專利名稱：來源于灰蓋鬼傘菌的漆酶2基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物基因工程領(lǐng)域，涉及一種來源于灰蓋鬼傘菌(Coprinopsiscinereaokayama)的漆酶2基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
漆酶(EC1. 10. 3. 2)是一種含銅的氧化還原酶，屬于氧化酶的藍銅家族(Eur JBiocheml87:341-352)。漆酶的應(yīng)用范圍很廣，目前研究它的應(yīng)用主要集中在它降解各種化工染料(J Ind Microbiol Biotechnol31:127-132)、芳香族類化合物(Microbial CellFactories5:31)以及二酌·、多酌■類化合物(Process Biochemistry45:507-513)的功能。除此之外，漆酶在不同的物種發(fā)揮不同的功能在昆蟲中，它們參與甲殼的硬化；在植物中，參與細胞壁形成，還與木質(zhì)素化和去木質(zhì)素有關(guān)；在芽孢桿菌中，則是和抗紫外線的孢子組裝有關(guān)；在一些植物致病性真菌利用這類酶免除植物抗毒素和鞣酸的作用。眾所周知，漆酶給工業(yè)生產(chǎn)方面帶來了巨大的貢獻。大量的漆酶基因從植物(J Chem Soc43 :472)、動物(萬云洋，博士論文，武漢大學)和微生物(Microbiologyl48 :4003 - 4014)中分離出來,進行了系統(tǒng)的研究。在NCBI數(shù)據(jù)庫中，收集了很多微生物的全基因組的信息，其中編碼蛋白的序列都被注釋了。但是大部分的蛋白的生化功能和生理功能都是未知的。因此研究注釋蛋白的功能可以完善這些酶學，并運用到工業(yè)應(yīng)用中去?；疑w鬼傘菌屬于層菌綱家族，是亞洲很受歡迎的藥用菌類。它的化學成分已經(jīng)研究的相當透徹。雖然灰蓋鬼傘菌有8個漆酶基因，但是來自灰蓋鬼傘菌的漆酶2的生理生化特性研究和對染料的脫色效果的研究目前還沒有報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種來源于灰蓋鬼傘菌(Coprinopsiscinereaokayama)的漆酶2基因及其應(yīng)用。即通過化學合成方法得到所述的漆酶2基因，并將其應(yīng)用于真核生物中進行表達和純化，研究其生理生化特性和對甲基橙、結(jié)晶紫和孔雀石綠的脫色效果。所述的漆酶2基因，其核苷酸序列如SEQ ID Nol所示，它是根據(jù)畢氏酵母密碼子偏愛通過化學合成方法制得的。即采用大量重疊的引物通過兩步PCR進行全基因的合成(PTDS) (Nucleic Acids Research, 2004，32 :e98)。該方法是通過重疊延伸獲得合成基因的片段，再通過最外側(cè)的引物將全長的基因擴增得到。該方法的一個明顯優(yōu)勢就是不需要對引物進行磷酸化處理。而且通過高通量的DNA合成儀器，可以較為便利地獲得大量的引物。所述的漆酶2基因，其具體合成方法如下1、根據(jù)畢氏酵母密碼子偏愛設(shè)計引物設(shè)計長度大概為60mer左右的覆蓋整個漆酶2基因的寡核苷酸的序列50個，作為引物。利用PCR進行漆酶2基因擴增，在100 μ I反應(yīng)體系中，Ρ2 Ρ29共48個引物的添加量為2ng，外側(cè)引物Pl和P50添加量為30ng,擴增條件為94°C預熱Imin ；94°C 30s, 52°C 30s，72°C1. 5min,72°C lOmin，使用的 Taq DNA 聚合酶為 KOD FX taq 酶(Toyobo 公司，日本)，共30個循環(huán)。PCR結(jié)束后，1%瓊脂糖膠回收片段，取10 μ I直接與T/Α克隆載體相連(大連寶生物公司)。4°C連接過夜，高效轉(zhuǎn)化于DH5a感受態(tài)中，獲得長度為1500bp的陽性克隆，即為本發(fā)明的漆酶2基因，其核苷酸序列如SEQ ID Nol所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQID No2 所示。將上述制得的漆酶2基因轉(zhuǎn)入真核生物細胞中。即將該漆酶2基因直接與真核表達載體 PYM7909 (Molecular Biology R印ort，2012Apr; 39 (4) : 3807-14)相連，經(jīng)過 DH5 α克隆過的環(huán)形質(zhì)粒單酶切使其線性化，取約I μ I的線性DNA與80 μ I畢赤酵母感受態(tài)細胞混合后進行點擊轉(zhuǎn)化，然后涂布于固體SD山梨醇培養(yǎng)基(20g/L瓊脂，20g/L葡萄糖，146g/L山梨醇，SD)上，28°C繼續(xù)培養(yǎng)3天后獲得白色菌落。挑取經(jīng)測活呈陽性的畢赤酵母進行細胞外分泌表達純化，即獲得純化后的漆酶2基因蛋白。然后對其進行酶動力學特性分析和生理生化特性分析。實驗結(jié)果證明，本發(fā)明合成的漆酶2基因是一類應(yīng)用非常廣泛的生物用酶，通過克隆，可以高效人工合成，通過對該基因真核表達和純化，可以將其應(yīng)用于染料脫色工業(yè)生產(chǎn)中。


圖1為本發(fā)明的以pYM7909質(zhì)粒構(gòu)建DNA表達單元的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明漆酶2基因蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中M為蛋白分子量MARKER，I為2總蛋白，2為用硫酸按沉淀后的總蛋白，3為用N1-NTA純化柱純化后的漆酶蛋白，4為去糖基化后的蛋白。圖3為本發(fā)明漆酶2基因的最適溫度、最適pH及溫度和pH的穩(wěn)定性結(jié)果,A為最適pH值，B為pH穩(wěn)定性，C為最適溫度，D為溫度穩(wěn)定性。圖4為以不同濃度的ABTS作底物，本發(fā)明的漆酶2基因?qū)谆華、結(jié)晶紫B和孔雀石綠C的脫色效果。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說明，均購自西格瑪一奧德里奇(Sigma — Aldrich)公司。本發(fā)明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學出版社。)實施例1根據(jù)畢氏酵母密碼子偏愛化學合成漆酶2基因
本發(fā)明根據(jù)來源于灰蓋鬼傘菌的漆酶2基因(CcLCC2，GenBank BK004112. 1)采取 連續(xù)延伸PCR法Nucleic Acids Research, 2004，32，e98按照畢氏酵母密碼子偏愛合成 漆酶2基因(CcLCC2)，設(shè)計50對引物用于該漆酶2基因的人工合成。所設(shè)計的引物如下Pl:Tm=54, 60mer GGATCCATGATTGGTCCTTCCACCAACCTTGTTGTTGCCAACAAGGTCATCGCT CCTGATP2:Tm=54, 60mer GCTGAGTAGCACCAGCAAGAACAGCACTTCTGGAGAAGCCATCAGGAGCGATGA CCTTGTP3:Tm=54, 60mer GGCTTCTCCAGAAGTGCTGTTCTTGCTGGTGCTACTCAGCCTACTGTTCAGTTT CCTGGTP4:Tm=54, 60mer TGATAGCGAAGAAGGAGTTCTTGTTGCCTTGGATGACAGGACCAGGAAACTGAA CAGTAGP5:Tm=54, 60mer CCTGTCATCCAAGGCAACAAGAACTCCTTCTTCGCTATCAACGTCATCGATGCT CTCACTP6:Tm=54, 60mer CATGCCAGTGGATAGAGGTGGTTCTCAGCATAGTAGGATCAGTGAGAGCATCGA TGACGTP7:Tm=54, 60mer GATCCTACTATGCTGAGAACCACCTCTATCCACTGGCATGGTATGTTCCAGAGA GGCACTP8:Tm=54, 60mer TTGGACACTGAGTGACACCAGCAGGACCATCAGCCCAAGCAGTGCCTCTCTGGA ACATACP9:Tm=54, 60mer GCTTGGGCTGATGGTCCTGCTGGTGTCACTCAGTGTCCAATCTCTCCAGGTCAC TCCTTCP10:Tm=54, 60mer AGAAGGTGCCAGCCTGATTCAGAGCCTGGAACTTGTACAGGAAGGAGTGACCT GGAGAGAPll:Tm=54, 60mer CTGTACAAGTTCCAGGCTCTGAATCAGGCTGGCACCTTCTGGTATCACTCTCA TCACGAGP12:Tm=54, 60mer AGACAACCATAGCACCTCTCAGACCGTCGCAGTACTGAGACTCGTGATGAGAG TGATACCP13:Tm=54, 60mer TCTCAGTACTGCGACGGTCTGAGAGGTGCTATGGTTGTCTACGATCCTGTTGA TCCACACP14:Tm=54, 60mer TGATGATAGTGGCTTCATTGTCGATGTCGTACAGGTTTCTGTGTGGATCAACA GGATCGTP15:Tm=54, 60mer AGAAACCTGTACGACATCGACAATGAAGCCACTATCATCACCCTGGCTGACTG GTATCATP16:Tm=54, 60mer AGTCAGGAGTAGGAACCAGACCAGCAGAAGGAGCAGGAACATGATACCAGTCA GCCAGGGP17:Tm=54, 60mer GTTCCTGCTCCTTCTGCTGGTCTGGTTCCTACTCCTGACTCTACTCTGATCAA TGGCAAAP18:Tm=54, 60mer TGACAGCAAGTGGAACAGTTGGACCACCAGCGTATCTGCCTTTGCCATTGATC AGAGTAG
權(quán)利要求
1.一種按照畢氏酵母密碼子偏愛優(yōu)化的來源于灰蓋鬼傘菌Coprinopsis cinereaokayama的漆酶2基因，其核苷酸序列如SEQ ID Nol所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的來源于灰蓋鬼傘菌的漆酶2基因，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
3.權(quán)利要求1所述的漆酶2基因在真核生物中的表達應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的漆酶2基因在真核生物中的表達應(yīng)用，其特征在于，將所述漆酶2基因與真核表達載體PYM7909連接，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌，進行電擊轉(zhuǎn)化。
5.權(quán)利要求1所述的漆酶2基因在染料脫色中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，挑取經(jīng)測活呈陽性的畢赤酵母進行細胞外分泌表達純化，以制備純化的漆酶2基因蛋白并用于分析其生理生化特征，然后對甲基橙、結(jié)晶紫和孔雀石綠染料進行脫色。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來源于灰蓋鬼傘菌的漆酶2基因及其應(yīng)用。所述的漆酶2基因含1500個堿基，編碼氨基酸500個；其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。將該漆酶2基因轉(zhuǎn)入畢氏酵母中可應(yīng)用于染料的脫色工業(yè)生產(chǎn)中。
文檔編號C12N9/02GK103045620SQ20121059233
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者田永生, 許晶, 彭日荷, 金曉芬, 韓洪娟, 韓靜, 王波, 王麗娟 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院