11及用于加樣采樣的探針12。測(cè)定單元1內(nèi)部還配置有圖7所示流式細(xì)胞儀。分析單元2有處理測(cè)定單元1輸出的信息、控制測(cè)定單元1運(yùn)行的控制部分6、作為顯示各種測(cè)定結(jié)果的顯示器使用的輸出部分7及輸入供操作者輸入樣品信息的鍵盤(pán)8。
下面就圖7所示流式細(xì)胞儀進(jìn)行說(shuō)明。從光源(比如紅半導(dǎo)體激光波長(zhǎng)633nm)21射出的光束通過(guò)準(zhǔn)直儀透鏡22照射到鞘液流動(dòng)室23的銳孔。從管嘴20吐出、流經(jīng)銳孔的血細(xì)胞發(fā)出的前向散射光通過(guò)聚光鏡24和微孔板25射入前向散射光檢測(cè)器(發(fā)光二極管)26。另一方面，通過(guò)銳孔的血細(xì)胞發(fā)出的側(cè)向散射光通過(guò)聚光鏡27和二向色鏡28射入側(cè)向散射光檢測(cè)器(光電倍增管)29。通過(guò)銳孔的血細(xì)胞發(fā)出的側(cè)向熒光通過(guò)聚光鏡27、二向色鏡28、濾光器28’及微孔板30射入側(cè)向熒光檢測(cè)器(光電倍增管)31。從前向散射光檢測(cè)器26輸出的前向散射光信息、從側(cè)向散射光檢測(cè)器29輸出的側(cè)向散射光信息和從側(cè)向熒光檢測(cè)器31輸出的側(cè)向熒光信息分別被放大器32、33、34放大，輸入控制部分6。
另外，所述的光源21主要用于將能勵(lì)起試樣處理中所用色素的光束照射到加入有所制備的測(cè)定用試樣的流動(dòng)室銳孔，根據(jù)染色試樣中血細(xì)胞的熒光色素來(lái)選擇。因此，可根據(jù)所用熒光色素的種類(lèi)不同，除紅色半導(dǎo)體激光外，還可選擇氬激光、He-Ne激光、蘭色半導(dǎo)體激光等。
圖8為顯示控制部分6結(jié)構(gòu)的框圖。此控制部分6主要由以下部分構(gòu)成CPU6a、ROM6B、RAM6C、硬盤(pán)6d、輸出入接口6e、圖象輸出接口6F和通信接口6g，其中CPU6a、ROM6B、RAM6C、硬盤(pán)6d、輸出入接口6e、輸出接口6F和通信接口6g通過(guò)通道6H相接，可進(jìn)行數(shù)據(jù)通信。
CPU6a可執(zhí)行存儲(chǔ)在ROM6B和硬盤(pán)6d中的系統(tǒng)程序和讀到RAM6C的系統(tǒng)程序。因此，可根據(jù)從測(cè)定系統(tǒng)1、具體地說(shuō)是流式細(xì)胞儀輸入的前向散射光信息、側(cè)向散射光信息和熒光信息按預(yù)設(shè)程序進(jìn)行演算處理，特定第1細(xì)胞群和第2細(xì)胞群等細(xì)胞群，進(jìn)而對(duì)骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)。
ROM6B存儲(chǔ)有供CPU6a執(zhí)行的系統(tǒng)程序和用于執(zhí)行該系統(tǒng)程序的數(shù)據(jù)等。RAM6C讀取存儲(chǔ)于ROM6B和硬盤(pán)6d中的系統(tǒng)程序及作為執(zhí)行系統(tǒng)程序時(shí)的運(yùn)行區(qū)域。硬盤(pán)6d存儲(chǔ)供CPU6a執(zhí)行的系統(tǒng)程序和用于執(zhí)行該系統(tǒng)程序的數(shù)據(jù)。此系統(tǒng)程序發(fā)揮分析光學(xué)信息、輸出分析結(jié)果等功能。
輸出入接口6e接有鍵盤(pán)8。作為輸入設(shè)備的鍵盤(pán)8也用于在輸出畫(huà)面上的操作等。輸出接口6F與由液晶顯示屏構(gòu)成的輸出部分7連接。輸出部分7用于輸出和顯示在控制部分6取得的分析結(jié)果。通信接口6g與測(cè)定系統(tǒng)1連接，發(fā)揮接收光學(xué)信息的作用。
下面就在控制部分6中的信息處理實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。圖9為本發(fā)明第一測(cè)定方法的信息處理流程圖?？刂撇糠?采取第二測(cè)定方法的話(huà)，首先，通過(guò)信號(hào)線(xiàn)3接收測(cè)定系統(tǒng)1檢測(cè)出的前向散射光信號(hào)、側(cè)向散射光信號(hào)和熒光信號(hào)(步驟S1)?？刂撇糠?分析這些信號(hào)，計(jì)算出各個(gè)信號(hào)強(qiáng)度(步驟S2)。接著，用試樣中有形成份(細(xì)胞和血小板等)的前向散射光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度繪制以前向散射光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度為二軸的第一散點(diǎn)圖(步驟S3)。在第一散點(diǎn)圖中，劃定骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的骨髓原始細(xì)胞候補(bǔ)區(qū)域，特定出現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)的第1細(xì)胞群(步驟S4)。再用試樣中有形成份的前向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度繪制以前向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度為二軸的第二散點(diǎn)圖(步驟S5)。在第二散點(diǎn)圖中劃定骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的骨髓原始細(xì)胞候補(bǔ)區(qū)域，特定出現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)的第2細(xì)胞群(步驟S6)。接下來(lái)，用既含在第1細(xì)胞群又含在第2細(xì)胞群的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度繪制以熒光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度為二軸的第三散點(diǎn)圖(步驟S7)。將出現(xiàn)在此第三散點(diǎn)圖的細(xì)胞(既含在第1細(xì)胞群又含在第2細(xì)胞群的細(xì)胞)作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)(步驟S8)，將此計(jì)數(shù)結(jié)果和第三散點(diǎn)圖輸出到輸出部分7(步驟S9)。
圖10為本發(fā)明第二測(cè)定法中相應(yīng)于先特定第1細(xì)胞群方法的信息處理流程圖?？刂撇糠?采取這種第二測(cè)定法時(shí)，首先通過(guò)信號(hào)線(xiàn)3接收測(cè)定系統(tǒng)1檢測(cè)出的前向散射光信號(hào)、側(cè)向散射光信號(hào)和熒光信號(hào)(步驟S1)?？刂撇糠?分析這些信號(hào)，計(jì)算出各個(gè)信號(hào)強(qiáng)度(步驟S2)。接著，用試樣中有形成份(細(xì)胞和血小板等)的前向散射光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度繪制以前向散射光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度為二軸的第一散點(diǎn)圖(步驟S3)。在第一散點(diǎn)圖中，劃定骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的骨髓原始細(xì)胞候補(bǔ)區(qū)域，特定出現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)的第1細(xì)胞群(步驟S4)。再用試樣中有形成份的前向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度繪制以前向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度為二軸的散點(diǎn)圖(第2’散點(diǎn)圖)(步驟S5)。在第2’散點(diǎn)圖中劃定骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的骨髓原始細(xì)胞候補(bǔ)區(qū)域，特定出現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)的第2’細(xì)胞群(步驟S6)。將此第2’細(xì)胞群作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)(步驟S7)，將此計(jì)數(shù)結(jié)果和第2’散點(diǎn)圖輸出到輸出部分7(步驟S8)。
圖11為本發(fā)明第二測(cè)定方法中對(duì)應(yīng)先特定第2細(xì)胞群方法的信息處理流程圖。當(dāng)控制部分6采用這種第二測(cè)定方法時(shí)，首先通過(guò)信號(hào)線(xiàn)3接收測(cè)定系統(tǒng)1檢測(cè)出的前向散射光信號(hào)、側(cè)向散射光信號(hào)和熒光信號(hào)(步驟S1)。控制部分6分析這些信號(hào)，計(jì)算出各個(gè)信號(hào)強(qiáng)度(步驟S2)。接著，用試樣中有形成份(細(xì)胞和血小板等)的前向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度繪制以前向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度為二軸的第二散點(diǎn)圖(步驟S3)。在第二散點(diǎn)圖中，劃定骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的骨髓原始細(xì)胞候補(bǔ)區(qū)域，特定出現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)的第2細(xì)胞群(步驟S4)。再用第2細(xì)胞群的前向散射光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度繪制以前向散射光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度為二軸的散點(diǎn)圖(第1’散點(diǎn)圖)(步驟S5)。在第1’散點(diǎn)圖中劃定骨髓原始細(xì)胞可能出現(xiàn)的骨髓原始細(xì)胞候補(bǔ)區(qū)域，特定出現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)的第1’細(xì)胞群(步驟S6)。將此第1’細(xì)胞群作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)(步驟S7)，將此計(jì)數(shù)結(jié)果和第1’散點(diǎn)圖輸出到輸出部分7(步驟S8)。
圖12為本發(fā)明第三測(cè)定法相應(yīng)的信息處理流程圖。當(dāng)控制部分6采用這種第三測(cè)定法時(shí)，首先通過(guò)信號(hào)線(xiàn)3接收測(cè)定系統(tǒng)1檢測(cè)出的前向散射光信號(hào)、側(cè)向散射光信號(hào)和熒光信號(hào)(步驟S1)?？刂撇糠?分析這些信號(hào)，計(jì)算出各個(gè)信號(hào)強(qiáng)度(步驟S2)。接著，以試樣中有形成份(細(xì)胞和血小板等)的前向散射光強(qiáng)度、側(cè)向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度為三軸，繪制三維散點(diǎn)圖(步驟S3)。在此三維散點(diǎn)圖中，根據(jù)前向散射光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度特定第1細(xì)胞群，根據(jù)前向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度特定第2細(xì)胞群(步驟S4)。在此三維散點(diǎn)圖中劃定既含在第1細(xì)胞群又含在第2細(xì)胞群的細(xì)胞出現(xiàn)的骨髓原始細(xì)胞區(qū)域，對(duì)出現(xiàn)在該區(qū)域的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)(步驟S5)，將此計(jì)數(shù)結(jié)果和三維散點(diǎn)圖輸出到輸出部分7(步驟S8)。
在所述的實(shí)施方式的裝置中，控制部分6將用于統(tǒng)計(jì)骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和計(jì)數(shù)的散點(diǎn)圖輸出并顯示在輸出部分7的顯示屏上，也可以?xún)H輸出其中的某一項(xiàng)。而且輸出散點(diǎn)圖時(shí)，還可以最終不僅輸出用于骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)的散點(diǎn)圖，還輸出繪制的全部散點(diǎn)圖。
以上實(shí)施方式的測(cè)定裝置采用了所述的本發(fā)明的第一～第三測(cè)定法，當(dāng)采用第四測(cè)定法時(shí)，還包括根據(jù)取得的熒光信息和第二散射光信息特定至少不含成熟白細(xì)胞的第4細(xì)胞群這一第三特定步驟，所述的計(jì)數(shù)步驟最好將既含在所述的第1細(xì)胞群又含在所述的第2細(xì)胞群、且含在第三特定步驟特定的細(xì)胞群中的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
關(guān)于采用第四測(cè)定法的裝置，具體而言，只要改變所述的實(shí)施方式控制部分6中信息處理即可。但在第二特定步驟，要特定包括骨髓原始細(xì)胞在內(nèi)的全白細(xì)胞的細(xì)胞群(相當(dāng)于第3細(xì)胞群)作為根據(jù)第一散射光信息和熒光信息特定的第2細(xì)胞群；在第三特定步驟，為了特定第4細(xì)胞群，以第二散射光信息(側(cè)向散射光強(qiáng)度)和熒光信息(熒光強(qiáng)度)為二軸繪制散點(diǎn)圖。然后，對(duì)既含在第1細(xì)胞群、第2細(xì)胞群(在此實(shí)際上為第3細(xì)胞群)、又含在第4細(xì)胞群的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并將計(jì)數(shù)結(jié)果輸出到輸出部分7。
在以上實(shí)施方式中敘述的“骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果”包括試樣中的骨髓原始細(xì)胞數(shù)、單位體積的骨髓原始細(xì)胞數(shù)(濃度)和骨髓原始細(xì)胞對(duì)全白細(xì)胞所占比例，控制部分6可以至少輸出其中的一項(xiàng)。
實(shí)驗(yàn)例[血樣]
使用的血樣是大量含有骨髓原始細(xì)胞樣品(試樣A)、含有骨髓原始細(xì)胞和幼稚白細(xì)胞的樣品(試樣B)。試樣A、B含有血小板凝集。
(1)使用處理試劑A制備測(cè)定用試樣(A-1)溶血?jiǎng)┲苽浜韵鲁煞莸娜缦陆Y(jié)構(gòu)的溶血?jiǎng)?br> 甘氨酸 19.5g/l聚氧乙烯(16)油烯基醚25.0g/lN-月桂酰肌氨酸鈉0.75g/lHEPES 10mM蒸餾水 11苛性鈉 PH達(dá)7.0的量(A-2)染色劑用乙二醇溶解下式表示的熒光色素A。
混合所述的溶血?jiǎng)┖脱獦?，將所述的染色劑添加其中，直至熒光色素最終濃度達(dá)到20PPm，測(cè)定用試樣即制備完成。
(2)用處理試劑B制備測(cè)定用試樣除用含以下成份的溶血?jiǎng)┮酝?，其他均與處理試劑A一樣。
木糖醇 37.0g/l聚氧乙烯(16)油烯基醚25.0g/l
N-月桂酰肌氨酸鈉0.75g/lHEPES 10mM蒸餾水 11苛性鈉 PH達(dá)7.0的量[測(cè)定]實(shí)驗(yàn)例1混合血樣A和處理試劑B，33℃反應(yīng)5秒，制備試樣，將該試樣放入流動(dòng)室，用流式細(xì)胞儀(光源紅色半導(dǎo)體波長(zhǎng)633nm)測(cè)定前向散射光、側(cè)向散射光和熒光。將測(cè)定結(jié)果繪制成以前向散射光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度為二軸的第一散點(diǎn)圖(圖13(A))和以熒光強(qiáng)度和前向散射光強(qiáng)度為二軸的第二散點(diǎn)圖(圖13(B))。
在圖13(A)中，第1細(xì)胞群出現(xiàn)的區(qū)域?yàn)閷?shí)線(xiàn)區(qū)域。在圖13(B)中，第2細(xì)胞群出現(xiàn)的區(qū)域?yàn)閷?shí)線(xiàn)區(qū)域。在圖13(A)中，擴(kuò)展含淋巴細(xì)胞的細(xì)胞群，其中一部分與第1細(xì)胞群重疊。
第1細(xì)胞群和第2細(xì)胞群二者都含有的細(xì)胞群如圖14所示。根據(jù)圖14，在以側(cè)向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度為二軸的第三散點(diǎn)圖中，第1細(xì)胞群和第2細(xì)胞群二者均含有的細(xì)胞群集中出現(xiàn)在實(shí)線(xiàn)的部分。
對(duì)圖14實(shí)線(xiàn)區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算對(duì)全白細(xì)胞數(shù)的比例，為58.5％。另一方面，在顯微鏡下觀察血樣A，計(jì)數(shù)骨髓原始細(xì)胞。求得骨髓原始細(xì)胞在視野內(nèi)對(duì)全白細(xì)胞的比例為42.0％。
因此可以確認(rèn)，根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定方法可以以與顯微鏡同樣的精度檢測(cè)出骨髓原始細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)例2用處理試劑A在33℃下處理血樣B5秒鐘，制備測(cè)定用試樣，將該測(cè)定用試樣加入流動(dòng)室，用流式細(xì)胞儀(光源紅色半導(dǎo)體波長(zhǎng)633nm)測(cè)定前向散射光、側(cè)向散射光和熒光。將測(cè)定結(jié)果繪制成以前向散射光強(qiáng)度和側(cè)向散射光強(qiáng)度為二軸的第一散點(diǎn)圖(圖15(A))和以熒光強(qiáng)度和前向散射光強(qiáng)度為二軸的第二散點(diǎn)圖(圖15(B))。
在圖15(A)中，第1細(xì)胞群出現(xiàn)的區(qū)域?yàn)閷?shí)線(xiàn)區(qū)域。在圖15(B)中，第2細(xì)胞群出現(xiàn)的區(qū)域?yàn)閷?shí)線(xiàn)區(qū)域。第1細(xì)胞群和第2細(xì)胞群二者都含有的細(xì)胞群如圖16所示。根據(jù)圖16，在以側(cè)向散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度為二軸的第三散點(diǎn)圖中，第1細(xì)胞群和第2細(xì)胞群二者均含有的細(xì)胞群集中出現(xiàn)在實(shí)線(xiàn)的部分。
對(duì)圖16實(shí)線(xiàn)區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算對(duì)全白細(xì)胞數(shù)的比例，為2.4％。另一方面，在顯微鏡下觀察血樣B，計(jì)數(shù)骨髓原始細(xì)胞。求得骨髓原始細(xì)胞在視野內(nèi)對(duì)全白細(xì)胞的比例為2.5％。
因此可以確認(rèn)，根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定方法可以以與顯微鏡觀察同樣的精度檢測(cè)出骨髓原始細(xì)胞，特別是能夠與幼稚粒細(xì)胞區(qū)分，精確地檢測(cè)出骨髓原始細(xì)胞。
前述的詳細(xì)說(shuō)明及附圖是通過(guò)文字解釋和圖示來(lái)進(jìn)行的，其目的不在于限定權(quán)利要求的保護(hù)范圍。本說(shuō)明書(shū)中的具體實(shí)施方式
的各個(gè)變種對(duì)于普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)，并處于權(quán)利要求及其等同技術(shù)的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種血樣測(cè)定裝置，包括以下系統(tǒng)試樣處理系統(tǒng)，用于破損血樣中所含紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜，收縮細(xì)胞膜受損血細(xì)胞，用能對(duì)核酸染色的熒光色素進(jìn)行染色處理；信息獲取系統(tǒng)，用光束照射所述處理過(guò)的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、來(lái)源于角度與第一散射光不同的散射光的第二散射光信息及熒光信息；第一特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群；第二特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第一散射光信息和所述熒光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群；以及計(jì)數(shù)系統(tǒng)，對(duì)既含在所述第1細(xì)胞群又含在所述第2細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定裝置，其特征在于所述第1細(xì)胞群為出現(xiàn)在以所述第一散射光信息及所述第二散射光信息為二軸的第一散點(diǎn)圖中劃定的骨髓原始細(xì)胞出現(xiàn)候補(bǔ)區(qū)域的細(xì)胞群，所述第2細(xì)胞群為出現(xiàn)在以所述第一散射光信息及所述熒光信息為二軸的第二散點(diǎn)圖中劃定的骨髓原始細(xì)胞出現(xiàn)候補(bǔ)區(qū)域的細(xì)胞群。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定裝置，其特征在于所述計(jì)數(shù)系統(tǒng)是將既含于所述第1細(xì)胞群又含于所述第2細(xì)胞群的細(xì)胞在以所述熒光信息和所述第二散射光信息為二軸的第三散點(diǎn)圖展開(kāi)，將出現(xiàn)在所述第三散點(diǎn)圖的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定裝置，其特征在于所述第二特定系統(tǒng)為根據(jù)所述第1細(xì)胞群的第一散射光信息和熒光信息從所述第1細(xì)胞群中特定出第2細(xì)胞群。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定裝置，其特征在于所述第一特定系統(tǒng)為根據(jù)所述第2細(xì)胞群的第一散射光信息和第二散射光信息從所述第2細(xì)胞群中特定第1細(xì)胞群。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定裝置，其特征在于所述第一特定系統(tǒng)和所述第二特定系統(tǒng)為根據(jù)所述第一散射光信息和所述第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群、并根據(jù)所述第一散射光信息和所述熒光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群的單獨(dú)特定系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定裝置，其特征在于所述第一散射光信息為前向散射光強(qiáng)度，所述第二散射光信息為側(cè)向散射光強(qiáng)度，所述熒光信息為熒光強(qiáng)度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定裝置，其特征在于所述試樣處理系統(tǒng)用于將破損紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞細(xì)胞膜的表面活性劑、收縮受損紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的增溶劑、給核酸染色的熒光色素與血樣混合起來(lái)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定裝置，其特征在于其還配備有顯示器，用于顯示出現(xiàn)有既含于所述第1細(xì)胞群又含于所述第2細(xì)胞群的細(xì)胞的散點(diǎn)圖和所述骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果中的至少一項(xiàng)。
10.權(quán)利要求1所述測(cè)定裝置，其特征在于其還有照射所述光束的光源。
11.一種血樣測(cè)定裝置，其包括試樣處理系統(tǒng)，破損血樣中所含紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜，收縮細(xì)胞膜受損的血細(xì)胞，用能夠染色核酸的熒光色素進(jìn)行染色處理；信息獲取系統(tǒng)，用光束照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、角度不同于第一散射光的第二散射光信息和熒光信息；第一特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第一散射光信息和所述第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群；第三特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第一散射光信息和所述熒光信息特定血影群以外的細(xì)胞群作為第3細(xì)胞群；第四特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第3細(xì)胞群的第二散射光信息和熒光信息，從所述第3細(xì)胞群中特定至少實(shí)際上不含成熟白細(xì)胞的第4細(xì)胞群；計(jì)數(shù)系統(tǒng)，對(duì)既存在于所述第1細(xì)胞群又存在于所述第4細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)。
12.一種血樣測(cè)定方法，包括以下步驟試樣處理步驟，破損血樣中所含紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜，收縮細(xì)胞膜受損的血細(xì)胞，用能對(duì)核酸染色的熒光色素進(jìn)行染色處理；信息獲取步驟，用光束照射所述的處理過(guò)的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、來(lái)源于角度與第一散射光不同的散射光的第二散射光信息及熒光信息；第一特定步驟，根據(jù)所述第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群；第二特定步驟，根據(jù)所述第一散射光信息和所述的熒光信息特定含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群；以及計(jì)數(shù)步驟，對(duì)既含在所述第1細(xì)胞群又含在所述的第2細(xì)胞群的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定血樣、不受血小板凝集等試樣中其他成份影響、能夠更準(zhǔn)確地對(duì)骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)和計(jì)數(shù)的測(cè)定方法包括破損血樣中所含紅細(xì)胞和成熟白細(xì)胞的細(xì)胞膜，收縮細(xì)胞膜受損的血細(xì)胞，用能對(duì)核酸染色的熒光色素進(jìn)行染色處理，用流式細(xì)胞儀測(cè)定經(jīng)所述的處理的試樣，對(duì)既含在根據(jù)前向散射光信息和側(cè)向散射光信息特定的含骨髓原始細(xì)胞的第1細(xì)胞群又含在根據(jù)所述的前向散射光信息和熒光信息特定的含骨髓原始細(xì)胞的第2細(xì)胞群中的細(xì)胞作為骨髓原始細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。本發(fā)明還提供其測(cè)定裝置包括以下系統(tǒng)試樣處理系統(tǒng)，信息獲取系統(tǒng)，第一特定系統(tǒng)，第二特定系統(tǒng)，以及計(jì)數(shù)系統(tǒng)。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101046439SQ20071008699
公開(kāi)日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2007年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月29日
發(fā)明者辻智悠, 吉田步, 小國(guó)振一郎 申請(qǐng)人:希森美康株式會(huì)社