專利名稱：單倍體基因組用于遺傳診斷、修飾和增殖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單倍體基因組的增殖和應(yīng)用，目的在于(1)遺傳診斷；(2)遺傳選擇；和(3)遺傳修飾。所選擇的單倍體基因組在與另一種單倍體基因組、優(yōu)選一種具有所需遺傳組成的單倍體基因組合時(shí)可用于生產(chǎn)胚胎和胚胎干細(xì)胞。
背景技術(shù)：
配子是通過減數(shù)分裂產(chǎn)生的特定的單倍體細(xì)胞(例如精子和卵母細(xì)胞)且涉及有性生殖。相反，二倍體細(xì)胞具有同源配對的染色體且?guī)в忻糠N常染色體遺傳基因座的兩個(gè)拷貝。二倍數(shù)(2n)等于單倍數(shù)的2倍且是大多數(shù)細(xì)胞而非配子的特征數(shù)。合子是因受精過程中雄性和雌性配子融合而產(chǎn)生的二倍體細(xì)胞。參見《細(xì)胞生物學(xué)詞典》(THEDICTIONARY OF CELL BIOLOGY)103，139，388(J.M.Lackie等，編輯，1995)。僅(二倍體)合子能夠產(chǎn)生存活的后代。相反，盡管單倍體配子有可能產(chǎn)生屬于雌性衍生的單倍體細(xì)胞(卵母細(xì)胞)的孤雌發(fā)育的胚胎，但是這些胚胎一般在胚胎發(fā)生完成前終止發(fā)育。這類胚胎可以自發(fā)產(chǎn)生，但更一般的情況是通過對卵母細(xì)胞進(jìn)行人工活化來產(chǎn)生。這類雌核發(fā)育胚胎可用于研究胚胎發(fā)生。
以前曾經(jīng)報(bào)導(dǎo)了合適單倍體衍生的多能細(xì)胞系的生產(chǎn)。例如，據(jù)推定通過從129 SvE或C57BL x CBA雜種小鼠中獲得卵并在與7％乙醇的磷酸緩沖鹽水(PBS)溶液接觸后以孤雌生殖方式將其活化來生成所述的多能單倍體細(xì)胞。然而，在檢查這些早期傳代的″單倍體″細(xì)胞系的染色體時(shí)，所有的細(xì)胞均為帶有40條染色體模態(tài)數(shù)的二倍體(Kaufman等，《胚胎學(xué)和形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)雜志》(J.Embryol.Exp.Morphol.)73249-61(1983))。
盡管已經(jīng)充分報(bào)導(dǎo)了哺乳動物胚胎可以由單倍體基因組產(chǎn)生，但是尚未將這類哺乳動物胚胎用于遺傳分析。相反，就本發(fā)明者所了解到的情況而言，通常使用顯然正常的(二倍體)胚胎在子宮內(nèi)或子宮外進(jìn)行產(chǎn)前遺傳診斷。然而，子宮內(nèi)的遺傳診斷是侵害性的且對發(fā)育中的胎兒而言可能存在危險(xiǎn)性(例如羊膜腔穿刺術(shù)和絨毛膜取樣)?？梢允菇?jīng)診斷患有疾病的胎兒流產(chǎn)或孕育至分娩期，因?yàn)樽訉m內(nèi)手術(shù)和基因療法仍然具有很高的風(fēng)險(xiǎn)性和實(shí)驗(yàn)性。
在人體中，一般對通過體外受精(IVF)技術(shù)產(chǎn)生的胚胎進(jìn)行子宮外遺傳診斷。一般從最新的胚胎中取1個(gè)或2個(gè)細(xì)胞并檢測諸如囊性纖維化(CF)、性連鎖疾病、染色體異常、脆性X染色體綜合征、脊柱肌肉萎縮和強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良這樣的疾病(de Die-Smulders等，Ned.Tijdschr.Geneeskd.1422441-4(1998))?？梢允褂镁酆厦告湻磻?yīng)(PCR)或嵌套式PCR進(jìn)行植入前遺傳診斷(PGD)以便診斷CF常見的ΔF508突變(Cui等，《人體生殖分子學(xué)》(Mol.Hum.Reprod.)263-1(1996)；和Ao等，《產(chǎn)前診斷》(Prenat.Diagn.)16137-42(1996))以及其它疾病(Ben-Ezra，《臨床實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)》(Clin.Lab.Med.)1595-815(1995))。還可以通過對獼猴卵裂早期胚胎血型分型進(jìn)行單個(gè)卵裂球活檢(RhD)(Avner等，《人體生殖分子學(xué)》(Mol.Hum.Reprod.)260-2(1996))或通過胚泡活檢(Verlinsky等，Bailieres Clin.Obstet.Gynaecol.8177-96(1994))來進(jìn)行遺傳篩選?？梢詫⒃恢旅魳?biāo)記(PRINS)和原位雜交用于為PGD檢測人染色體的異常(Pellestor等，《人體生殖分子學(xué)》(Mol.Hum.Reprod.)2135-8(1996))。還使用熒光原位雜交(FISH)進(jìn)行了PGD以便防止因具有單倍體X的精子(隨后發(fā)生復(fù)制)與失活卵母細(xì)胞受精而產(chǎn)生的胎塊發(fā)育(Reubinoff等，《人體生殖》(Hum.Reprod.)12805-8(1997))。可以對卵母細(xì)胞進(jìn)行PGD以便通過第一極體分析來診斷單一基因病癥并鑒定含有母體未受影響的基因的卵母細(xì)胞(Verlinsky等，《生物化學(xué)與分子醫(yī)學(xué)》(Biochem.Mol.Med.)62182-7(1997)；Verlinsky等，《最新產(chǎn)科學(xué)與婦科學(xué)觀點(diǎn)》(Curr.Opin.Obstet.Gynecol.)4720-5(1992)；和Verlinsky等，《人體生殖》(Hum.Reprod.)5826-9(1990))。在一種情況中，通過稀釋和顯微操作使有兩個(gè)具有成骨不全受侵染嬰兒的父代的各個(gè)精子分離。使用嵌套式PCR來擴(kuò)增含有所述突變的I型膠原蛋白基因的片段并測序以便檢測野生型基因和帶有單一點(diǎn)突變的基因(Iida等，《人體生殖分子學(xué)》(Mol.Hum.Reprod.)2131-4(1996))。就應(yīng)用胞質(zhì)內(nèi)精子注射技術(shù)(ICSI)而言，已經(jīng)研發(fā)了選擇精子的方法(Meschede等，《人體生殖》(Hum.Reprod.)102880-6(1995))。對第一和第二極體的序列分析和多樣PCR可以比通過單細(xì)胞DNA分析遇到的易產(chǎn)生的錯(cuò)誤獲得更精確的遺傳診斷(Richitsky等，J.Assist.Reprod.Genet.16192-8(1999)).
遺傳篩選的其它方法包括限制片段長度多態(tài)性(RFLPs)、串聯(lián)重復(fù)(VNTR)序列和二核苷酸或其它短串聯(lián)重復(fù)(STR)序列的可變數(shù)量的檢測或改變。另一方面，使用與野生型或突變體序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行等位基因特異性擴(kuò)增和等位基因特異性連接，為檢測特異性突變提供了兩種選擇方式。還有其它方法可用于篩選突變的存在情況而不鑒定特異性突變自身。這些方法包括單鏈構(gòu)象多態(tài)(SSCP)分析、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和通過酶(RNA酶A)或化學(xué)(哌啶)方式進(jìn)行的錯(cuò)配裂解分析。參見Fujimura，《分子生物學(xué)和生物技術(shù)綜合參考書》(MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGYA COMPREHENSIVE DESKREFERENCE)中的“遺傳測試(″Genetic Testing″)，374-379(RobertA.Meyers，編輯，1995)。
因此，以上述為基礎(chǔ)，顯然盡管在使植入前遺傳篩選和體外生成的胚胎操作完善方面正在取得進(jìn)展，但是在對配子進(jìn)行遺傳篩選或?qū)τ糜谏a(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的配子進(jìn)行遺傳操作方面幾乎沒有取得任何進(jìn)展。
因此，盡管文獻(xiàn)中預(yù)先報(bào)導(dǎo)了什么內(nèi)容，對配子遺傳篩選的改進(jìn)方法和遺傳加工單倍體細(xì)胞用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物仍存在需求。
本發(fā)明的概括和目的本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種選擇用于生產(chǎn)胚胎、胚胎干細(xì)胞或胚胎種系細(xì)胞的基因組的方法，該方法包括下列步驟(i)培養(yǎng)含有雄性或雌性衍生的單倍體遺傳組成的細(xì)胞；(ii)將所述培養(yǎng)細(xì)胞的遺傳組成進(jìn)行遺傳測試以便鑒定所述單倍體基因組是否包括遺傳缺陷、所需基因或缺乏功能基因；和(iii)選擇不包括遺傳缺陷的細(xì)胞或選擇含有所需基因或缺乏功能基因的細(xì)胞。
特別就雌性衍生的單倍體細(xì)胞而言，可以通過5種方法之一獲得該細(xì)胞(1)對其中一半染色體排出在極體中的卵母細(xì)胞進(jìn)行激活；(2)通過使卵受精并從其中除去雄性原核；(3)通過活化卵以便產(chǎn)生含有兩個(gè)雌性原核的卵并除去所述原核之一；(4)通過將二倍體細(xì)胞核插入不成熟的卵母細(xì)胞，隨后使所述染色體分入兩個(gè)單倍體核；和(5)通過將單性胚胎(含有半數(shù)染色體，但增殖全部DNA成分即4條染色單體)的核轉(zhuǎn)入卵母細(xì)胞且隨后從其中排出半數(shù)染色體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及可以通過下列方法之一獲得的雄性衍生的單倍體細(xì)胞的篩選方法(1)從除去雌性原核的受精卵中獲得雄性衍生的單倍體細(xì)胞；(2)通過使去核的卵受精而獲得雄性衍生的單倍體細(xì)胞；和(3)通過對精核進(jìn)行人工解凝、然后將其注入非卵衍生的胞質(zhì)體而獲得雄性衍生的單倍體細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種增殖雄性或雌性衍生的單倍體細(xì)胞的方法，該方法通過選自的方法來進(jìn)行(i)使單倍體卵胞質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞分裂；(ii)使單倍體細(xì)胞產(chǎn)生單倍體胚胎，然后將這種胚胎培養(yǎng)成″增殖單倍體″細(xì)胞；(iii)將單倍體胚胎培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體的胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞并使這類胚胎于細(xì)胞樣細(xì)胞分化；和(iv)在使細(xì)胞分裂的條件下培養(yǎng)單倍體體細(xì)胞胞質(zhì)體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供雄性或雌性來源的增殖單倍體基因組細(xì)胞系、即包括所需遺傳組成或包括所需遺傳修飾的細(xì)胞系。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供由單倍體細(xì)胞系產(chǎn)生的多能或胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞和由其來源的分化細(xì)胞，它們包括所需遺傳組成、例如包括所需的遺傳修飾。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供由遺傳修飾或選擇的單倍體雄性和/或雌性基因組產(chǎn)生的二倍體哺乳動物胚胎以及由其來源的多能細(xì)胞系和分化細(xì)胞。
定義本發(fā)明涉及通過任意方法進(jìn)行的含有雄性或雌性衍生的單倍體染色體組成的細(xì)胞的生產(chǎn)和增殖方法、這些細(xì)胞在特異性單倍體基因組的遺傳評價(jià)、遺傳修飾或增殖中的應(yīng)用以及這些細(xì)胞在生產(chǎn)具有DNA的二倍體組成的胚胎中的應(yīng)用。所增殖、篩選和/或修飾的單倍體基因組包括下列動物的單倍體基因組有蹄類動物，諸如牛、綿羊、豬、馬、山羊；犬、貓、鼠、家兔和嚙齒動物(例如豚鼠、倉鼠和大鼠)；人、非人靈長目，諸如獼猴、黑猩猩、狒狒和大猩猩。
所謂″遺傳篩選″、″遺傳診斷″、″遺傳分析″和″遺傳測試″指的是通過常規(guī)方法分析單倍體基因組以便檢測存在或不存在與表型、疾病或疾患相關(guān)的特異性DNA。這類方法包括原位雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、嵌套式聚合酶鏈反應(yīng)、熒光檢測法、RFLP分析VNTR或STR檢測法(其中篩選大量串聯(lián)重復(fù)二核苷酸或其它短串聯(lián)重復(fù)(STR)序列的用法)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析、指示梯度凝膠電泳(DGGE)和錯(cuò)配裂解分析、即通過酶(RNA酶A)或化學(xué)(哌啶)方式而進(jìn)行的裂解分析。這類方法綜述在Fujimura，《分子生物學(xué)和生物技術(shù)綜合參考書》(MOLECULARBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGYA COMPREHENSIVE DESK REFERENCE)中的“遺傳測試”(″Genetic Testing″)，374-379(Robert A.Meyers，編輯，1995)中。
所謂″遺傳選擇″指的是使用遺傳測試對基因型進(jìn)行的定向選擇。
所謂″遺傳修飾″或″遺傳操作″指的是對細(xì)胞、一般是單倍體細(xì)胞的基因組進(jìn)行的修飾。它包括插入、缺失和取代這樣的修飾。優(yōu)選在基因組中的靶位點(diǎn)上進(jìn)行修飾。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，最終將修飾的單倍體細(xì)胞用于核移植以便產(chǎn)生表達(dá)所修飾/操作的基因的動物。
所謂″增殖″指的是增加包括所需雄性或雌性來源的單倍體基因組的細(xì)胞數(shù)。
所謂″單倍體細(xì)胞″指的是帶有單倍體數(shù)量(n)染色體的細(xì)胞?！迮渥印迨峭ㄟ^減數(shù)分裂產(chǎn)生并涉及有性生殖的特化單倍體細(xì)胞(例如精子和卵母細(xì)胞)。″二倍體細(xì)胞″具有同源配對的染色體并帶有每種常染色體遺傳基因座的兩個(gè)拷貝(2n)。″合子″是因受精過程中雄性和雌性配子融合產(chǎn)生的二倍體細(xì)胞。
術(shù)語″核轉(zhuǎn)移″或″核移植″指的是一種克隆方法，其中將來自供體細(xì)胞的核移植入去核的卵母細(xì)胞。已知核轉(zhuǎn)移技術(shù)或核移植技術(shù)公開在文獻(xiàn)中(Campbell等，《動物生殖學(xué)》(Theriogenology)43181(1995)；Collas等，《生殖與發(fā)育分子學(xué)》(Mol.Reprod.Dev.)38264-267(1994)；Keefer等，《生物學(xué)與生殖》(Biol.Reprod.)50935-939(1994)；Sims等，《美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)906143-6147(1993)；Evans等，WO 90/03432(1990年4月5日)；Smith等，WO 94/24274(1994年10月27日)；Wheeler等，WO 94/26884(1994年11月24日))。另外，美國專利號US 4,994,384和US 5,057,420中描述了用于牛核移植的步驟。另外參見美國專利號US 5,945,577；WO 97/06668和WO 97/06669，受讓人或申請人的名稱分別為The University of Massachusetts和Roslin Institute。將該專利和申請引入本文作為參考。在本申請中，核轉(zhuǎn)移或核移植或NT可以互換使用。本定義還包括植入一個(gè)或兩個(gè)選擇的單倍體基因組以便產(chǎn)生胚胎的過程。
所謂″缺乏功能基因″指的是整個(gè)基因從本發(fā)明主題的基因組中缺失或該基因突變至它不再起作用(例如產(chǎn)生野生型蛋白)的程度。
所謂″遺傳缺陷″指的是核酸缺失或插入，相當(dāng)于基因轉(zhuǎn)錄、基因mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的改變、蛋白質(zhì)或基因mRNA的半衰期改變或該基因野生型表達(dá)的其它改變。給定基因的不同形式稱作″等位基因″。基因的″野生型等位基因″是那些在天然群體中以相對高的頻率存在并產(chǎn)生野生型或正常表型的等位基因。產(chǎn)生異?；蚍且吧捅硇偷幕虻牡任换蚴恰逋蛔凅w等位基因″。
所謂″增殖單倍體細(xì)胞系″指的是在單倍體細(xì)胞宿主生物體外通過人工方式產(chǎn)生的增殖單倍體細(xì)胞的細(xì)胞系。一般來說，這類單倍體細(xì)胞系包含在體外培養(yǎng)物中。另一方面，例如可以通過注入SKID小鼠以產(chǎn)生分化細(xì)胞類型使單倍體細(xì)胞增殖。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明涉及單倍體基因組的生產(chǎn)和增殖方法、通過遺傳分析從所述增殖單倍體基因組中選擇所需單倍體基因組和所述選擇的單倍體基因組在生產(chǎn)二倍體胚胎中的應(yīng)用。正如本申請背景技術(shù)中所述，已知將對植入前胚胎進(jìn)行遺傳評價(jià)作為選擇適合于移植和產(chǎn)生后代的胚胎的方式。這類方法包括在植入前對所述胚胎的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的基因組進(jìn)行遺傳評價(jià)。
然而，這類方法可能產(chǎn)生倫理問題，即胚胎受到操作，且如果它表現(xiàn)出不需要的遺傳特性，那么將會被破壞。最特別的情況是，就人植入前胚胎而言，這類方法可能產(chǎn)生倫理問題、尤其是通過核轉(zhuǎn)移或常規(guī)體外受精產(chǎn)生的那些人體胚胎而言更是如此。
相反，本發(fā)明通過對單倍體細(xì)胞基因組進(jìn)行遺傳測試而選擇用于生產(chǎn)二倍體胚胎的單倍體DNA。由于單倍體細(xì)胞不能產(chǎn)生存活后代，因此這類方法不會產(chǎn)生相同的倫理憂慮。因此，棄去不理想的單倍體基因組或?qū)伪扼w基因組操作避免了與操作和破壞二倍體胚胎、例如人二倍體胚胎相關(guān)的倫理問題。
因?yàn)楸景l(fā)明包括對單倍體基因組進(jìn)行遺傳測試，所以需要這類單倍體基因組的增殖來源。這種情況最初需要構(gòu)建或獲得含有單倍體基因組的細(xì)胞并要求其增殖。
可以使用生產(chǎn)含有雄性或雌性單倍體基因組的細(xì)胞的各種方法。例如，根據(jù)實(shí)例，生產(chǎn)含有雌性來源的單倍體基因組的單倍體細(xì)胞的方法包括下列步驟(i)在體外活化卵母細(xì)胞，其中半數(shù)染色體被排出在極體中；(ii)使卵受精并除去雄性原核；(iii)在體外活化包括兩個(gè)雌性原核的卵并從其中除去所述原核之一；(iv)將二倍體細(xì)胞核插入未成熟的卵母細(xì)胞并將所述染色體分入兩個(gè)單倍體核；和(v)將包含半數(shù)染色體、但增殖全部DNA成分即四條染色單體的的孤雌生殖核轉(zhuǎn)移入卵母細(xì)胞并從其中排出一半染色單體。
在上述方法中，優(yōu)選(i)、(iii)、(iv)和(v)，因?yàn)檫@些方法在任何情況下均不會產(chǎn)生其中半數(shù)其DNA組成屬于雄性來源且另一半屬于雌性來源的二倍體胚胎。因此，即使將它們植入，它們也不能夠發(fā)育成足月后代。
用于提供雄性來源單倍體基因組的方法包括(i)使卵受精并除去雌性原核；(ii)使去核的卵母細(xì)胞受精；和(iii)將精子核進(jìn)行人工解凝并注入非卵衍生的胞質(zhì)體。
可以通過各種方法增殖上述單倍體細(xì)胞和其它單倍體細(xì)胞。例如，可以通過誘導(dǎo)卵胞質(zhì)體的分裂來增殖單倍體基因組。另一方面，可以將單倍體胚胎用于胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞的生產(chǎn)中。這可以通過使用已知培養(yǎng)基和用于維持培養(yǎng)中的胚胎的方法培養(yǎng)所述胚胎并培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或來源于其中的細(xì)胞來進(jìn)行該步驟，以便產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞。例如，可以通過將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或單倍體基因組衍生胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞置于飼養(yǎng)層、例如鼠胎兒成纖維細(xì)胞上來進(jìn)行該步驟以便產(chǎn)生含有胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)物，所述的胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞在例如移離飼養(yǎng)層后可產(chǎn)生不同的分化細(xì)胞類型。
另一方面，可以將來源于單倍體胚胎的胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞用于產(chǎn)生具有親代單倍體基因組的基因組的分化細(xì)胞。增殖單倍體基因組的另一種方式包括誘導(dǎo)通過將單倍體基因組導(dǎo)入胞質(zhì)體產(chǎn)生的單倍體體細(xì)胞胞質(zhì)體的分裂。
應(yīng)注意，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的單倍體基因來源于人，例如來源于人的精子或卵母細(xì)胞。然而，本發(fā)明包括任意哺乳動物種類來源的單倍體基因組的構(gòu)建，所述的哺乳動物種類例如有非人的靈長類、狗、貓、小鼠、大鼠、家兔、熊、牛、馬、豬、綿羊、豚鼠、水牛、山羊、羚羊等。本發(fā)明主要適用于選擇例如需要通過核轉(zhuǎn)移增殖任意動物，這些含有特別重要的所需遺傳組成的動物是農(nóng)用動物、尤其是具有長妊娠期的動物。本發(fā)明應(yīng)能夠快速篩選可產(chǎn)生具有所需遺傳特性的二倍體胚胎的單倍體基因組。例如，性連鎖遺傳疾病的存在或不存在可能是遺傳篩選的基礎(chǔ)。
此外，本發(fā)明使得按照本發(fā)明產(chǎn)生的單倍體細(xì)胞系通過同源重組進(jìn)行遺傳修飾成為可能。
這是本發(fā)明的一個(gè)有利的方面，因?yàn)樵诨蜃系牡任徊町惒粫蓴_所需重組事件。此外，本發(fā)明可以使得對雄性和雌性單倍體細(xì)胞系中相同基因座進(jìn)行打靶，然后將產(chǎn)生的修飾雄性和雌性單倍體基因組合并而產(chǎn)生對特定修飾(例如缺失特定基因)而言屬于純合的二倍體胚胎。
如上所述，本文所述的本發(fā)明對現(xiàn)有的移植前遺傳診斷(PGD)方法進(jìn)行了改進(jìn)，因?yàn)檫@些方法不會涉及對胚胎的操作。一般來說，極少有胚胎可用于篩選。此外，為測試而從胚胎中取出細(xì)胞對該胚胎的進(jìn)一步發(fā)育而言可能是有害的。而通常僅有一個(gè)或極少的幾個(gè)細(xì)胞用于遺傳測試，這將導(dǎo)致因DNA缺失或DNA污染而產(chǎn)生不準(zhǔn)確的結(jié)果。最后，關(guān)于胚胎的處理存在倫理考慮。單倍體DNA的遺傳篩選提供的優(yōu)勢在于，如果篩選雄性和/或雌性配子，那么盡管篩選的配子極少，但總體上可能的組合將是很大的。
就性連鎖遺傳疾病而言，可以僅對精子進(jìn)行篩選，而精子通常易于大量獲得。如果不能獲得大量精子，那么使精子基因組增殖也是有用的。這項(xiàng)技術(shù)可以制成基因組的許多相同拷貝用于篩選，以便將誤診的可能性減小到最低限度，并允許分析其它樣品以便檢驗(yàn)結(jié)果。有關(guān)與精子相關(guān)的工作和對精子的操作的倫理憂慮與那些使用胚胎進(jìn)行工作的情況相比是最小的。
例如，還可以篩選單倍體細(xì)胞，以便測定該單倍體細(xì)胞中的遺傳或DNA甲基化缺陷是否可以導(dǎo)致由其發(fā)育而成的任何成年動物患癌或其它疾病。對遺傳疾病和易感性的篩選可以用于消除含有這類缺陷的有缺陷單倍體細(xì)胞?？梢詫⒈景l(fā)明用于篩選與疾病或其它不需要的性狀相關(guān)的染色體畸變和DNA序列。一般將這些單倍體基因組棄去。然而，在某些情況中，可以保留這類單倍體基因組。例如，編碼涉及疾病的基因的單倍體基因組的產(chǎn)生可以用于生產(chǎn)用于研究目的的動物，例如用于評價(jià)推定的治療或預(yù)防的功效。此外，可以將本發(fā)明用于選擇含有所需遺傳組成、例如包括涉及促進(jìn)生長、疾病耐受性、產(chǎn)奶或其它所需性狀的DNA序列的單倍體基因組。例如，可以使用DNA探針和連鎖(L)或突變(M)檢測對表1中所列下列人體疾病進(jìn)行單倍體細(xì)胞的遺傳分析
表1
Frank K.Fujimura，《分子生物學(xué)和生物技術(shù)綜合參考書》(MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGYA COMPREHENSIVE DESKREFERENCE)中的“遺傳測試”(″Genetic Testing″)，374-379(RobertA.Meyers，編輯，1995)。
用于篩選基因組檢查特異性DNA序列或染色體畸變是否存在的方法是眾所周知的。根據(jù)實(shí)例，這類篩選方法包括聚合酶鏈分析(PCR)技術(shù)，包括嵌套式PCR和直接PCR擴(kuò)增；SSCP分析；RFLP分析；原位引發(fā)標(biāo)記(PRINS)法(參見Pellestor等，1996)；熒光原位雜交(FISH)分析；和VNTRs或STRs分析；變性梯度凝膠電泳(DGGE)；以及使用酶(例如RNA酶A)或化學(xué)(例如哌啶)法進(jìn)行的錯(cuò)配裂解分析。
其它篩選方法包括可用于鑒定基因組印記相關(guān)綜合征的DNA甲基化分析。與基因組印記相關(guān)的人體綜合征和疾病包括普-威綜合征(PWS)、安格爾曼綜合征(AS)、單親異雙軀干畸胎病(uniparentalisodisomy)、伯-韋綜合征(BWS)、維爾姆斯瘤癌發(fā)生和馮·希佩爾-林道(yon Hippel-Lidau，VHL)病。就進(jìn)行DNA甲基化分析的方法而言，參見Buchholz等，《人體遺傳學(xué)》(Hum.Genet.)103535-9(1998)?？梢酝ㄟ^遺傳突變、諸如缺失以及異?；蚪M印記產(chǎn)生PWS(Barabash等，《臨床醫(yī)學(xué)》(Med.Clin.)(Barc)108304-6(1997))。在動物中，還將基因組印記與皮毛顏色聯(lián)系起來了。例如，小鼠agouti基因賦予野生型毛色，Aiapy等位基因的差異表達(dá)與基因上游調(diào)節(jié)序列的甲基化情況有關(guān)(Michaud等，《基因發(fā)育》(Genes Dev.)81463-72)?？梢詫⑥r(nóng)學(xué)上的遺傳篩選用于遺傳選擇以便產(chǎn)生最佳組合，這種組合可將隱性突變減小到最低限度、增加雜合性或純合性或累積有益的或者所需的等位基因。
如上所述，許多遺傳篩選和測試方法在本領(lǐng)域中是公知的且可以用于本發(fā)明。此外，已經(jīng)鑒定了與所需或不需要的性狀相關(guān)的許多序列。
可以將本發(fā)明的方法用于例如農(nóng)業(yè)、實(shí)驗(yàn)室或馴養(yǎng)動物這樣的動物以及人中的遺傳選擇。目前，構(gòu)成胚胎的配子基因組的組合是隨機(jī)的。然而，通過對配子進(jìn)行遺傳篩選，可以獲得最佳組合以便將隱性突變最小到最低限度、增加雜合性、增加純合性或累積有益的等位基因。選擇到的具有所需遺傳組成的單倍體基因組可以用于產(chǎn)生二倍體胚胎和后代。
如上進(jìn)一步所述，還可以將生產(chǎn)增殖單倍體細(xì)胞的方法用于制備遺傳修飾的單倍體細(xì)胞。就同源重組而言，基因座上的等位差異不會干擾重組事件。此外，靶向雄性和雌性細(xì)胞系可以獲得純合修飾。
用于進(jìn)行基因組修飾的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，例如包括應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、顯微注射和使用包括待插入序列的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。優(yōu)選在基因組的靶位點(diǎn)上進(jìn)行遺傳修飾。已經(jīng)充分報(bào)導(dǎo)了用于對基因組，特別是哺乳動物基因組進(jìn)行靶向插入、缺失和取代修飾的方法，它們是許多專利的主題。
本質(zhì)上說，在本發(fā)明中，可以對增殖單倍體細(xì)胞系中包含的特定單倍體基因組進(jìn)行遺傳修飾以便除去、添加或取代特定的DNA序列。在例如通過同源重組進(jìn)行這類遺傳修飾后，對所述的單倍體基因組進(jìn)行測試或篩選以便確定它確實(shí)包括所述修飾。例如，可以通過上文確定的遺傳篩選方法或通過表達(dá)例如酶、抗生素抗性標(biāo)記、熒光或放射性標(biāo)記等這樣在插入的DNA中包含的特定標(biāo)記來完成上述步驟。
在產(chǎn)生了遺傳修飾的單倍體基因組后，優(yōu)選通過上述方法擴(kuò)增它。
所得選擇的雄性或雌性來源的單倍體(其基因組可以是遺傳修飾的)特別可用于核轉(zhuǎn)移或核移植。這類方法主要包括將所選擇的雄性和雌性單倍體基因組導(dǎo)入去核的卵母細(xì)胞或?qū)⑺x擇的雄性或雌性單倍體基因組導(dǎo)入單倍體卵母細(xì)胞的步驟，其中這類單倍體DNA是雄性或雌性來源。由此獲得二倍體核轉(zhuǎn)移單位，其中已基于其遺傳組成對其中的雄性或雌性DNA進(jìn)行了選擇?？梢詫⑦@些二倍體核轉(zhuǎn)移單位用于生成具有所需遺傳組成、例如含有涉及疾病耐受性、生長或編碼所需產(chǎn)物的異源DNA的基因的子代。
核轉(zhuǎn)移技術(shù)或核移植技術(shù)在文獻(xiàn)中是眾所周知的。特別參見Sims等，《美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)906143-6147(1993)；Collas等，《發(fā)育的分子學(xué)報(bào)告》(Mol.ReportDev.)38264-267(1994)；Keefer等，《生殖生物學(xué)》(Biol.Reprod.)50935-939(1994)；Campbell等，《動物生殖學(xué)》(Theriogenology)，43181(1995)；Campbell等，《自然》(Nature)，38064-66(1996)；Schnieke等，《科學(xué)》(Science)2782130-3(1997)；Wells等，《生殖生物學(xué)》(Biol.Reprod.)57385-393(1997)；Wilmut等，《自然》(Nature)386810-813(1997)；Cibelli等，《科學(xué)》(Science)2801256-8(1998)；Kato等，《科學(xué)》(Science)2822095-8(1998)；Wakayama等，《自然》(Nature)394369-74(1998)；Wolf等，《生物技術(shù)雜志》(J.Biotechnol.)6599-110(1998)；Baguisi等，《國家生物技術(shù)》(Nat.Biotechnol.)17456-61(1999)；Dominko等，《生殖生物學(xué)》(Biol.Reprod.)601496-1502(1999)；Wolf等，《生殖生物學(xué)》(Biol.Reprod.)60199-204(1999)；PCT/US99/00045；WO 94/26884；WO 94/24274；和WO 90/03432，將這些文獻(xiàn)的全部內(nèi)容引入本文作為參考。此外，美國專利號US 4,944,384和5,057,420中描述了用于牛核轉(zhuǎn)移的步驟。另外參見美國專利號US 5,945,577，將該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容引入作為參考。
用于核轉(zhuǎn)移的卵母細(xì)胞可以獲自包括哺乳動物和兩棲類動物在內(nèi)的動物。卵母細(xì)胞的合適的哺乳動物來源包括綿羊、牛、羊、豬、馬、兔、豚鼠、小鼠、倉鼠、大鼠、靈長類、人和非人等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞可以獲自靈長類，例如人卵母細(xì)胞；或有蹄類動物。
用于分離卵母細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。這些方法主要包括從例如牛這樣的哺乳動物卵巢或生殖道中分離卵母細(xì)胞的步驟。牛卵母細(xì)胞的易于得到的來源是來自屠宰場的物質(zhì)。
為了成功地使用諸如遺傳工程、核轉(zhuǎn)移和克隆這樣的技術(shù)，在將這些細(xì)胞用作核轉(zhuǎn)移用的受體細(xì)胞前并在能夠與使精子細(xì)胞受精而發(fā)育成胚胎之前，一般必須在體外使卵母細(xì)胞成熟。這種方法一般需要從卵巢(例如在屠宰場獲得的牛卵巢)中收集不成熟的(前I期)卵母細(xì)胞并在受精或去核前在成熟培養(yǎng)基中使卵母細(xì)胞成熟，直到卵母細(xì)胞達(dá)到中期II階段為止，就牛卵母細(xì)胞的情況而言，中期II階段一般發(fā)生在吸出后約18-24小時(shí)。就本發(fā)明的目的而言，將該時(shí)間期限稱作″成熟期″。本文計(jì)算時(shí)間期限所用的″吸出″指的是從卵泡中吸出不成熟的卵母細(xì)胞。此外，本發(fā)明包括通過從許可供體中吸出而分離人卵母細(xì)胞的方法。
另一方面，可以將已經(jīng)在體內(nèi)成熟的中期II階段的卵母細(xì)胞用于核轉(zhuǎn)移技術(shù)。例如，通過手術(shù)方法從動情期開始后或注射人絨毛膜促性腺素(hCG)或相似激素后35-48小時(shí)的非超排卵或超排卵的母牛或小母牛中采集成熟的中期II卵母細(xì)胞。
已經(jīng)報(bào)導(dǎo)去核和核轉(zhuǎn)移時(shí)卵母細(xì)胞的成熟階段對NT法的成功是稻重要的。(例如參見Prather等，《分化》(Differentiation)481-8(1991)；Tanaka等，《動物生殖科學(xué)》(Anim.Reprod.Sci.)49113-23(1997))。一般來說，成功的哺乳動物胚胎克隆實(shí)踐應(yīng)用中期II卵母細(xì)胞作為受體卵母細(xì)胞，因?yàn)檎J(rèn)為在該階段卵母細(xì)胞可能或被充分″活化″而將導(dǎo)入的核作為受精精子對待。在馴養(yǎng)的動物且特別是牛中，卵母細(xì)胞活化期通常是在吸出后約16-52小時(shí)、優(yōu)選約28-42小時(shí)的范圍。
例如，可以如Seshagine等在《生殖生物學(xué)》(Biol.Reprod.)40544606(1989)中所述在HEPES緩沖的倉鼠胚胎培養(yǎng)基(HECM)中洗滌不成熟的卵母細(xì)胞，且然后在39℃下將其放入處于輕質(zhì)石蠟或硅烷層之下的成熟培養(yǎng)基液滴中，該液滴由含有10％胎牛血清(FCS)的50ul組織培養(yǎng)基(TCM)199組成，所述培養(yǎng)基含有諸如黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)這樣適當(dāng)?shù)拇傩韵偎匾约按贫肌?br> 在約10-40小時(shí)且優(yōu)選約16-18小時(shí)范圍的固定成熟期后，可以將卵母細(xì)胞去核。在去核前，優(yōu)選取出該卵母細(xì)胞并在除去卵丘細(xì)胞前將其放入含有1mg/ml透明質(zhì)酸酶的HECM中。通過經(jīng)極其精密孔徑分吸量管反復(fù)吸移或通過簡單地渦旋來完成上述步驟。然后對剝離的卵母細(xì)胞篩選極體，隨后將通過存在極體確定的所選擇中期II卵母細(xì)胞用于核轉(zhuǎn)移。去核過程如下。
可以通過諸如美國專利號US 4,994,384中所述的公知方法進(jìn)行去核，將該文獻(xiàn)引入作為參考。例如，將中期II卵母細(xì)胞置于可以含有或不含有7.5μg/ml松胞菌素B的HECM中以便于即刻去核，或可以將其置于例如CR1 aa+10％動情期母牛血清的適宜培養(yǎng)基中以后再去核，優(yōu)選在不超過24小時(shí)后且更優(yōu)選在16-18小時(shí)后去核。
可以使用微量吸移管通過顯微手術(shù)的方式進(jìn)行去核以便除去極體和相鄰的細(xì)胞質(zhì)。然后可以篩選卵母細(xì)胞以便鑒定已經(jīng)成功去核的那些卵母細(xì)胞?？梢酝ㄟ^用HECM中的1μg/ml 33342 Hoechst染料對卵母細(xì)胞染色且然后在紫外線照射下將所述卵母細(xì)胞觀測10秒以下進(jìn)行這種篩選。可以將隨后成功去核的卵母細(xì)胞置于合適的培養(yǎng)基、例如CR1 aa+10％血清中。
在本發(fā)明中，可以將1個(gè)或2個(gè)選擇的可能進(jìn)行遺傳修飾的單倍體基因組植入任選去核的卵母細(xì)胞的卵周隙或其它胞質(zhì)體中。按照本領(lǐng)域中公知的方法將所得的含有屬于二倍體的卵母細(xì)胞或胞質(zhì)體的單倍體基因組用于產(chǎn)生NT單位。例如，可以通過電融合融合細(xì)胞。通過提供足以使質(zhì)膜短暫破裂的電脈沖來進(jìn)行電融合。質(zhì)膜的這種破裂時(shí)間極短，因?yàn)樵撃た煽焖僦匦纬?。?shí)質(zhì)上，如果誘導(dǎo)兩個(gè)相鄰的膜破裂，則重形成時(shí)脂雙層滲入，在兩個(gè)細(xì)胞之間將開放小的通道。由于這類小孔存在熱力學(xué)不穩(wěn)定性，它擴(kuò)大至兩個(gè)細(xì)胞合二為一為止。有關(guān)該方法的進(jìn)一步討論參閱Prather等的美國專利US 4,997,384。可以使用例如包括蔗糖、甘露糖醇、山梨醇和磷酸緩沖溶液在內(nèi)的各種電融合介質(zhì)。還可以使用仙臺病毒作為融合劑進(jìn)行融合(Graham，Wister Inst.Symp.Monogr.919(1969)。
此外，在某些情況中(例如使用小供體核)，可能優(yōu)選將單倍體細(xì)胞或核直接注入卵母細(xì)胞而不是使用電穿孔融合法。這類技術(shù)公開在Collas等的Mol.Reprod.Dev.38264-267(1994)中。
可以通過公知方法對人或動物細(xì)胞和卵母細(xì)胞或胞質(zhì)體進(jìn)行電融合例如在引發(fā)卵母細(xì)胞成熟后約24小時(shí)，在500μm室內(nèi)通過使用90-120V的電脈沖約15μsec。融合后，將所得的融合NT單位置于合適的培養(yǎng)基中至活化為止?？梢栽谌诤现盎蛑蟛痪谩⒁话阍谛∮?4小時(shí)后且優(yōu)選在約4-9小時(shí)后進(jìn)行活化。
可以通過公知方法活化NT單位。這類方法包括例如在亞生理學(xué)溫度下培養(yǎng)NT單位，實(shí)質(zhì)上是通過對NT單位施用冷或事實(shí)上冷卻的溫度休克。最方便的是通過在與胚胎通常暴露的生理學(xué)溫度相比屬于室溫的條件下培養(yǎng)NT單位來進(jìn)行該步驟。
另一方面，可以通過施用公知的活化劑來進(jìn)行活化。例如，已經(jīng)證實(shí)在受精過程中由精子透入卵母細(xì)胞可活化充滿的卵母細(xì)胞而產(chǎn)生較大數(shù)量的存活受孕體并在核轉(zhuǎn)移后倍增出遺傳方式相同的幼體。此外，可以將諸如電休克和化學(xué)休克這樣的處理方法用于活化融合后的NT胚胎。卵母細(xì)胞的活化方法是Susko-Parrish等的美國專利號US5,496,720的主題。
另一方面，可以同時(shí)或依次進(jìn)行下述步驟完成活化(i)增加卵母細(xì)胞中二價(jià)陽離子的濃度；和(ii)降低卵母細(xì)胞中細(xì)胞蛋白的磷酸化。
一般可以通過將例如鎂、鍶、鋇或鈣這樣的二價(jià)陽離子以例如離子載體的形式導(dǎo)入卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)來進(jìn)行上述步驟。其它增加二價(jià)陽離子濃度的方法包括使用電休克、用乙醇處理和用籠狀螯合劑(cagedchelators)處理。
可以通過公知方法、例如通過添加諸如絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑(例如6-二甲氨基嘌呤、staurosporine、2-氨基嘌呤和鞘氨醇)這樣的激酶抑制劑來減少磷酸化。另一方面，可以通過將磷酸酶(例如磷酸酶2A和磷酸酶2B)導(dǎo)入卵母細(xì)胞來抑制細(xì)胞蛋白的磷酸化。
進(jìn)行NT活化的一種方式通過下列步驟來進(jìn)行使融合的NT單位與含有5μM離子霉素和1mg/ml BSA的TL-HEPES培養(yǎng)基簡單接觸，隨后在融合后約24小時(shí)內(nèi)、且優(yōu)選在融合后約4-9小時(shí)內(nèi)在含有30mg/ml BSA的TL-HEPES中洗滌。另一方面，可以通過使用乙醇或反復(fù)的電脈沖來進(jìn)行活化。
然后可以將由一種或兩種選擇的單倍體基因組產(chǎn)生的活化NT單位在合適的體外培養(yǎng)基中培養(yǎng)至胚胎或胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞和細(xì)胞集落產(chǎn)生為止。適合于培養(yǎng)胚胎和使之成熟的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中是眾所周知的。可以用于牛胚胎培養(yǎng)和維持的已知培養(yǎng)基的實(shí)例包括Ham’s F-10+10％胎牛血清(FCS)、組織培養(yǎng)基-199(TCM-199)+10％胎牛血清、蒂羅德清蛋白-乳酸-丙酮酸(TALP)、Dulbecco’s磷酸緩沖鹽水(PBS)、Eagle’s和Whitten’s培養(yǎng)基。用于收集卵母細(xì)胞并使之成熟的最常用培養(yǎng)基之一是TCM-199+1-20％血清補(bǔ)充劑、包括胎牛血清、新生血清、動情期的母牛血清、小羊血清或公牛血清。優(yōu)選的維持培養(yǎng)基包括含有Earl鹽、10％胎牛血清、0.2mM丙酮酸鈉和50μg/ml硫酸慶大霉素的TCM-199。上述任何一種還可以包括與諸如顆粒細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞、BRL細(xì)胞、子宮細(xì)胞和STO細(xì)胞這樣不同細(xì)胞類型的共培養(yǎng)物。
此后，優(yōu)選將活化的培養(yǎng)NT單位進(jìn)行洗滌且然后置于例如帶孔平板中的含有10％FCS和6mg/ml的CRIaa培養(yǎng)基這樣合適的培養(yǎng)基中，這些平板優(yōu)選含有合適的匯合飼養(yǎng)層。合適的飼養(yǎng)層包括例如成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞，例如來源于有蹄類動物的成纖維細(xì)胞和子宮上皮細(xì)胞、雞成纖維細(xì)胞、鼠(例如小鼠或大鼠)成纖維細(xì)胞、STO和SI-m220飼養(yǎng)層細(xì)胞系和BRL細(xì)胞。
在飼養(yǎng)層上將NT單位培養(yǎng)至NT單位達(dá)到適合于獲得可用于產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞或細(xì)胞集落的細(xì)胞的大小。優(yōu)選將這些NT單位培養(yǎng)至至少約2-400個(gè)細(xì)胞、更優(yōu)選約4-128個(gè)細(xì)胞和最優(yōu)選至少約50個(gè)細(xì)胞。在合適的條件、例如約38.5℃和5％CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并且一般約每2-5天、優(yōu)選約每3天更換所述培養(yǎng)基以使生長達(dá)到最佳。
在獲得所需大小的NT單位后，以機(jī)械方式從所述區(qū)域中取出所述細(xì)胞且然后用于產(chǎn)生胚胎或胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞和細(xì)胞系。優(yōu)選通過取出包括一般含有至少約50個(gè)細(xì)胞的所述NT單位的細(xì)胞塊、洗滌這類細(xì)胞并將這些細(xì)胞鋪在例如照射的成纖維細(xì)胞這樣的飼養(yǎng)層上來完成上述步驟。一般來說，用于獲得所述干樣細(xì)胞或細(xì)胞集落的細(xì)胞將獲自優(yōu)選至少為50個(gè)細(xì)胞大小的培養(yǎng)NT單位的最內(nèi)層部分。然而，也可以將較小或較大細(xì)胞數(shù)量的NT單位以及來自NT單位其它部分的細(xì)胞用于獲得ES-樣細(xì)胞和細(xì)胞集落。將這些細(xì)胞維持在例如補(bǔ)充了10％FCS和0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)和L-谷氨酰胺的αMEM這樣的適宜生長培養(yǎng)基內(nèi)的飼養(yǎng)層中。根據(jù)需要更換生長培養(yǎng)基以便使生長最佳化，例如每2-3天更換一次。該培養(yǎng)過程導(dǎo)致形成胚胎或胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞或細(xì)胞系。在這類細(xì)胞產(chǎn)生前的培養(yǎng)時(shí)間可能隨特定核供體細(xì)胞、具體卵母細(xì)胞和培養(yǎng)條件的不同而改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要的不同而改變培養(yǎng)條件以便使特定胚胎或胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞的生長最佳化。
由所述單倍體基因組所生成胚胎或胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞和細(xì)胞集落應(yīng)表現(xiàn)出與用作核細(xì)胞供體的種類的天然胚胎或胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞相似的外觀。
已經(jīng)參照優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明。然而，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然能夠以非如上所述的特定方式使本發(fā)明具體化而不會脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。下面實(shí)施例中所述的優(yōu)選實(shí)施方案是解釋性的而不應(yīng)將其看作以任何方式來限定本發(fā)明。本發(fā)明的范圍由所附的而非上述描述確定，并且屬于權(quán)利要求范圍內(nèi)的所有改變和等同內(nèi)容均包括在其中。
實(shí)施例單倍體細(xì)胞系的產(chǎn)生大鼠A9細(xì)胞的產(chǎn)生在補(bǔ)充了10％胎牛血清的αmem(Biowhittaker，location)中用3.75μg/ml松胞菌素B(Sigma，location)將鼠A9細(xì)胞(HPRT-)培養(yǎng)96小時(shí)。松胞菌素B是微絲的抑制劑，可防止細(xì)胞進(jìn)行胞質(zhì)分裂，同時(shí)使細(xì)胞合成DNA并增加大小。撤離該藥物24小時(shí)后，可以從培養(yǎng)物表面取出細(xì)胞并操作。所得細(xì)胞約為30μm直徑。
培養(yǎng)用聚-D-賴氨酸包被直徑約為2.5cm的玻璃圓盤。以60-80％匯合率將松胞菌素B處理的A9細(xì)胞平板鋪在該圓盤上并使之貼壁24小時(shí)。將圓盤細(xì)胞側(cè)朝下置于含有5ml去核培養(yǎng)基(磷酸緩沖鹽水、10％胎牛血清、10ug/ml松胞菌素B)的離心管內(nèi)。在37℃下將細(xì)胞保溫20分鐘。將離心管置于37℃的超速離心機(jī)中并以23,000g再旋轉(zhuǎn)20分鐘。所得的胞質(zhì)體可存活24-48小時(shí)。
通過胰蛋白酶消化從玻璃表面取下胞質(zhì)體。以1X濃度向培養(yǎng)基中加入HAT補(bǔ)充劑以便殺傷剩余的有核細(xì)胞。該步驟的另一種選擇是在導(dǎo)入供體核后加入HAT補(bǔ)充劑。該步驟會消除任何有核A9細(xì)胞，而任何未融合的胞質(zhì)體會在48小時(shí)內(nèi)裂解。
供體核的導(dǎo)入通過獲能或用蛋白酶處理來制備從攜帶新霉素抗性基因(Neo)的轉(zhuǎn)基因小鼠中采集的精子用于融合。將這些處理方法用于確保精子將粘著胞質(zhì)體。轉(zhuǎn)基因標(biāo)記可用于證實(shí)精子的來源，但對該過程來說并非必需?；蛘撸瑔伪扼w供體可以是通過顯微操作從新近受精胚胎中取出的雄性和雌性原核(單倍體核體)。
融合用蛋白酶或PHA處理A9胞質(zhì)體和精子二者以便增加胞質(zhì)體與精子的粘附和融合的可能性。應(yīng)利用適宜濃度的精子或供體核和胞質(zhì)體，以便增加帶有單核的所得細(xì)胞的數(shù)量。可以用AC脈沖將核/胞質(zhì)體偶聯(lián)體定向，使得所融合的膜對電流而言是正交的?？梢越o予DC脈沖以便誘導(dǎo)核供體細(xì)胞與胞質(zhì)體之間的融合。還可以將細(xì)胞融合的其它方法用于這樣的步驟中，諸如聚乙二醇、融合-誘導(dǎo)病毒或脂質(zhì)體。
選擇融合幾天后，開始選擇A9-單倍體核雜種。將HAT敏感性A9細(xì)胞用作胞質(zhì)體的來源，因此，HAT培養(yǎng)基中形成的任何集落來自單倍體-胞質(zhì)體雜種。非去核的A9細(xì)胞不能在選擇中存活。將所得的雜種以克隆方式增殖直至獲得足夠數(shù)目用于分析。我們可通過熒光原位雜交或核型分析確定雜種是單倍體還是二倍體。
受精可以將單倍體細(xì)胞用作卵母細(xì)胞受精中的供體核。使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行核轉(zhuǎn)移。使用引起第二極體排出和雌性染色質(zhì)單倍化的方法可活化胚胎。
權(quán)利要求
1.一種用于選擇含有單倍體基因組的細(xì)胞的方法，該方法包括下列步驟(i)獲得含有雄性或雌性來源的單倍體基因組的細(xì)胞并擴(kuò)增其數(shù)目；(ii)將所述單倍體細(xì)胞的基因組進(jìn)行遺傳篩選或分析以便測定所述單倍體基因組是否包括所需的遺傳組成；和(iii)選擇含有所述所需遺傳組成的細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的雌性衍生的單倍體細(xì)胞是通過活化其中半數(shù)染色體排出在極體中的卵母細(xì)胞而產(chǎn)生的。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的雌性衍生的單倍體細(xì)胞是通過使卵受精并從其中除去雄性原核而產(chǎn)生的。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的雌性衍生的單倍體細(xì)胞是通過活化卵以便產(chǎn)生含有兩個(gè)雌性原核的卵并除去所述原核中的一個(gè)而產(chǎn)生的。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的雌性衍生的單倍體細(xì)胞是通過將二倍體細(xì)胞核插入未成熟的卵母細(xì)胞、隨后使所述染色體分入兩個(gè)單倍體核而產(chǎn)生的。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的雌性衍生的單倍體細(xì)胞是通過下列步驟產(chǎn)生的將含有半數(shù)染色體但增殖所有DNA成分即四條染色單體的單性胚的核轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞中，隨后從其中排出染色體的一半。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的雄性衍生的單倍體細(xì)胞來源于除去了雌性原核的受精卵。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的雄性衍生的單倍體細(xì)胞通過使去核卵受精而衍生。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的雄性衍生的單倍體細(xì)胞通過對精核進(jìn)行人工解凝、然后將其注入非卵衍生的胞質(zhì)體而產(chǎn)生。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中通過選自下述的方法來擴(kuò)增所述的雌性或雄性衍生的單倍體細(xì)胞(i)使單倍體卵胞質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞分裂；(ii)使單倍體細(xì)胞產(chǎn)生單倍體胚胎，然后將這種胚胎培養(yǎng)以產(chǎn)生″增殖單倍體″細(xì)胞；(iii)將單倍體胚胎培養(yǎng)以產(chǎn)生增殖單倍體細(xì)胞并使這類胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞分化；和(iv)在允許細(xì)胞分裂的條件下培養(yǎng)單倍體體細(xì)胞胞質(zhì)體。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述選擇的單倍體基因組進(jìn)行遺傳修飾。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中對選擇的雄性和雌性單倍體基因組二者均進(jìn)行遺傳修飾。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)一步包括使用所述選擇的雄性或雌性單倍體基因組或含有所述選擇的單倍體基因組的細(xì)胞用于產(chǎn)生二倍體胚胎的步驟。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)一步包括使用選擇的雄性和雌性單倍體基因組產(chǎn)生二倍體胚胎的步驟。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述選擇的雄性或雌性單倍體基因組或?qū)⒑兴鲂坌曰虼菩曰蚪M的細(xì)胞用作核轉(zhuǎn)移供體。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中將選擇的雄性和雌性單倍體基因組用作核轉(zhuǎn)移供體以便產(chǎn)生含有所述選擇的雄性和雌性單倍體基因組的二倍體核轉(zhuǎn)移單位。
17.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的單倍體基因組是人的。
18.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的單倍體細(xì)胞或基因組包括來源于增殖單倍體胚胎的分化細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的分化細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞通過體外培養(yǎng)單倍體胚胎而產(chǎn)生。
20.權(quán)利要求13所述的方法，其中將所述選擇的單倍體基因組進(jìn)行遺傳修飾。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中將所述選擇的單倍體基因組二者均進(jìn)行遺傳修飾。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其中通過同源重組對所述選擇的單倍體基因組進(jìn)行遺傳修飾，以便消除、插入或取代特定的DNA。
23.權(quán)利要求21所述的方法，其中通過同源重組對所述選擇的單倍體基因組二者均進(jìn)行遺傳修飾，以便消除、插入或取代特定的DNA。
24.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的遺傳測試包括下列步驟對所述擴(kuò)增的單倍體基因組篩選遺傳缺陷、與異?；蚪M印記相關(guān)的DNA甲基化缺陷或選擇含有所需DNA、等位性狀或缺乏功能基因的細(xì)胞。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的遺傳缺陷導(dǎo)致下列遺傳疾病中的一種α-1抗胰蛋白酶缺乏癥；α-地中海貧血；腺瘤樣結(jié)腸息肉病；成人多囊性腎病；因BRCA1或BRCA2缺陷導(dǎo)致的乳腺癌易感性；β-地中海貧血；沙-馬-圖病；因MSH2、MLH1、PMS1或PMS2缺陷導(dǎo)致的結(jié)腸癌易感性；先天性腎上腺增生；囊性纖維化；杜興/貝克肌營養(yǎng)不良；脆性X染色體綜合征；A型和B型血友??；戈謝??；亨廷頓舞蹈病；肯尼迪??；萊-尼綜合征；馬方綜合征；中鏈脂酰輔酶A脫氫酶缺乏癥；黑素瘤易感性；1或2A型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成；強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良；1型神經(jīng)纖維瘤?。圾B氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏??；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；鐮形細(xì)胞貧血；類固醇硫酸酶；泰-薩病；或韋-霍病。
26.權(quán)利要求24所述的方法，其中所測試的DNA甲基化缺陷選自普-威綜合征、安格爾曼綜合征、單親異雙軀干畸胎病、伯-韋綜合征、維爾姆斯瘤癌發(fā)生和馮.希佩爾-林道綜合征。
27.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的遺傳測試包括使用直接或間接與標(biāo)記連接的核酸序列或選擇含有所需DNA或等位性狀或缺乏功能基因的細(xì)胞的步驟，所述的標(biāo)記可以和與特定遺傳缺陷相關(guān)的核酸序列特異性結(jié)合。
28.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的遺傳測試包括對特定DNA序列、等位性狀或遺傳缺陷使用質(zhì)譜、熒光或放射性核檢測的步驟。
29.權(quán)利要求1所述的方法，其中這類遺傳篩選包括RFLP分析、SSCP分析、STR分析、VNTR分析或變性梯度凝膠電泳。
30.權(quán)利要求13所述的方法，其中將所述胚胎植入合適的雌性替代物并使之發(fā)育成可存活的后代。
31.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的單倍體基因組是牛的單倍體基因組。
32.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的單倍體基因組是靈長類的單倍體基因組。
33.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的單倍體基因組選自山羊、綿羊、牛、豬、羊、馬、綿羊、犬、貓、鼠、兔、靈長類、人、象、豚鼠、小鼠、大鼠的單倍體基因組組成的組。
34一種使用權(quán)利要求10所述方法獲得的增殖單倍體細(xì)胞系。
35.權(quán)利要求34所述的增殖單倍體細(xì)胞系，其中所述的細(xì)胞系是雌性細(xì)胞或雄性細(xì)胞衍生的單倍體細(xì)胞系。
36.一種通過核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的二倍體胚胎，其中所述的核轉(zhuǎn)移方法包括將單倍體基因組或按照權(quán)利要求1方法產(chǎn)生的細(xì)胞用作核轉(zhuǎn)移供體的步驟。
37.權(quán)利要求36所述的二倍體胚胎，其中所述的核轉(zhuǎn)移方法包括移植雄性和雌性單倍體基因組二者或按照權(quán)利要求1方法產(chǎn)生的細(xì)胞的步驟。
38.由單倍體胚胎產(chǎn)生的胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞或分化的細(xì)胞。
39.一種用于產(chǎn)生克隆的胚胎、胎兒或動物的改進(jìn)的核轉(zhuǎn)移方法，其中所述的改進(jìn)包括將由單倍體胚胎產(chǎn)生的胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞或分化的細(xì)胞用作核轉(zhuǎn)移供體。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于增殖雄性或雌性來源的單倍體基因組和對其進(jìn)行遺傳篩選和修飾的方法?？梢詫⑦@些單倍體基因組用于生產(chǎn)單倍體胚胎和胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞和分化的細(xì)胞。此外,這些單倍體基因組和含有這些單倍體基因組的細(xì)胞可以用作產(chǎn)生二倍體核轉(zhuǎn)移單位的核轉(zhuǎn)移供體?？梢詫⑦@些二倍體NT單位、例如人NT單位用于獲得多能細(xì)胞和分化細(xì)胞以及組織。
文檔編號G01N33/566GK1387401SQ00815283
公開日2002年12月25日 申請日期2000年11月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月2日
發(fā)明者J·M·羅博爾, P·莫雷拉 申請人:馬薩諸塞大學(xué)