專利名稱：莖瘤芥抗逆基因及其植物表達載體和構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及莖瘤芥抗逆基因BjPERKl及其植物表達載體和構(gòu)建方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫對作物的產(chǎn)量及生長發(fā)育有很大影響，因此，有關(guān)植物抗逆性的研究一直是植物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點之一。莖瘤芥(Brassicajuncea var. tumida Tsen et Lee),又稱青菜頭，是十字花科 蕓薹屬植物，為榨菜的主要原料，是我國重慶、四川、浙江等地區(qū)主要的經(jīng)濟作物之一。多年來，莖瘤芥的相關(guān)研究主要集中在遺傳育種、良種繁育、栽培技術(shù)、品質(zhì)安全等領(lǐng)域，近年才陸續(xù)有生物學(xué)方面研究的報道，包括基因的克隆、功能研究以及莖瘤芥瘤狀莖膨大相關(guān)研究，企圖通過基因工程方法提高莖瘤芥的產(chǎn)量、質(zhì)量以及抗病性、抗逆性等。近年來對植物受體蛋白激酶(receptor protein kinase, PERK)類基因的研究表明，它們可能參與了植物細胞抗逆反應(yīng)、植物形態(tài)發(fā)生、自交不親和等生理生化反應(yīng)。而本實驗室(重慶郵電大學(xué)分子生物學(xué)實驗室)對莖瘤芥永安小葉品種的瘤莖膨大前后的轉(zhuǎn)錄組測序獲得了序列SEQ ID NO. 3，該序列有303bp，經(jīng)NCBI的blastx比對，預(yù)測為受體蛋白激酶蛋白基因(本發(fā)明將其命名為BjPERKl)片段，而BjPERKl基因的功能是什么，是否可以增強植物抗逆性，于是本發(fā)明將通過RACE擴增獲得全長序列和植物表達載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化，希望獲得該基因的具體功能以便能夠通過對莖瘤芥的基因工程改造獲得更好的品種。對于莖瘤芥受體蛋白激酶基因BjPERKl，目前還未見其全基因序列以及基因功能的報道，而本發(fā)明經(jīng)實驗驗證，該基因蛋白具有提高植物抗逆性的作用，促進了植物在逆境條件下的適應(yīng)能力和生長能力。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，本發(fā)明的目的之一是提供莖瘤芥抗逆基因BjPERKl，其核苷酸序列為SEQID NO.1所示，該基因全長2252bp，通過NCBI的ORF工具檢測知其最大開放閱讀框1923bp，5’端非編碼區(qū)有99bp，3’端非編碼區(qū)有230bp。本發(fā)明的目的之二是提供莖瘤芥抗逆基因蛋白BjPERKl，其氨基酸序列為SEQ IDNO. 2所示,有640個氨基酸,且序列通過NCBI的保守結(jié)構(gòu)域(conserved domains)檢測知具有蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的目的之三是提供莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl，其由抗逆基因BjPERKl的最大開放閱讀框序列(編碼序列)與植物表達載體pCAMBIA1302構(gòu)成。本發(fā)明的目的之四是提供莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的重組植物表達載體PCAMBIA1302-BJPERK1的構(gòu)建方法，包括如下步驟
(I)莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的克隆A. BjPERKl基因5’端未知序列擴增根據(jù)序列SEQ ID NO. 3設(shè)計兩個反向巢式引物BjPERKl-AOUT :5’-AGTCCTTTAGCAGATCCAAGAGCA-3’BjPERKl-AIN :5’-AATCTGGTGCTCCATTCCATTGTA-3’ ；
提取莖瘤芥莖的總RNA，然后通過5’ -Full RACE Kit試劑盒方法獲得cDNA第一鏈并進行巢式PCR擴增，產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，篩選并測序獲得5’端序列；B. BjPERKl基因3’端未知序列擴增根據(jù)序列SEQ ID NO. 3設(shè)計兩個正向巢式引物BjPERKl-SOUT :5’-TGCTTGTCTATGAGTTTGTTCCTA-3’BjPERKl-SIN :5’-GCAATCCTAAAATCATTCACCGTG-3’提取莖瘤芥莖的總RNA，然后用接頭引物5’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d (T)30MN-3’ (N=A, G, C或T;M=A，G或C ；d(T) 30代表30個連續(xù)的T堿基)以及M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)獲得cDNA第一鏈并進行巢式PCR擴增，產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，篩選并測序獲得3’端序列；C. BjPERKl基因全長序列擴增將所述獲得的5’端序列、3’端序列與序列SEQ ID NO. 3拼接，并從5’端非翻譯區(qū)和3’端非翻譯區(qū)設(shè)計一對引物上游引物BjPERKl-F :5’ -CGTGTCTCCTCTCTCCTCCTGCTT-3’下游引物BjPERKl-R :5’-AACCTTCAATTTCTCTCCCATCTG-3’ ；再以步驟B中的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物連接到pMD19_T載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，篩選并測序獲得BjPERKl基因全長序列；(2)植物表達載體 pCAMBIA1302_BjPERKl 的構(gòu)建根據(jù)BjPERKl基因的開放閱讀框序列設(shè)計一對引物，并分別引入酶切位點Bgl II和BstE II序列上游引物BjPERKl-Bgl :5’ -AGATCTATGTCCTCGGCGCCGTCT-3’ ；下游引物BjPERKl-Bst :5’ -GGTAACCTTACAAAAAAGGGCCACTAT-3，；再以步驟(I)B中的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物連接到pMD19-T載體得重組質(zhì)粒pMD19-T-BjPERKl，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞；提取質(zhì)粒pMD19-T_BjPERKl和PCAMBIA1302，并用Bgl II和BstE II雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化，篩選并測序驗證，植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl 構(gòu)建成功。本發(fā)明的目的之五是提供莖瘤芥抗逆基因BjPERKl在提高植物耐旱特性的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)已知序列SEQ ID NO. 3設(shè)計巢式引物并通過RACE方法擴增獲得莖瘤芥第一個受體蛋白激酶類基因BjPERKl ;通過構(gòu)建莖瘤芥BjPERKl基因植物表達載體，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制耐鹽新種質(zhì)，提高植物的耐鹽抗性，可進行植物品種改良。


圖1為本發(fā)明BjPERKl基因5’端序列擴增的凝膠電泳圖；圖2為本發(fā)明BjPERKl基因3’端序列擴增的凝膠電泳圖；圖3為本發(fā)明BjPERKl基因最大開放閱讀框序列擴增的凝膠電泳圖；圖4為本發(fā)明重組植物表達載體pCAMBIA1302_BjPERKl的構(gòu)建 流程圖；圖5為本發(fā)明正常條件下野生型與轉(zhuǎn)基因型擬南芥發(fā)芽率的統(tǒng)計圖；圖6為本發(fā)明NaCl脅迫下野生型與轉(zhuǎn)基因型擬南芥發(fā)芽率的統(tǒng)計圖；圖7為本發(fā)明NaCl脅迫下野生型與轉(zhuǎn)基因型擬南芥根的長度統(tǒng)計圖；圖8為本發(fā)明NaCl脅迫下野生型與轉(zhuǎn)基因型擬南芥的根的攝影圖；圖9為本發(fā)明NaCl脅迫下野生型與轉(zhuǎn)基因型擬南芥的存活率統(tǒng)計圖。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例和附圖來詳細說明本發(fā)明，這些實施例和附圖僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。本發(fā)明不限于下述實施方式或?qū)嵤├?，凡不違背本發(fā)明精神所做出的修改及變形，均應(yīng)包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。實驗例1:莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的克隆I主要試劑柱式小量植物總RNA抽提試劑盒(W7021)購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；5’ -Full RACE Kit試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Premix Ex Taq>DL2000DNA Marker、pMD19_T載體均購自大連寶生物工程有限公司。2實驗方法與步驟2.1BjPERKl基因5’端未知序列擴增2.1.1總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒方法提取獲得莖瘤芥瘤莖的總RNA，然后取約IygS RNA通過5’-Full RACE Kit試劑盒方法去磷酸化、去帽子、加接頭，最后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。2.1. 2引物設(shè)計根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得到的已知序列SEQ ID NO. 3設(shè)計兩個反向巢式引物BjPERKl-AOUT :5’-AGTCCTTTAGCAGATCCAAGAGCA-3’BjPERKl-AIN :5’-AATCTGGTGCTCCATTCCATTGTA-3’2.1. 3 巢式 PCR 擴增首先為OUT擴增以步驟2.1.1中cDNA第一鏈為模板，采用引物BjPERKl-AOUT和5，RACE Outer Primer (此引物為5’ -Full RACE Kit試劑盒中的引物)做PCR擴增，反應(yīng)體系為ddH207. 4 μ L7Premix Ex TaqlO μ L，模板I μ L，上下游引物各O. 8 μ L。PCR程序為94°C 3min,94°C 30s,55°C 30s,72°C 2min，30 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。再做IN擴增以O(shè)UT擴增的PCR產(chǎn)物為模板，采用引物BjPERKl-AIN和5’ RACEInner Primer (此引物也為5’-Full RACE Kit試劑盒中的引物)做PCR擴增。20 μ L反應(yīng)體系為ddH207. 4 μ L7Premix Ex TaqlO μ L，模板I μ L，上下游引物各O. 8 μ L。PCR程序為94°C 3min,94°C 30s,55°C 30s,72°C 90s，32 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。2.1. 4電泳將IN擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)特異條帶如圖1所示，M為DL2000DNA MARKER, I為擴增條帶，可見在1200bp左右有一特異條帶。
2.1. 5TA克隆將IN擴增做3個20 μ L反應(yīng)體系，電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至PMD19-T載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR篩選，將重組陽性質(zhì)粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。2.1. 6測序結(jié)果測序獲得的序列的3’端序列與SEQ ID NO. 3的5’端序列完全吻合，兩者成功拼接，說明成功獲得BjPERKl基因的5’端序列。2. 2BjPERKl基因3’端未知序列擴增2. 2.1總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒方法提取獲得莖瘤芥瘤莖的總RNA，然后取約IygS RNA為模板，采用接頭引物5’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T) 30MN-3’ (N=A, G, C 或 T;M=A, G 或 C)(此接頭引物來自 Clontech 公司的SMART RACE cDNA Synthesis Kit試劑盒)以及M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)獲得cDNA第一鏈。2. 2. 2引物設(shè)計根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得到的已知序列SEQ ID NO. 3設(shè)計兩個正向巢式引物BjPERKl-SOUT :5’ -TGCTTGTCTATGAGTTTGTTCCTA-3’ BjPERKl-SIN :5’-GCAATCCTAAAATCATTCACCGTG-3’2. 2. 3 巢式 PCR 擴增首先為OUT擴增以步驟2. 2.1中cDNA第一鏈為模板，采用引物BjPERKl-SOUT和3’ RACE Primer (此引物為步驟2. 2.1中接頭引物的前部分，即5’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3')做 PCR 擴增，20 μ L 反應(yīng)體系為ddH207. 4 μ L，Premix Ex TaqlO μ L,模板
Iμ L，上下游引物各 0.8 μ L。PCR 程序為94°C 3min，94°C 30s,55°C 30s,72°C 90s，30 個循環(huán)；72°C 延伸 IOmin。再做IN擴增以O(shè)UT擴增的PCR產(chǎn)物為模板，采用引物BjPERKl-SIN和3’ RACEPrimer 做 PCR 擴增。20 μ L 反應(yīng)體系為ddH207. 4 μ L，Premix Ex TaqlO μ L,模板 I μ L，上下游引物各 0.8 μ L。PCR 程序為94°C 3min,94°C 30s,55°C 30s,72°C 70s，32 個循環(huán)；72°C延伸IOrnin02. 2. 4電泳將IN擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)特異條帶如圖2所示，M為MarkerIII，I為擴增條帶，可見在IOOObp左右有一特異條帶。2. 2. 5TA克隆將IN擴增做3個20 μ L反應(yīng)體系，電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至PMD19-T載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR篩選，將重組陽性質(zhì)粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。2. 2. 6測序結(jié)果測序獲得的序列的5’端序列與SEQ ID NO. 3的3’端序列完全吻合，兩者成功拼接，說明成功獲得BjPERKl基因的3’端序列。 2. 3BjPERKl基因全長序列擴增2. 3.1序列拼接將2.1. 6獲得的5’端序列、2. 2. 6獲得的3’端序列和已知序列SEQ ID NO. 3進行拼接，得到BjPERKl基因全長序列SEQ ID NO. 1，其全長2252bp，最大開放閱讀框1923bp，5’端非編碼區(qū)有99bp，3’端非編碼區(qū)有230bp。為進一步驗證拼接的全長是否為真實的全長序列，于是從5’端和3’端的非編碼區(qū)設(shè)計引物進行PCR驗證。2. 3. 2引物設(shè)計根據(jù)2. 3.1的序列SEQ ID NO. 1，從兩端的非編碼區(qū)設(shè)計一對上下游引物上游引物BjPERKl-F :5’ -CGTGTCTCCTCTCTCCTCCTGCTT-3’
下游引物BjPERKl-R :5’ -AACCTTCAATTTCTCTCCCATCTG-3’2. 3. 3全長序列的PCR擴增以步驟2. 2.1中cDNA第一鏈為模板，采用引物 BjPERKl-F 和 BjPERKl-R 做 PCR 擴增。20 μ L 反應(yīng)體系為ddH207. 4 μ L，Premix ExTaqlO μ L，模板 I μ L，上下游引物各 O. 8 μ L。PCR 程序為-MV 3min，94°C 30s,60°C 30s、72°C 2min30s，32 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin02. 3. 4電泳將2. 3. 3擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)特異條帶如圖3所示，M為MarkerIII, I為擴增條帶,可見在2000bp左右有一特異條帶,與預(yù)期結(jié)果相符。2. 3. 5TA克隆將2. 3. 3中的擴增做3個20 μ L反應(yīng)體系，電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至PMD19-T載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR篩選，將重組陽性質(zhì)粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。
2. 3. 6測序結(jié)果測序獲得的序列與拼接序列的相應(yīng)片段完全一致，說明成功獲得BjPERKl基因。實驗例2 :莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的重組植物表達載體pCAMBIA1302_BjPERKl的構(gòu)建I主要試劑普通質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Bgl II和BstE II購自大連寶生物工程有限公司；含質(zhì)粒pCAMBIA1302的菌種
由本實驗室保存。2重組植物表達載體pCAMBIA1302_BjPERKl的構(gòu)建2.1引物設(shè)計根據(jù)BjPERKl基因的開放閱讀框序列設(shè)計上下游引物，并分別引入酶切位點Bgl II (AGATCT)和BstE II (GGTAACC)序列，引物為:上游引物BjPERKl-Bgl :5’ -AGATCTATGTCCTCGGCGCCGTCT-3，；下游引物BjPERKl-Bst :5，-GGTAACCTTACAAAAAAGGGCCACTAT-3，2. 2PCR擴增以實驗例I中步驟2. 2.1中cDNA第一鏈為模板，引物BjPERKl-Bgl和 BjPERKl-Bst 做 PCR 擴增:體系為 ddH207. 4 μ L，Premix Ex TaqlO μ L，模板 I μ L，上下游引物各 O. 8 μ L0 PCR 程序為-MV 3min，94°C 30s,60°C 30s,72°C 2min，32 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin02. 3電泳將2. 2擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)特異條帶如圖3所示，M為MarkerIII，l為擴增條帶，可見在2000bp左右有一特異條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。2. 4TA克隆獲得重組載體pMD19-T-BjPERKl :將2. 2中的擴增做3個20 μ L反應(yīng)體系，電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至pMD19-T載體得重組載體pMD19-T-BjPERKl，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR篩選，將含重組載體PMD19-T-BJPERK1的陽性DH5a菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。2. 5測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致。2. 6重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl的構(gòu)建構(gòu)建方法如圖4所示，將
2.4含重組載體pMD19-T-BjPERKl的陽性DH5 a菌液擴大培養(yǎng)，并采用普通質(zhì)粒提取試劑盒的方法提取菌液中的重組質(zhì)粒pMD19-T-BjPERKl ;將實驗室保存的含有植物表達質(zhì)粒PCAMBIA1302的DH5 a菌種擴大培養(yǎng)，并用同樣的方法提取質(zhì)粒pCAMBIA1302。將提取的pMD19-T-BjPERKl質(zhì)粒和pCAMBIA1302質(zhì)粒分別用Bgl II酶和BstE II酶雙酶切，參照酶的說明書兩種質(zhì)粒各做2個50μ L酶切體系。酶切后電泳，并切下pMD19-T-BjPERKl質(zhì)粒的小片段和PCAMBIA1302質(zhì)粒的大片段，利用膠回收試劑盒回收。用T4DNA連接酶連接小片段和大片段(連接體系為小片段7 μ L，大片段I μ L，T4DNA連接酶I μ L，10XT4DNA LigaseBufferl μ L)至少24小時，然后利用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a ;PCR篩選陽性克隆，再進行測序驗證，得到序列完全正確的重組表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl及含該重組表達載體的大腸桿菌。2. 7pCAMBIA1302-BjPERKl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌從2. 6中含PCAMBIA1302-B jPERKl載體的菌株中提取重組質(zhì)粒，用液氮冷激法轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌6￥3101，方法為@20(^ L根瘤農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中加入2μ g (5-10μ L)重組質(zhì)粒DNA,冰浴5min,然后轉(zhuǎn)至液氮中冷凍8min !②迅速與37°C水浴中溫浴5min后,力口Λ 800 μ L LB液體培養(yǎng)基③28°C、250rpm預(yù)培養(yǎng)4_5h，然后涂布于含有Kan (50mg/l)、Gent (50mg/l)的LB平板，28°C培育24-28小時后可出現(xiàn)菌落；④挑取菌體做菌體PCR鑒定，確定正確后保存于_70°C，即為植物遺傳轉(zhuǎn)化的工程菌株。
實施例3 :擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化I主要試劑植物基因組DNA提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。2擬南芥的培養(yǎng)及農(nóng)桿菌侵染實驗①取野生型擬南芥種子，用75%乙醇消毒Imin后無菌水清洗；再用5%NaC10滅菌IOmin,無菌水清洗5次，去盡NaClO殘留液。加一定量無菌水，于4°C條件下春化3_4天；②將春化3-4天的擬南芥種子在MS空白培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)7天，待長出幼苗，移栽至蛭石培養(yǎng)基(蛭石營養(yǎng)土 珍珠巖=3:1:1)，1/2MS液體培養(yǎng)基澆灌；③待植物培養(yǎng)至初生花序10-15cm，次生花序剛剛形成花芽狀時，去除初生花序；培養(yǎng)至可進行侵染實驗；④將實驗例2步驟2. 7中制備好的已轉(zhuǎn)化pCAMBIA1302-BjPERKl質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液擴大培養(yǎng)，即在轉(zhuǎn)化前I天晚上轉(zhuǎn)入大瓶過夜培養(yǎng)；至菌液濃度為0D600=2. O ;離心，棄上清，將農(nóng)桿菌沉淀懸浮于約3倍體積的滲透培養(yǎng)液中，使0D600在O. 8左右；⑤將植物的地上部分浸入農(nóng)桿菌懸浮液中侵染5分鐘；用保鮮膜將侵染過的植物(T0代植物)罩起來以保持濕度，置培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)12小時后正常條件培養(yǎng)；2-3天揭去保鮮膜，7天后可澆水；并定期侵染幾次；⑥繼續(xù)培養(yǎng)至植物成熟，收種子(Tl代)。MS培養(yǎng)基由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質(zhì)、激素等按一定比例組成。MS培養(yǎng)基作為目前使用最廣的離體細胞培養(yǎng)基，由于其中無機鹽濃度較高，為外植體的生長提供了足夠的礦質(zhì)營養(yǎng)并能使愈傷組織加速生長。為便于溶液配制及減小誤差，先按大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質(zhì)配制一定體積的母液。待用時再按一定比例稀釋混合。3擬南芥轉(zhuǎn)基因純合體的篩選Tl代種子經(jīng)消毒、滅菌和春化處理后均勻地涂布在含有潮霉素(25mg/L)抗生素的MS培養(yǎng)基上，至人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察幼苗的生長狀況。10-12天后明顯可以觀察到非轉(zhuǎn)基因擬南芥只能長出2片子葉、沒有真葉、根非常短，而轉(zhuǎn)基因擬南芥長出2-4片真葉、根長，于是將轉(zhuǎn)基因苗10株移栽至蛭石培養(yǎng)基中，存活2株且成熟后分別收取種子(T2代)并命名為T2-1和T2-2種子。期間用基因組提取試劑盒提取2株植物葉片的基因組DNA，以基因組DNA為模板，做PCR檢測驗證是否為轉(zhuǎn)基因擬南芥，反應(yīng)體系為20 μ1:體系為ddH207. 4μ L，Premix Ex TaqlOy L，模板 I μ L，上下游引物(BjPERKl-Bgl ^PBjPERKl-Bst)各 O. 8μ L。PCR 程序為94 °C 4min，94°C 40s,60 °C 40s,72 °C 2min，32 個循環(huán)；72°C 延伸IOmin。PCR結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測為陽性。將T2-1和T2-2種子按Tl代種子方法分別播種，觀察幼苗生長狀況，轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因比例均為3:1，然后將轉(zhuǎn)基因植株移栽蛭石中并當(dāng)種子成熟后分別收集每一株的種子(T3代種子)，隨機挑選10株的T3代種子并各取部分種子按Tl代種子方法進行播種，其中有2株的T3代種子全部生長為轉(zhuǎn)基因植株，由此判斷此2株的T3代種子為純合體，將這2株的T3代種子保存，并分別命名為Τ3-1、Τ3-2，它們將用于后續(xù)的抗逆性實驗。實施例4 :純合體擬南芥的抗鹽性實驗I鹽脅迫下BjPERKl基因?qū)M南芥發(fā)芽率的影響
1.1方法將野生型WT種子和實驗例3獲得的轉(zhuǎn)基因型種子T3-1、T3-2經(jīng)消毒、滅菌和春化處理后均勻地涂布在含O和IOOmM NaCl的MS培養(yǎng)基上，觀察野生型和轉(zhuǎn)基因型種子在不含和含NaCl的條件下的生長狀況。1. 2結(jié)果如圖5所示，在不含NaCl的MS培養(yǎng)基上，野生型和轉(zhuǎn)基因型種子的發(fā)芽率無明顯差別，播種后第一天發(fā)芽率均在50%左右，第二天則全部發(fā)芽；而在含IOOmM NaCl的MS培養(yǎng)基上，野生型則不如轉(zhuǎn)基因型種子發(fā)芽率高，如圖6所示，播種后I天，野生型種子無發(fā)芽，轉(zhuǎn)基因型均有部分發(fā)芽，播種后第2-4天野生型發(fā)芽率不如轉(zhuǎn)基因型。由此說明BjPERKl基因有助于提高植物在鹽脅迫下的發(fā)芽率，即提高了植物的抗逆性。2鹽脅迫下BjPERKl基因?qū)M南芥根的生長的影響2.1方法將野生型WT種子和實驗例3獲得的轉(zhuǎn)基因型種子T3-1、T3-2經(jīng)消毒、滅菌和春化處理后均勻地涂布在含0、100mM、150mM的NaCl的MS培養(yǎng)基上生長10天后觀察野生型和轉(zhuǎn)基因型擬南芥根的生長狀態(tài)。2. 2結(jié)果如圖7所示，在不含NaCl的MS培養(yǎng)基上，野生型和轉(zhuǎn)基因型擬南芥的根的生長無明顯差別，均在6. 5cm左右；在含NaCl的MS培養(yǎng)基上，根的生長均受到抑制，且NaCl的濃度越高抑制越強，但明顯地，野生型擬南芥的根比轉(zhuǎn)基因型的短。圖8所示為野生型和轉(zhuǎn)基因型擬南芥的根的照片，明顯可以看到在鹽脅迫下，野生型擬南芥的根比轉(zhuǎn)基因型短。根短直接影響植物的營養(yǎng)吸收，從而影響植物的生長狀況，由此說明BjPERKl基因的超表達有助于植物在高鹽下根的生長，即提高了植物的抗逆性。3鹽脅迫下BjPERKl基因?qū)M南芥的存活率的影響3.1方法將野生型WT種子和實驗例3獲得的轉(zhuǎn)基因型種子T3-1、T3-2經(jīng)消毒、滅菌和春化處理后均勻地涂布在含300mM的NaCl的MS培養(yǎng)基上生長2周后移栽至無鹽脅迫的蛭石中繼續(xù)培養(yǎng)使恢復(fù)生長，12天后觀察仍然存活的植株數(shù)量(植株全部白化被認為死亡)。3. 2結(jié)果如圖9所示，高鹽脅迫生長2周后于正常狀態(tài)下培養(yǎng)12天后，野生型植株死亡率高，存活率不到5%，而轉(zhuǎn)基因型的存活率達到35%以上，具有顯著性差異。說明BjPERKl基因的超表達有助于植物在高鹽下的生長，即提高了植物的抗逆性。綜上所述，B jPERKl基因具有提高植物抗逆性的作用，促進植物在逆境下的適應(yīng)能力和生長能力。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本 發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.莖瘤芥抗逆基因BjPERKl，其特征在于其核苷酸序列為SEQID NO.1所示，全長序列2252bp，最大開放閱讀框1923bp，5’端非編碼區(qū)有99bp，3’端非編碼區(qū)有230bp。
2.莖瘤芥抗逆基因蛋白BjPERKl，其特征在于其氨基酸序列為SEQID NO. 2所示。
3.莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl，其特征在于由權(quán)利要求1所述的抗逆基因BjPERKl的最大開放閱讀框序列與植物表達載體PCAMBIA1302 構(gòu)成。
4.權(quán)利要求3所述的莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的重組植物表達載體PCAMBIA1302-BJPERK1的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 (1)莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的克隆 A.BjPERKl基因5’端未知序列擴增 根據(jù)序列SEQ ID NO. 3設(shè)計兩個反向巢式引物BjPERKl-AOUT :5’ -AGTCCTTTAGCAGATCCAAGAGCA-3’BjPERKl-AIN :5’-AATCTGGTGCTCCATTCCATTGTA-3’ ； 提取莖瘤芥莖的總RNA，然后通過5’ -Full RACE Kit試劑盒方法獲得cDNA第一鏈并進行巢式PCR擴增，產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，篩選并測序獲得5’端序列； B.BjPERKl基因3’端未知序列擴增 根據(jù)序列SEQ ID NO. 3設(shè)計兩個正向巢式引物BjPERKl-SOUT :5’-TGCTTGTCTATGAGTTTGTTCCTA-3’BjPERKl-SIN :5’-GCAATCCTAAAATCATTCACCGTG-3’ 提取莖瘤芥莖的總RNA，然后用接頭引物和反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)獲得cDNA第一鏈并進行巢式PCR擴增，產(chǎn)物連接到PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，篩選并測序獲得3’端序列； C.BjPERKl基因全長序列擴增 將所述獲得的5’端序列、3’端序列與序列SEQ ID NO. 3拼接，并從5’端非翻譯區(qū)和3’端非翻譯區(qū)設(shè)計一對引物上游引物 BjPERKl-F :5’ -CGTGTCTCCTCTCTCCTCCTGCTT-3’下游引物 BjPERKl-R :5’ -AACCTTCAATTTCTCTCCCATCTG-3’ ； 再以步驟B中的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，篩選并測序獲得BjPERKl基因全長序列； (2)植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl的構(gòu)建 根據(jù)BjPERKl基因的最大開放閱讀框序列設(shè)計一對引物，并分別引入酶切位點Bgl II和BstE II序列上游引物 BjPERKl-Bgl :5’ -AGATCTATGTCCTCGGCGCCGTCT-3’ ；下游引物 BjPERKl-Bst :5’ -GGTAACCTTACAAAAAAGGGCCACTAT-3’ ； 再以步驟(I) B中的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物連接到pMD 19-T載體得重組質(zhì)粒pMD19-T-BjPERKl，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞；提取質(zhì)粒pMD19-T_BjPERKl和PCAMBIA1302，并用Bgl II和BstE II雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化，篩選并測序驗證，植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERKl 構(gòu)建成功。
5.如權(quán)利要求4所述的莖瘤芥抗逆基因BjPERKl的重組植物表達載體PCAMBIA1302-BJPERK1的構(gòu)建方法，其特征在于，所述接頭引物的序列為5’ -ATTCTAGAGGCC GAGGCGGCCGACATG-d ⑴ 30MN-3'，其中 N=A, G, C 或 T，M=A, G 或 C ;所述反轉(zhuǎn)錄酶為 M-MLV 酶。
6.莖瘤芥抗逆基因BjPERKl在提高植物耐鹽特性的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了莖瘤芥受體蛋白激酶類基因BjPERK1的核酸序列和氨基酸序列，以及植物表達載體和構(gòu)建方法。本發(fā)明所構(gòu)建的植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERK1是由BjPERK1基因插入到pMD19-T，經(jīng)Bgl II和BstEII雙酶切后連接到pCAMBIA1302的Bgl II和BstE II位點而得到的重組質(zhì)粒。該植物表達載體用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，BjPERK1基因在CaMV35S啟動子的啟動下超量表達，大量合成BjPERK1蛋白，從而提高植物耐鹽性。
文檔編號C12N15/66GK103014035SQ20121059229
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月29日
發(fā)明者向瀏欣, 蔡應(yīng)繁, 付于銀, 劉吉軍, 冉燕子, 王秋娟, 王小艷 申請人:重慶郵電大學(xué)