專利名稱：來源于嗜堿菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種按植物密碼子偏愛合成的來源于嗜堿菌(Alkaliphilusmetalliredigens)的5-烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因及應(yīng)用，特別具體涉及該5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的原核表達、純化及其在轉(zhuǎn)基因作物培育中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
草甘膦是一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型優(yōu)秀除草劑，廣泛用于果園、膠園、非耕地、免耕地中的玉米、大豆、棉花播前或播后處理，以及出苗后定向處理。1974年在美國注冊登記以來，至今已在世界100多個國家注冊，成為世界上使用面積最大的除草劑品種之一。但是該除草劑同樣是一種非選擇性除草劑，對農(nóng)作物同樣有著殺死作用。為了在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用草甘膦，必須培育出具有草甘膦抗性或者降解性的農(nóng)作物。草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine, glyphosate)毒性作用機理是競爭性抑制莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性。該合成酶是植物和微生物體內(nèi)芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)生物合成過程中的一個關(guān)鍵酶，該酶由aroA基因編碼。目前種植抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的國家越來越多，面積也迅速增加，種植面積不斷擴大，占全球種植轉(zhuǎn)基因作物的78%以上。根據(jù)2002年資料表明，耐草甘膦大豆依舊是美國、阿根廷、加拿大、墨西哥、羅馬尼亞、烏拉圭和南非等七國的主要商品化轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。耐草甘膦除草劑大豆在全球范圍內(nèi)種植3650萬公頃，占全球總轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積的62%。然而現(xiàn)在應(yīng)用于生產(chǎn)的抗草甘膦基因僅有兩個，且都受到專利的保護，因此發(fā)掘新型的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷 酸合成酶基因?qū)τ谂嘤哂凶灾髦R產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物將是非常有必要的。最近，來自于極端微生物體內(nèi)的好多酶都已成為研究的熱點，主要是因為微生物生長在極端環(huán)境中從而使這些酶可能具有潛在的特殊的生物功能。嗜堿菌(Alkaliphilusmetalliredigens)是一種革蘭氏陰性菌,該菌能夠在ρΗ=8· 0-11. O的堿性環(huán)境中生存。其全基因組測序已于2009年完成(NCBI Reference Sequence:NC_009633.1)在過去的幾年時間里，很多來自該堿性微生物中的酶被分離出來并進行研究了。然而來自該菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶還從未研究過，也未見對該酶功能的研究報告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種來源于嗜堿菌(Alkaliphilusmetalliredigens)的5-烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因及其應(yīng)用。所述的來源于嗜堿菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO I所示，它是根據(jù)植物密碼偏愛通過化學(xué)合成方法得到的。即采用大量重疊的引物通過兩步 PCR 進行全基因的合成(PTDS) (Nucleic Acids Research，2004，32 :e98)。具體合成方法包括以下步驟引物設(shè)計設(shè)計長度大概為60bp左右的覆蓋整個5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的寡核苷酸的序列44個，其中每相鄰的兩個寡核苷酸序列有20個堿基的重復(fù)。PCR擴增利用PCR進行5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶擴增。其中，在100 μ I反應(yīng)體系中，Ρ2 Ρ43共42個引物的添加量為2ng，兩個外側(cè)引物Pl和P44的添加量為30ng，擴增條件為94°C預(yù)熱 lmin，94°C 30s, 50°C 30s, 72°C lOmin，使用的 Taq DNA 聚合酶為 KODFXtaq酶(Toyobo公司，日本)，共25個循環(huán)。轉(zhuǎn)化PCR結(jié)束后，用1%瓊脂糖膠回收片段，取10 μ I直接與T/A克隆載體相連(大連寶生物公司)。4°C連接過夜，在DH5a感受態(tài)中高效轉(zhuǎn)化，獲得長度為1293bp的SEQ IDNol序列的陽性克隆，即為本發(fā)明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，經(jīng)序列測定，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。將上述獲得的陽性克隆直接與原核表達載體pYM 4087 (Curr Microbiol,2011,62 :833-839)相連，4°C連接2小時。然后將該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP 10(Invitrogen)0將菌液涂布于含有50 μ g/mL氨節(jié)青霉素的固體LB培養(yǎng)基(15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH=7. 5) 37°C過夜培養(yǎng)。次日，挑取3-5個菌落，接種于50ml液體LB培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH=7. 5)中，37°C搖床直到菌液的濃度達到OD6tltl為1. O時停止培養(yǎng)。培養(yǎng)液在5，OOOg重力加速度下離心5min，無菌水清洗I次。所得的細胞沉淀用ImL磷酸裂解緩沖液重懸，然后將其轉(zhuǎn)移到微量離心管中。使用超聲波儀裂解菌液30min，以12，OOOg離心30min。用凝膠-蛋白純化試劑盒HisTrap HP (Amersham Biosciences公司)對其進行蛋白表達純化。然后對其進行酶動力學(xué)特性分析。采用蘸花法(Nature Protocol, 2006, (2) :641-646)將上述獲得的5_烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)入擬南芥，進行草甘膦萌發(fā)根長和草甘膦噴灑處理試驗，結(jié)果表明本發(fā)明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因不僅具有較高的草甘膦抗性，而且還保持著與PEP較強的親和性，因而說明該基因可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化擬南芥中，這些特征為用于轉(zhuǎn)基因作物的培育提供可能。本發(fā)明通過對所合成的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的動力學(xué)參數(shù)以及在植物中草甘膦抗性的研究，發(fā)現(xiàn)該酶可用于培育高耐受草甘膦的轉(zhuǎn)基因作物。


圖1為本發(fā)明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的SDS-PAGE電泳圖，其中I為蛋白分子量MARKER，2為用HisTrap HP試劑盒純化的來源于嗜堿菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶蛋白，3代表在大腸桿菌BL21 (DE3)過量表達的來源于嗜堿菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶蛋白。 圖2為轉(zhuǎn)本發(fā)明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的擬南芥在含有不同濃度草甘膦(從左到右草甘膦濃度依次為0，200，500和1000 μ M)平板上的萌發(fā)實驗，其中，Ami, Am3, Am4分別代表轉(zhuǎn)本發(fā)明的5-烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因的不同的擬南芥株系；CK代表對照。
圖3為轉(zhuǎn)本發(fā)明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的擬南芥用15mM草甘膦噴灑處理7天后觀察到的情況(Aml，Am3，Am4分別代表轉(zhuǎn)本發(fā)明的5-烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶的不同的擬南芥株系；CK代表對照)。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說明，均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學(xué)出版社。實施例1按植物密碼子偏愛化學(xué)合成的來源于嗜堿菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因根據(jù)來源于嗜喊菌(Alkaliphilusmetalliredigens)的 aroA 序列(NCBI Reference Sequence:NC_009633.1)米取連續(xù)延伸 PCR (Nucleic AcidsResearch, 2004，32，e98)按照植物密碼子偏愛合成的5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因，設(shè)計44對引物用于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的人工合成。所設(shè)計的引物如下
權(quán)利要求
1.一種按照植物密碼子偏愛合成的來源于嗜堿菌Alkaliphilus metalliredigens的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.權(quán)利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因在大腸桿菌表達中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因在擬南芥轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，采用蘸花法將所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)入擬南芥中。
6.權(quán)利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因在轉(zhuǎn)基因作物培育中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因在高耐受草甘膦轉(zhuǎn)基因作物培育中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來源于嗜堿菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及應(yīng)用。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，全長1278bp，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。經(jīng)酶動力學(xué)特性分析和功能試驗驗證，本發(fā)明合成的該5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因具有較高的草甘膦耐受性，可用于轉(zhuǎn)基因作物的培育中。
文檔編號C12N15/82GK103060346SQ20121059234
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者田永生, 許晶, 彭日荷, 金曉芬, 韓洪娟, 韓靜, 王波, 王麗娟 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院