專利名稱：一種頭孢菌素c?；竿蛔凅w及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)制藥領(lǐng)域，具體地涉及一種頭孢菌素C?；竿蛔凅w及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，由于頭孢菌素類抗生素過(guò)敏反應(yīng)小，對(duì)P -內(nèi)酰胺酶較穩(wěn)定，具有抗菌譜廣、療效好、毒低、同其他抗生素?zé)o交叉耐藥性、與青霉素較少產(chǎn)交叉過(guò)敏反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為抗感染最重要的有效藥物。研究發(fā)現(xiàn)，頭孢菌素的抗菌部為其母核7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA),因此作為合成半合成頭孢菌素重要中間體，7-ACA的研究生產(chǎn)顯得至關(guān)重要。頭孢菌素C (Cephalosporin C，CPC)經(jīng)化學(xué)法或是酶法裂解得到7-ACA?；瘜W(xué)法的反應(yīng)條件較為苛刻，反應(yīng)過(guò)程必須在超低溫條件下進(jìn)行，而且涉及到大量有毒有害的有機(jī)溶劑，會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染等問(wèn)題。因此，對(duì)環(huán)境友好的酶法開始成為工業(yè)生產(chǎn)的新方向。目前使用兩步酶法制備7-ACA在生產(chǎn)成本和環(huán)境保護(hù)方面有優(yōu)勢(shì)，但是從頭孢菌素C到7-ACA的轉(zhuǎn)化率與化學(xué)法相比要低，而且DAAO催化反應(yīng)難以控制。頭孢菌素C酰化酶(CPC acylase)可以直接把頭孢菌素C轉(zhuǎn)變成7-ACA (不經(jīng)過(guò)GL-7-ACA等中間產(chǎn)物)，利用頭孢菌素C?；干a(chǎn)7-ACA的一步酶法既具有化學(xué)法的優(yōu)勢(shì)(高轉(zhuǎn)化率和純度)也具有兩步酶法的優(yōu)勢(shì)(高經(jīng)濟(jì)性和環(huán)境保護(hù))。但是野生型的頭孢菌素?；富盍^低，不能勝任工業(yè)化生產(chǎn)的需要。本發(fā)明提供一種高酶活頭孢菌素C?；钢苽浞椒ā?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種頭孢菌素C?；竿蛔凅w及其編碼基因。本發(fā)明另一目的是提供頭孢菌素C?；竿蛔凅w的制備方法。本發(fā)明又一目的是提供頭孢菌素C?；竿蛔凅w及其編碼基因在制備7-氨基頭孢烷酸中的應(yīng)用。所述頭孢菌素C?；竿蛔凅w，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO. 4衍生的氨基酸序列。所述頭孢菌素C?；竿蛔凅w基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。與野生型的頭孢菌素C?；赶啾?，本發(fā)明的頭孢菌素C?；竿蛔凅w具體的氨基酸序列的改變是K171S (第171位賴氨酸變?yōu)榻z氨酸)，M270W (第270位蛋氨酸變?yōu)樯彼?，I314S (第314位異亮氨酸變?yōu)榻z氨酸)，L535T (第535位亮氨酸變?yōu)樘K氨酸)。所述頭孢菌素C?；竿蛔凅w的篩選方法，包括以下步驟(1)由產(chǎn)頭孢菌素C?；窩PCA假單孢桿菌(Pseudomonas sp. )SE83，擴(kuò)增CPCA的編碼基因adfQ ；(2)采用易錯(cuò)PCR技術(shù)，以CPCA的編碼基因adfQ為模板，擴(kuò)增獲得CPCA突變體基因；(3)將步驟(2)所得易錯(cuò)PCR產(chǎn)物及表達(dá)質(zhì)粒pET30a用Nde I和Xho I雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布至LB (Kan)平板，即得構(gòu)建好的重組CPCA基因突變庫(kù)；(4)將LB (Kan)平板上長(zhǎng)出的菌落——對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)入LB (Kan)平板和LB (Kan、IPTG、CPC-Na)平板上，轉(zhuǎn)板后將平板置37 °C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，LB (Kan)平板培養(yǎng)8h后取出放入4°C冰箱保存，LB (Kan、IPTG、CPC-Na)平板繼續(xù)25°C培養(yǎng)36h，然后分別破菌，測(cè)定CPCA酶活力，挑選酶活力最強(qiáng)的一株，并測(cè)定其基因序列，分別為SEQ ID N0.3所示的基因序列和SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。其中，所述頭孢菌素C?；妇哂蠸EQ ID NO.1所示的基因序列和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供含有所述基因的載體。含有所述基因或所述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面提供所述頭孢菌素C?；竿蛔凅w的制備方法，包括以下步驟(I)PCR擴(kuò)增上述頭孢菌素C酰化酶突變體基因；

(2 )將步驟(I)所得PCR產(chǎn)物連接表達(dá)載體pET_30b ；(3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得表達(dá)產(chǎn)物。其中，步驟(I)中所用引物為正向引物5'-AAA ( 'A TA / ( i ACGATGGCGGCCA-3'；反向引物5' -AAA CTCGAG TCAATGATGATGATGATGATGATGGGCCGGGACGAGTTCCTGCGAG-3'。其中所述過(guò)表達(dá)的頭孢菌素C酰化酶C-端含有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽。進(jìn)一步，采用親和層析法分離純化表達(dá)產(chǎn)物，分離純化包括步驟I)以NTA介質(zhì)填柱，用2倍柱體積的去離子水洗滌，接著加NiS04溶液至NTA介質(zhì)結(jié)合度達(dá)到飽和，用5倍柱體積的NAT-O緩沖液(20mM Tris-HCl pH7. 9,0. 5M NaCl)洗柱；2)將含有表達(dá)的頭孢菌素C?；傅拇竽c桿菌破碎菌體離心后得到的上清加入到Ni2+-NTA樹脂柱中，用5倍柱體積的NAT-1緩沖液卿NAT-O緩沖液含有80mmol/L咪唑)洗滌介質(zhì)以去除雜蛋白，最后用含有300mmol/L咪唑的NAT-O緩沖液洗脫帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的頭孢菌素C酰化酶，并做SDS-PAGE分析。本發(fā)明的另一方面提供一種7-氨基頭孢烷酸的制備方法，其是通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)頭孢菌素C?；富蚣捌渫蛔凅w，然后對(duì)表達(dá)的頭孢菌素C酰化酶進(jìn)行分離純化，在有底物頭孢菌素C的情況下，制備7-ACA。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果本發(fā)明利用蛋白質(zhì)親和色譜技術(shù)，利用帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的頭孢菌素C酰化酶能與蛋白純化樹脂N1-NTA層析柱特異性結(jié)合的原理，再用含有低濃度的咪唑洗去雜蛋白，保留在N1-NTA層析柱上的6XHis-XK，從而簡(jiǎn)化6 XHis-XK分離純化步驟。本發(fā)明涉及固定化酶技術(shù)，帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的頭孢菌素C?；概c蛋白純化樹脂N1-NTA層析柱特異性結(jié)合，在洗去雜蛋白后，N1-NTA層析柱保留特異性成分一頭孢菌素C酰化酶，用此酶制備7-氨基頭孢烷酸。
本發(fā)明涉及頭孢菌素C?；竿蛔凅w，在使用該突變體轉(zhuǎn)變CPC — >7-ACA酶促反應(yīng)過(guò)程中，轉(zhuǎn)化率達(dá)99%，得率達(dá)96%，而野生型轉(zhuǎn)化率只有39%，得率只有32%。


圖1為PCR技術(shù)擴(kuò)增頭孢菌素C?；富蚱?，長(zhǎng)度2. 3kb ；圖2為SDS-PAGE分析純化前后頭孢菌素C?；?①為純化前②為純化后；圖3為HPLC分析頭孢菌素C?；该复俜磻?yīng)；①為頭孢菌素?；笇㈩^孢菌素C轉(zhuǎn)化為7-氨基頭孢烷酸的HPLC圖譜；②為頭孢菌素CHPLC圖譜；③為7-氨基頭孢烷酸HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1頭孢菌素C?；富虻墨@得Wlug假單孢桿菌(Pseudomonas sp. )SE83基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，按SEQID NO.1的序列設(shè)計(jì)正向引物CPC-F為5' -AAA ('A TA TG ACGATGGCGGCCA-3';反向引物5' -AAA ( TC V iA (/ TCAATGATGATGATGATGATGATGGGCCGGGACGAGTTCCTGCGAG-3'。其中斜體字母部分分別為酶切位點(diǎn)NdeI和XhoI。PCR反應(yīng)在50 ii L總體積中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在94°C變性5min后開始循環(huán)，然后94°C變性50s，58°C退火lmin，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)后，再于72°C延伸lOmin。取3 y L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示。取IOOy L PCR產(chǎn)物 做瓊脂糖凝膠電泳，按照膠回收試劑盒的步驟回收目的片段。實(shí)施例2野生型頭孢菌素C?；富虮磉_(dá)載體的構(gòu)建實(shí)施例1中PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切消化后，與用相同內(nèi)切酶消化的pET-30a質(zhì)粒(購(gòu)自Novagen公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建的載體被稱為pET_CPCA，然后用連接產(chǎn)物pET-CPCA混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5-a (購(gòu)自promega公司)，并進(jìn)行序列測(cè)定提取轉(zhuǎn)化菌體庫(kù)的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL (DE3)菌株(購(gòu)自Novagen公司)。實(shí)施例3易錯(cuò)PCR擴(kuò)增頭孢菌素C酰化酶基因利用TaqDNA聚合酶不具有3' -5 /校對(duì)功能的性質(zhì)，在高鎂離子濃度(5mmol/L-9mmol/L)和不同濃度dNTP的濃度下(1. 5mmol/L-3. 5mmol/L)，來(lái)控制隨機(jī)突變的頻率，向目的基因中引入隨機(jī)突變，構(gòu)建突變庫(kù)。實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)的突變率約為0. 6%。易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系(100 ill):
IOxbuffer10f.1l
dATP2p.1
dTTP2pi
dCTP2‘ul
dGTP2^il
MgCl26μl
上游引物4μl
下游引物4μl DNA模板(實(shí)施例1PCR片段)4μl
Taq DNA 聚合酶lul
CidH2O63μl
總體積1 OOμlPCR 程序?yàn)?6°C預(yù)變性 4min, 94°C變性 lmin,56°C退火 lmin,75°C延伸 lmin40s,反應(yīng)45個(gè)循環(huán)，最后75 °C延伸15min。采用膠回收方法回收PCR產(chǎn)物。取5 產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，_20°C保存?zhèn)溆谩?shí)施例4突變體的構(gòu)建實(shí)施例3中PCR產(chǎn)物(DNA改組后的混合物)經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切消化后，與用相同內(nèi)切酶消化的pET-30a質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建的載體被稱為pET-CPCAM，然后用連接產(chǎn)物pET-CPCAM混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5-a，構(gòu)建轉(zhuǎn)化菌體庫(kù)。實(shí)施例5構(gòu)建表達(dá)突變庫(kù)及高酶活突變體的篩選提取轉(zhuǎn)化菌體庫(kù)的質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL (DE3)菌株，獲得轉(zhuǎn)化子約500株，構(gòu)建表達(dá)突變體庫(kù)。挑取突變菌株至含150 u lLB/kan培養(yǎng)基的96孔板中30°C、150rpm培養(yǎng)，待OD值達(dá)0. 6-0. 8，加入IPTG (終濃度0. 2M)，繼續(xù)培養(yǎng)36h，收集菌體。超聲破菌得上清，并進(jìn)行酶活及蛋白含量測(cè)定。檢測(cè)酶活力最高的菌株，并挑選其克隆，并提取質(zhì)粒，測(cè)定與頭孢菌素C?；笇?duì)應(yīng)的基因序列。測(cè)定的基因序列為SEQ ID NO. 3所示，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為SEQ ID NO. 4所示。頭孢菌素C?；傅拿富顧z測(cè)(I)離心收集菌體，用0. lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)洗滌后低溫超聲破碎，離心取適量上清液加入100 U I底物頭孢菌素C (CPC) (0. lmol/L Tris-HCl緩沖液配制)，并用緩沖液補(bǔ)加至200iil，37°C反應(yīng)5分鐘。(2)終止條件取20 ill反應(yīng)液，加入500 U I終止液(20%乙酸與0. 05M NaOH)。(3)終止后處理12000rpm離心5min，取500^1溶液加入樣品瓶中。(4)HPLC進(jìn)樣條件采用C18柱(4. 6mm*150mm)，柱溫30°C，進(jìn)樣體積lOyl，檢測(cè)吸收峰254nm,進(jìn)樣流量lml/min。進(jìn)樣時(shí)間20min。(5)流動(dòng)相0.1M檸檬酸(每IL加入Ig辛烷磺酸鈉)88%:乙腈12%，流速為Iml/min，進(jìn)樣體積為4iU，檢測(cè)吸光度為254nm，C18柱。(6)酶活單位定義為每分鐘催化生成I y mol7-ACA所需的酶量。 表I野生型CPC?；负透呙富頒PC?；竿蛔凅w的酶活
權(quán)利要求
1.一種頭孢菌素C酰化酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO. 4衍生的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述頭孢菌素C?；竿蛔凅w的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO. 3所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述載體的宿主細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1所述的頭孢菌素C酰化酶突變體的制備方法，包括以下步驟 (I)PCR擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述頭孢菌素C?；竿蛔凅w基因； (2 )將步驟(I)所得PCR產(chǎn)物連接表達(dá)載體pET-30b ； (3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得表達(dá)產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的制備方法，其特征在于，所用引物為 正向引物5' -AAACATATGACGATGGCGGCCA-3'； 反向引物 5' -AAACTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGATGGGCCGGGACGAGTTCCTGCGAG-3'。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述頭孢菌素C?；竿蛔凅w采用親和層析法進(jìn)行分離純化。
9.權(quán)利要求1所述頭孢菌素C?；竿蛔凅w、權(quán)利要求2或3所述基因在制備7-氨基頭孢烷酸中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，以頭孢菌素C為底物，采用一步酶法制備7-氨基頭孢燒酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種頭孢菌素C?；竿蛔凅w及其編碼基因與應(yīng)用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO.4衍生的氨基酸序列。本發(fā)明的頭孢菌素C?；竿蛔凅w，在使用該突變體轉(zhuǎn)變CPC→7-ACA酶促反應(yīng)過(guò)程中，轉(zhuǎn)化率達(dá)99%，得率達(dá)96%。
文檔編號(hào)C12N9/80GK103060298SQ20121059178
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者徐斌, 鄭輝, 汪本助 申請(qǐng)人:安徽豐原基因工程技術(shù)有限公司