一種軟骨細胞培養(yǎng)基及軟骨細胞培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種軟骨細胞培養(yǎng)基及軟骨細胞培養(yǎng)方法。能夠降低軟骨細胞的去分化，提高軟骨細胞的增殖能力。本發(fā)明實施例提供的軟骨細胞培養(yǎng)基包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、濃度為5-20％的血清、濃度為1-20ng/ml的血小板源性生長因子和濃度為(1-5)*10-5M/Lβ-巰基乙醇。
【專利說明】_種軟骨細胞培養(yǎng)基及軟骨細胞培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及軟骨細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種軟骨細胞培養(yǎng)基及軟骨細胞培養(yǎng)方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 關(guān)節(jié)軟骨主要是由軟骨細胞和細胞外基質(zhì)組成的無血管組織，主要依靠關(guān)節(jié)的運 動和擠壓吸收營養(yǎng)物質(zhì)，所以軟骨損傷后自我修復(fù)能力比較弱，其損傷后的修復(fù)移植一直 以來是醫(yī)學界的難題之一。近年來，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，自體軟骨移植在軟骨損傷的 臨床治療在國內(nèi)外都有應(yīng)用。臨床研宄對患者組織取材有限，并且也因為軟骨細胞是終末 分化細胞，體外增殖能力有限且易去分化，所以對體外軟骨細胞的培養(yǎng)和擴增成為目前要 解決的關(guān)鍵。
[0003] 為了對體外軟骨細胞進行培養(yǎng)和擴增，出現(xiàn)了多種培養(yǎng)軟骨細胞的軟骨細胞培 養(yǎng)基。例如，現(xiàn)有技術(shù)提供的一種傳統(tǒng)軟骨細胞培養(yǎng)基的配方為：培養(yǎng)基+10%自體血清 +60 μ g/ml Vco
[0004] 但是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該軟骨細胞培養(yǎng)基在培養(yǎng)軟骨細胞的過程中，軟骨細胞去 分化趨勢嚴重，軟骨細胞的增殖能力差，極大的限制了軟骨細胞的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的在于，提供一種軟骨細胞培養(yǎng)基及軟骨細胞培養(yǎng)方法，能夠降 低軟骨細胞的去分化，提高軟骨細胞的增殖能力。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 第一方面，本發(fā)明實施例提供一種軟骨細胞培養(yǎng)基，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、濃度為 5-20%的血清、濃度為1-20叩/1111的血小板源性生長因子和濃度為（1-5)*10-51/1^-巰基 乙醇。
[0008] 優(yōu)選的，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括濃度為1-15 ng/ml的骨形成蛋白BMP-2或者 其類似物。
[0009] 優(yōu)選的，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括濃度為5-100ng/ml的堿性成纖維生長因子 bFGF和濃度為3-30ng/ml的轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β。
[0010] 優(yōu)選的，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括濃度為20-200 μ g/ml的維生素 C。
[0011] 優(yōu)選的，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括濃度為2-20 μ g/ml的胰島素和濃度為 l-20ng/ml的胰島素生長因子IGF-I。
[0012] 優(yōu)選的，所述血清為胎牛血清或者自體血清。
[0013] 優(yōu)選的，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括濃度為（0. 5-5) *10-6M/L的地塞米松。
[0014] 優(yōu)選的，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括濃度為1 %的丙酮酸鈉和2-20ng/ml的白細 胞介素（IL-I)。
[0015] 優(yōu)選的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM或者DF12。
[0016] 另一方面，本發(fā)明實施例提供一種軟骨細胞培養(yǎng)方法，通過使用第一方面所述的 軟骨細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)預(yù)先制備的原代人軟骨細胞，獲取傳代3-5次的軟骨細胞。
[0017] 優(yōu)選的，軟骨細胞的培養(yǎng)方法還包括：制備原代人軟骨細胞，具體為：
[0018] 將人關(guān)節(jié)軟骨組織用0. 05-1 % II型膠原酶消化；
[0019] 將完成消化的細胞用培養(yǎng)液稀釋后，離心收集細胞；
[0020] 用培養(yǎng)液離心洗滌，獲取原代人軟骨細胞。
[0021] 本發(fā)明實施例提供的一種軟骨細胞培養(yǎng)基包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、濃度為5-20%的血 清、濃度為l_20ng/ml的血小板源性生長因子和濃度為（1-5)*10-5M/Lf3-巰基乙醇。該軟 骨細胞培養(yǎng)基用于培養(yǎng)軟骨細胞，能夠改善軟骨細胞的培養(yǎng)狀態(tài)，降低軟骨細胞去分化趨 勢，提高軟骨細胞的增殖能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述 中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些 實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附 圖獲得其它的附圖。
[0023] 圖l_a為使用相應(yīng)的A-G培養(yǎng)基培養(yǎng)的軟骨細胞傳代一次的光學顯微照片；
[0024] 圖Ι-b為使用相應(yīng)的A-G培養(yǎng)基培養(yǎng)的軟骨細胞傳代兩次的光學顯微照片；
[0025] 圖1-c為使用相應(yīng)的A-G培養(yǎng)基培養(yǎng)的軟骨細胞傳代三次的光學顯微照片；
[0026] 圖2為對軟骨細胞培養(yǎng)基A-G培養(yǎng)的第三代細胞進行甲苯胺藍染色的光學顯微照 片；
[0027] 圖3為對軟骨細胞培養(yǎng)基A-G培養(yǎng)的第三代細胞進行II型膠原免疫組化分析的光 學顯微照片。

【具體實施方式】
[0028] 現(xiàn)將詳細地提供本發(fā)明實施方式的參考，其一個或多個實例描述于下文。提供每 一實例作為解釋而非限制本發(fā)明。實際上，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯而易見的是，可以對 本發(fā)明進行多種修改和變化而不背離本發(fā)明的范圍或精神。例如，作為一個實施方式的部 分而說明或描述的特征可以用于另一實施方式中，來產(chǎn)生更進一步的實施方式。因此，基于 本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0029] 本發(fā)明實施例所涉及的材料均可以通過商業(yè)途徑或通過 申請人:獲取。
[0030] 一方面，本發(fā)明實施例提供一種軟骨細胞培養(yǎng)基，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、濃度為 5-20%的血清、濃度為1-20叩/1111的血小板源性生長因子和濃度為（1-5)*10-51/1^-巰基 乙醇。
[0031] 本發(fā)明實施例提供的軟骨細胞培養(yǎng)基用于培養(yǎng)軟骨細胞，能夠改善軟骨細胞的培 養(yǎng)狀態(tài)，降低軟骨細胞去分化趨勢，提高軟骨細胞的增殖能力。
[0032] 其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以為通過商業(yè)途徑獲得的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如，可以為DMEM 或者DF12, DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，DF12為F12培養(yǎng)基和DMEM以1 : 1比例混合形成的一種培養(yǎng)基，F(xiàn)12含有較豐富的成分，這兩種培養(yǎng)基能夠為軟骨細胞生長 提供多種營養(yǎng)成分。
[0033] 該基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以為各種形態(tài)，例如，可以為液體形態(tài)或者干粉形態(tài)，針對不同形 式形態(tài)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以采用不同的處理方法配置獲取軟骨細胞培養(yǎng)基。
[0034] 例如，當基礎(chǔ)培養(yǎng)基為干粉形態(tài)時，配置獲取軟骨細胞培養(yǎng)基的方法可以為：先將 干粉形態(tài)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入無菌超純水充分溶解，定容；再用〇. 22微米濾膜過濾得到無菌 的澄清溶液；然后根據(jù)軟骨細胞培養(yǎng)基的配方添加其他組分，最終采用酸堿調(diào)節(jié)試劑調(diào)節(jié) pH值至7. 0-7. 5即可。
[0035] 再例如，當基礎(chǔ)培養(yǎng)基為液體形態(tài)時，配置獲取軟骨細胞培養(yǎng)基的方法可以為：取 適量液體形態(tài)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；根據(jù)軟骨細胞培養(yǎng)基的配方添加其他組分，再采用酸堿調(diào)節(jié) 試劑調(diào)節(jié)PH值符合配方要求至7. 0-7. 5即可。
[0036] 其中，在此對所選擇的酸堿調(diào)節(jié)試劑不做限制。優(yōu)選的，可以為10% NaOH或者 10% HClo
[0037] 其中，所述血清可以為動物血清、胎牛血清、人血清、自體血清等。優(yōu)選的，為了保 證軟骨細胞的培養(yǎng)效果，可以將血清在無菌狀態(tài)下進行滅活、殺菌消毒處理。優(yōu)選的，為了 避免經(jīng)異種或異體血清培養(yǎng)的軟骨細胞存在試劑殘留導(dǎo)致移植后發(fā)生排異反應(yīng)及血清制 品微生物污染問題，該血清可以選擇自體血清。自體血清的制備方法可以為：
[0038] 血樣分離得到血清；將所得血清用0. 22微米過濾器進行過濾兩次；再將獲得的血 清在56°C水浴滅活熱原至少30min ;得到所需自體血清。
[0039] 其中，所述血小板源性生長因子是一種使軟骨細胞集落性生長的物質(zhì)，能夠提高 軟骨細胞活性，促進細胞增殖；β -巰基乙醇經(jīng)試驗證明具有抗氧化作用，能夠在培養(yǎng)過程 中防止自由基對細胞產(chǎn)生氧化。添加這兩種因子組合得到的軟骨細胞培養(yǎng)基能夠提高軟骨 細胞的增殖能力。
[0040] 其中，優(yōu)選的，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括濃度為l-15ng/ml的骨形成蛋白ΒΜΡ-2 或者其類似物，BMP-2或者其類似物能夠促進原代細胞成熟和分化作用，和其他因子有協(xié)同 作用，促進細胞增殖。其中，BMP-2的類似物可以為BMP-4。
[0041] 優(yōu)選的，軟骨細胞培養(yǎng)基還包括濃度為5-100ng/ml的堿性成纖維生長因子bFGF 和濃度為3-30ng/ml的轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β。堿性成纖維生長因子是軟骨細胞有絲分裂 原，轉(zhuǎn)化生長因子具有促進原代軟骨細胞成熟，維持軟骨表型的作用。
[0042] 優(yōu)選的，軟骨細胞培養(yǎng)基還包括濃度為20-150 μ g/ml的維生素 C。維生素 C能夠 促進軟骨細胞增殖和細胞外基質(zhì)分泌，保護細胞免受自由基的傷害。
[0043] 優(yōu)選的，軟骨細胞培養(yǎng)基還包括濃度為2-20 μ g/ml的胰島素和濃度為l-20ng/ml 的胰島素樣生長因子IGF-I。胰島素和胰島素樣生長因子都能夠促進軟骨細胞增殖。
[0044] 優(yōu)選的，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括濃度為（0.5-5)*10-6M/L的地塞米松。地塞 米松可以抑制軟骨細胞過度增殖，能夠促進細胞分泌蛋白多糖。
[0045] 優(yōu)選的，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括濃度為1 %的丙酮酸鈉和2-20ng/ml的白細 胞介素（IL-I)。其中，丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源，用于細胞代謝；白細胞介 素（IL-I)在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細胞，介導(dǎo)細胞活化、增殖與分化方面起重要作用。
[0046] 另一方面，本發(fā)明實施例提供一種軟骨細胞培養(yǎng)方法，通過使用上述實施例所述 的軟骨細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)預(yù)先制備的原代人軟骨細胞，獲取傳代3-5次的軟骨細胞。
[0047] 本發(fā)明實施例提供的軟骨細胞的培養(yǎng)方法，使用的軟骨細胞培養(yǎng)基包括：基 礎(chǔ)培養(yǎng)基、濃度為5-20%的血清、濃度為l-20ng/ml的血小板源性生長因子和濃度為 (1-5) *10-5M/L β -巰基乙醇，能夠改善軟骨細胞的培養(yǎng)狀態(tài)，降低軟骨細胞去分化趨勢，提 高軟骨細胞的增殖能力。
[0048] 其中，所用原代人軟骨細胞可以通過商業(yè)途徑獲得，也可以通過以下方法制備：
[0049] 1、無菌獲得200-300mg的人關(guān)節(jié)軟骨組織，并用0. 05-1 % II型膠原酶消化；
[0050] 其中，為了避免外來器械對細胞培養(yǎng)室造成污染，以及軟骨組織直接照射紫外對 軟骨細胞的活性大分子物質(zhì)造成破壞，影響軟骨細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果，優(yōu)選的，在進入萬 級潔凈區(qū)之前，對裝有軟骨組織的組織包裝箱進行紫外照射消毒殺菌，并且在進入細胞培 養(yǎng)室前脫外包，將裝有軟骨組織的離心管噴涂酒精消毒后在百級超凈臺取出軟骨組織。
[0051] 其中，為了提高對軟骨組織的消化效率，優(yōu)選的，可以對組織進行清洗，分選以除 去不必要的雜質(zhì)，如軟骨上附帶的肌肉組織等，并剪切成lmm3大小的軟骨組織小塊。
[0052] 2、將完成消化的細胞離心，收集細胞；
[0053] 具體的，離心的方法可以為：將完成消化的細胞和細胞消化液收集于離心管中，用 培養(yǎng)液（DMEM+5%胎牛血清FBS)稀釋消化液兩倍后，以1200r/min進行離心8min。
[0054] 3、對第一次離心獲得的沉淀重懸，離心洗滌一次，獲得原代人軟骨細胞。

【具體實施方式】
[0055]
[0056] 以下，將參照本發(fā)明的實施例、對照例以及試驗例詳述本發(fā)明。這些實施例僅是為 了具體說明本發(fā)明而提出的示例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以知道的是本發(fā)明的范圍不受這些實 施例、對照例以及試驗例的限制。
[0057] 對照例：
[0058] 為了方便起見，將對照例的軟骨細胞培養(yǎng)基稱為G配方。
[0059] G配方的配制：
[0060] 向基礎(chǔ)培養(yǎng)基粉末DMEM加入無菌超純水，溶解定容，充分溶解后，用0. 22微米的 濾膜進行過濾，封裝。再向基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加10%自體血清和60 μ g/ml Vc。
[0061] 實施例I
[0062] 為了方便起見，將實施例1的軟骨細胞培養(yǎng)基稱為A配方。
[0063] A配方的配制：
[0064] 向基礎(chǔ)培養(yǎng)基干粉DMEM加入無菌超純水，溶解定容，充分溶解后，用0. 22微米的 濾膜進行過濾，封裝，再向基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加10%自體血清和60yg/ml Vc，和因子組合獲 得A配方。A配方如表1所示：
[0065] 表 1
[0066]

【權(quán)利要求】
1. 一種軟骨細胞培養(yǎng)基，其特征在于，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、濃度為5-20%的血清、濃度 為l-20ng/ml的血小板源性生長因子和濃度為（1-5)*10-5M/Lf3-巰基乙醇。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的軟骨細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括 濃度為l_15ng/ml的骨形成蛋白BMP-2或者其類似物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的軟骨細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包 括濃度為5-100ng/ml的堿性成纖維生長因子bFGF和濃度為3-30ng/ml的轉(zhuǎn)化生長因子 TGF- 0 〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的軟骨細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括 濃度為20-200 y g/ml的維生素 C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的軟骨細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括 濃度為2-20 y g/ml的胰島素和濃度為l-20ng/ml的胰島素生長因子IGF-1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的軟骨細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述血清為胎牛血清或者自 體血清。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的軟骨細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括 濃度為（〇. 5-5)*10-6M/L的地塞米松。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的軟骨細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述軟骨細胞培養(yǎng)基還包括 濃度為1%的丙酮酸鈉和2-20ng/ml的白細胞介素（IL-1)。
9. 一種軟骨細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括： 通過使用權(quán)利要求1-8任一項所述的軟骨細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)預(yù)先制備的原代人軟骨細 胞，獲取傳代3-5次的軟骨細胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的軟骨細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，還包括：制備原代人軟骨 細胞，具體為： 將人關(guān)節(jié)軟骨組織用0. 05-1% II型膠原酶消化； 將完成消化的細胞用培養(yǎng)液稀釋后，離心收集細胞； 用培養(yǎng)液離心洗滌，獲取原代人軟骨細胞。
【文檔編號】C12N5/077GK104480066SQ201410842786
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月30日
【發(fā)明者】邱彩娥, 田智泉, 朱君, 郭靜 申請人:陜西瑞盛生物科技有限公司