專利名稱：一種檢測(cè)裸子植物花粉管內(nèi)抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)裸子植物花粉管內(nèi)抗原的方法，特別涉及一種利用熒光免疫技術(shù)檢測(cè)裸子植物花粉管內(nèi)抗原的方法。
背景技術(shù)：
花粉管作為有花植物受精過程中雄性生殖單位的載體，攜帶和傳遞著精細(xì)胞到達(dá)胚珠，實(shí)現(xiàn)精卵結(jié)合，完成受精作用?；ǚ酃苁且环N典型的具頂端生長(zhǎng)特性且獨(dú)立存在的單倍體細(xì)胞，在體外生長(zhǎng)時(shí)呈現(xiàn)均一的柱狀極性生長(zhǎng)模式，因而被認(rèn)為是生物技術(shù)領(lǐng)域研究極性生長(zhǎng)的理想的細(xì)胞體系。另外，花粉管作為一個(gè)模式體系，對(duì)于深入研究細(xì)胞極性生長(zhǎng)，細(xì)胞間相互作用以及信號(hào)傳導(dǎo)也有重要意義。由于花粉管細(xì)胞壁主要由纖維素、胼胝質(zhì)、果膠質(zhì)等多糖類和一些蛋白質(zhì)類物質(zhì)組成，胞內(nèi)抗原的檢測(cè)定位受到胞壁物質(zhì)的限制，外源物質(zhì)很難進(jìn)入胞內(nèi)與抗原發(fā)生發(fā)應(yīng)。另外，對(duì)于一些蛋白質(zhì)抗原，由于在固定過程中很容易導(dǎo)致抗原失活，以及抗原抗體反應(yīng)過程中所需的時(shí)間溫度條件的限制，使得花粉管內(nèi)抗原檢測(cè)定位較難，且迄今還沒有有關(guān)裸子植物花粉管內(nèi)抗原檢測(cè)定位的行之有效的方法，導(dǎo)致與裸子植物相關(guān)的生物學(xué)研究相對(duì)被子植物而言比較滯后。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)裸子植物花粉管內(nèi)抗原的方法。
本發(fā)明提供的檢測(cè)裸子植物花粉管內(nèi)抗原的方法，包括以下步驟1)用含多聚甲醛的磷酸緩沖液將花粉管固定后，用含纖維素酶和離析酶的酶解液酶解裸子植物花粉管，再用質(zhì)量百分比濃度為0.2％-1％的TritonX-100或NP-40水溶液洗滌；2)將經(jīng)步驟1)處理的花粉管與抗待測(cè)抗原對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)，如檢測(cè)到熒光，則裸子植物花粉管內(nèi)含有該待測(cè)抗原并得到該待測(cè)抗原的定位情況。
步驟1)中，為了獲得更高的靈敏度和更高的信噪比，所述含多聚甲醛的磷酸緩沖液中，多聚甲醛的質(zhì)量百分含量是2-4％。
所述固定的時(shí)間可為1-2小時(shí)。
所述固定花粉管用的多聚甲醛的質(zhì)量百分比濃度優(yōu)選為2％，固定時(shí)間優(yōu)選為2小時(shí)。
所述含纖維素酶和離析酶的酶解液含有質(zhì)量百分比濃度為1.5-3％的纖維素酶，質(zhì)量百分比濃度為1.2％-2％的離析酶，pH5-6、15mM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)，400mM甘露醇，5mM氯化鈣和1μg·mL-1蛋白酶抑制劑。
所述蛋白酶抑制劑可為aprotinin，pepstatin A，chymostatin或leupeptin。
所述纖維素酶的質(zhì)量百分比濃度優(yōu)選為1.5％；所述離析酶的質(zhì)量百分比濃度優(yōu)選為1.2％。
所述酶解裸子植物花粉管的時(shí)間可為8-15分鐘，優(yōu)選為10分鐘。
所述TritonX-100的質(zhì)量百分比濃度優(yōu)選為0.2％。
所述纖維素酶可為市售的各種纖維素酶，優(yōu)選cellulase R-10；所述離析酶可為市售的各種離析酶，優(yōu)選macerozyme R-10。
步驟2)中，所述經(jīng)步驟1)處理的花粉管與抗待測(cè)抗原對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)是將經(jīng)步驟1)處理的花粉管轉(zhuǎn)移到多聚賴氨酸包被的載玻片上，用1-3％牛血清白蛋白溶液在室溫下封閉1-2小時(shí)，經(jīng)含0.2％-1％的TritonX-100或NP-40的磷酸緩沖液充分洗滌后，在抗待測(cè)抗原的一抗中0-4℃或室溫下孵育2-12小時(shí)，轉(zhuǎn)移到熒光標(biāo)記的抗IgG的二抗溶液中在室溫或37℃下孵育1-2小時(shí)，用含50％甘油的磷酸緩沖液封片，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
所述在一抗中孵育溫度優(yōu)選為4℃；所述在二抗中孵育溫度優(yōu)選為37℃，孵育時(shí)間優(yōu)選為1小時(shí)。
所述裸子植物可為白皮松、雪松，青扦，白扦等松杉綱裸子植物；優(yōu)選為松科裸子植物，特別優(yōu)選為白皮松和青扦。
所述磷酸緩沖液是以10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀配制的。本發(fā)明的方法可以用現(xiàn)有的已知抗原制備抗該抗原的一抗，或直接從商業(yè)途徑獲得該抗已知抗原的一抗，通過免疫熒光反應(yīng)檢測(cè)裸子植物花粉管內(nèi)有無該已知抗原。
本發(fā)明的方法中，多聚甲醛能快速固定花粉管內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA、質(zhì)膜等成分，而不破壞抗原。氯化鈣可以保護(hù)原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定性。纖維素酶可以酶解花粉內(nèi)壁的纖維素成分，而離析酶降解花粉內(nèi)壁中的果膠質(zhì)等組分，從而可部分降解內(nèi)壁，同時(shí)Triton X-100可進(jìn)一步透化細(xì)胞壁，使得抗原抗體充分結(jié)合。由于花粉管較小，將其黏附在多聚賴氨酸包被的載玻片上，可達(dá)到固定抗原，方便操作的目的。使用含50％甘油的磷酸緩沖液進(jìn)行封片，既可防止熒光快速淬滅，同時(shí)價(jià)格低廉節(jié)省材料。本發(fā)明利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)植物花粉管內(nèi)抗原的方法克服了由于花粉管壁而無法標(biāo)記胞內(nèi)抗原的障礙，同時(shí)優(yōu)化各種反應(yīng)條件，抗原抗體結(jié)合充分，標(biāo)記效果好，靈敏度高，掃描得到的圖象信噪比高，能真實(shí)而充分地反映抗原在花粉管內(nèi)的分布情況，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


圖1為在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察到的G-protein在青扦花粉管質(zhì)膜上的定位情況圖2為在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察到的G-protein在白皮松花粉管質(zhì)膜上的定位情況具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
以下實(shí)施例中的百分比濃度，如無特別說明，均為質(zhì)量百分比濃度。
實(shí)施例1、青扦花粉管內(nèi)抗原的檢測(cè)取培養(yǎng)18h的青扦花粉管，用無菌水懸浮，制成花粉管懸浮液，進(jìn)行如下步驟的處理1)收集花粉管，用pH7.2PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)重懸，然后重復(fù)此步驟一次；2)加入多聚甲醛，使其終濃度為2％(新鮮配制)，室溫孵育2h，吸去多聚甲醛，用pH7.2的PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)充分洗滌2次，每次5min；3)用含1.5％纖維素酶cellulase R-10(購自Yakult Honsha Co.Ltd)和1.2％離析酶macerozyme R-10(購自Yakult Honsha Co.Ltd)的酶解液(pH5.5、15mMMes，400mM甘露醇，5mM氯化鈣和1μg·mL-1蛋白酶抑制劑(aprotinin，Calbiochem)酶解青扦花粉管10分鐘，酶解后的花粉管立即用pH7.2，10mM磷酸緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)洗滌；加入含0.2％TritonX-100的pH7.2的PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)，室溫作用5min后用pH7.2PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)洗滌4次，每次5min；調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml，將花粉管懸液滴加到多聚賴氨酸包被的載玻片上，室溫下靜置10min，然后用含有3％(3g/100ml)牛血清白蛋白的pH7.2、10mM PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)在室溫下封閉1h；4)用抗G蛋白抗體(Calbiochem)(用含1％牛血清白蛋白的10mM PBS將G蛋白抗體稀釋到20-50ug/ml)在4℃孵育12小時(shí)；用PBST(含有PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)和0.05％TritonX-100)清洗10min，共3次。吸凈液體，但不可干燥；加入異硫氰酸熒光黃(FITC)標(biāo)記的二抗(Sigma，St.Louis，USA)，37℃下孵育1h，同上用PBST清洗10min，清洗3次后吸干液體；
滴加50μl封固液(含有50％(V/V)甘油的PBS溶液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀))于載玻片上的花粉管上，加蓋玻片，空氣干燥30min，熒光顯微鏡下觀察、拍照。
相對(duì)于青扦花粉管設(shè)陰性對(duì)照將青扦花粉管用免疫前動(dòng)物血清代替一抗進(jìn)行孵育，或省略一抗直接進(jìn)行二抗孵育。結(jié)果如圖1所示，表明G-protein主要定位于青扦花粉管質(zhì)膜上，在頂端濃度最高(熒光最亮)。而設(shè)置的陰性對(duì)照并沒有觀察到熒光，說明本發(fā)明的方法是可靠的。
實(shí)施例2、白皮松花粉管內(nèi)抗原的檢測(cè)取培養(yǎng)72h的白皮松花粉管，用無菌水懸浮，制成花粉管懸浮液，進(jìn)行如下步驟的處理1)收集花粉管，用pH7.2PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)重懸，然后重復(fù)此步驟一次；2)加入多聚甲醛，使其終濃度為4％(新鮮配制)，室溫孵育1h，吸去多聚甲醛，用pH7.2的PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)充分洗滌2次，每次5min；3)用含3％纖維素酶cellulase R-10(購自Yakult Honsha Co.Ltd)和2％離析酶macerozyme R-10(購自Yakult Honsha Co.Ltd)的酶解液(pH5.5、15mM Mes，400mM甘露醇，5mM氯化鈣和1μg·mL-1蛋白酶抑制劑(pepstatin，Calbiochem)酶解白皮松花粉管8分鐘，酶解后的花粉管立即用pH7.2，10mM磷酸緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)洗滌；加入含0.2％Triton X-100的pH7.2的PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)，室溫作用5min后用pH7.2PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)洗滌4次，每次5min；調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml，將花粉管懸液滴加到多聚賴氨酸包被的載玻片上，室溫下靜置10min，然后用含有3％(3g/100ml)牛血清白蛋白的pH7.2、10mM PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)在室溫下封閉1h；4)用抗G蛋白抗體(Calbiochem)(用含1％牛血清白蛋白的10mM PBS將G蛋白抗體稀釋到20-50ug/ml)在4℃孵育12小時(shí)；用PBST(含有PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)和0.05％TritonX-100)清洗10min，共3次。吸凈液體，但不可干燥；加入異硫氰酸熒光黃(FITC)標(biāo)記的二抗(Sigma，St.Louis，USA)，37℃下孵育1h，同上用PBST清洗10min，清洗3次后吸干液體；滴加50μl封固液(含有50％(V/V)甘油的PBS溶液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀))于載玻片上的原生質(zhì)體上，加蓋玻片，空氣干燥30min，熒光顯微鏡下觀察、拍照。
相對(duì)于白皮松花粉管設(shè)陰性對(duì)照將白皮松花粉管用免疫前動(dòng)物血清代替一抗進(jìn)行孵育，或省略一抗直接進(jìn)行二抗孵育。結(jié)果如圖2所示，表明G-protein主要定位于白皮松花粉管質(zhì)膜上，在頂端濃度最高(熒光最亮)。而設(shè)置的陰性對(duì)照并沒有觀察到熒光，說明本發(fā)明的方法是可靠的。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)裸子植物花粉管內(nèi)抗原的方法，包括以下步驟1)用含多聚甲醛的磷酸緩沖液將花粉管固定后，用含纖維素酶和離析酶的酶解液酶解裸子植物花粉管，再用質(zhì)量百分比濃度為0.2％-1％的TritonX-100或NP-40水溶液洗滌；2)將經(jīng)步驟1)處理的花粉管與抗待測(cè)抗原對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)，如檢測(cè)到熒光，則裸子植物花粉管內(nèi)含有該待測(cè)抗原并得到該待測(cè)抗原的定位情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述含多聚甲醛的磷酸緩沖液中，多聚甲醛的質(zhì)量百分含量是2-4％。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述固定花粉管用的多聚甲醛的質(zhì)量百分比濃度為2％，固定時(shí)間為2小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述含纖維素酶和離析酶的酶解液含有質(zhì)量百分比濃度為1.5-3％的纖維素酶，質(zhì)量百分比濃度為1.2％-2％的離析酶，pH5-6、15mM 2-嗎啡啉乙磺酸，400mM甘露醇，5mM氯化鈣和1μg·mL-1蛋白酶抑制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述纖維素酶的質(zhì)量百分比濃度為1.5％，所述離析酶的質(zhì)量百分比濃度為1.2％。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述酶解裸子植物花粉管的時(shí)間為8-15分鐘，優(yōu)選為10分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，TritonX-100的質(zhì)量百分比濃度為0.2％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述經(jīng)步驟1)處理的花粉管與抗待測(cè)抗原對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)是將經(jīng)步驟1)處理的花粉管轉(zhuǎn)移到多聚賴氨酸包被的載玻片上，用牛血清白蛋白溶液在室溫下封閉1-2小時(shí)，經(jīng)含0.2-1％Triton X-100或NP-40的磷酸緩沖液充分洗滌后，在抗待測(cè)抗原的一抗中0-4℃或室溫下孵育2-12小時(shí)，轉(zhuǎn)移到熒光標(biāo)記的抗IgG的二抗溶液中在室溫或37℃下孵育1-2小時(shí)，用含50％甘油的磷酸緩沖液封片。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述一抗中孵育溫度為4℃；所述在二抗中孵育溫度為37℃，孵育時(shí)間為1小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述裸子植物為松杉綱松科裸子植物；優(yōu)選為白皮松或青扦。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)裸子植物花粉管內(nèi)抗原的方法。該方法，包括以下步驟1)用含多聚甲醛的磷酸緩沖液將花粉管固定后，用含纖維素酶和離析酶的酶解液酶解裸子植物花粉管，再用質(zhì)量百分比濃度為0.2－1％的TritonX－100或NP－40水溶液洗滌；2)將經(jīng)步驟1)處理的花粉管與抗待測(cè)抗原對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)，如檢測(cè)到熒光，則裸子植物花粉管內(nèi)含有該待測(cè)抗原并得到該待測(cè)抗原的定位情況。本發(fā)明的利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)植物花粉管內(nèi)抗原的方法抗原抗體結(jié)合充分，標(biāo)記效果好，靈敏度高，掃描得到的圖象信噪比高，能真實(shí)而充分地反映抗原在花粉管內(nèi)的分布情況，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N21/76GK1811433SQ20061000316
公開日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2006年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月20日
發(fā)明者林金星, 張凌云 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所