一種耐多種純有機(jī)溶劑的脂肪酶及其編碼基因和在多種高產(chǎn)酯類化合物合成中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種耐多種純有機(jī)溶劑的脂肪酶及其編碼基因和在多種高產(chǎn)酯類化合物合成中的應(yīng)用。本發(fā)明的脂肪酶SSL1970，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，編碼所述的脂肪酶SSL1970的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的脂肪酶SSL1970來源于鏈霉菌Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46，能在多種純有機(jī)溶劑中長時(shí)間保持其結(jié)構(gòu)和生物活性的完整，特別是能耐受多種醇，并以各種醇為反應(yīng)介質(zhì)催化這些醇作為底物之一與多種不同鏈長的脂肪酸反應(yīng)，用于多種高產(chǎn)酯類化合物的生物制造。
【專利說明】一種耐多種純有機(jī)溶劑的脂肪酶及其編碼基因和在多種高 產(chǎn)酯類化合物合成中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和生物催化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種耐多種純有機(jī)溶劑的脂 肪酶及其編碼基因和在多種高產(chǎn)酯類化合物合成中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】：
[0002] 中短鏈脂肪酸酯是一類非常重要的香料化合物，主要用于配制奶油及草莓、櫻桃 等所有水果型香精，也可用于香煙、日化產(chǎn)品或其它產(chǎn)品的香原料，同時(shí)也是一種優(yōu)良的有 機(jī)溶劑。長鏈脂肪酸酯具有很好的潤滑性，主要用作乳劑類化妝品的潤滑劑，能賦予化妝品 良好的涂敷性，與皮膚有較好的親和性，易被皮膚組織所吸收，使皮膚柔軟。工業(yè)上生產(chǎn)這 類化合物的方法主要是使脂肪酸和醇直接酯化，一直沿用強(qiáng)酸（如濃硫酸、對(duì)甲苯磺酸等） 作催化劑。盡管強(qiáng)酸作為酯化合成催化劑具有理想的催化活性且價(jià)格低廉，但強(qiáng)酸易使有 機(jī)物碳化和氧化，且具有選擇性差、產(chǎn)品色澤深、能耗高、副反應(yīng)多、對(duì)設(shè)備腐蝕嚴(yán)重和污染 環(huán)境等缺點(diǎn)。再有，傳統(tǒng)的生物提取法又由于受資源匱乏、產(chǎn)率低、分離困難等缺點(diǎn)的制約 而無法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。因此，國內(nèi)外都在探索一些種綠色環(huán)保并且高效的生產(chǎn)方法，其中 生物催化（酶）法是人們最為關(guān)注的生產(chǎn)方法之一。酶在工業(yè)生產(chǎn)中具有很大的優(yōu)勢，能 在常溫常壓下反應(yīng)，反應(yīng)速率快，催化作用專一，無污染，價(jià)格較低等。
[0003] 脂肪酶（EC3. I. 1. 3)是一種酯鍵水解酶，它可在油水界面催化長鏈甘油三酸酯水 解形成甘油二酯、甘油單酯或甘油及游離脂肪酸；而它在非水介質(zhì)中又能催化酸的羧基與 醇的羥基進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)產(chǎn)生酯類化合物。脂肪酶廣泛的存在于動(dòng)物、植物和微生物中， 其中動(dòng)物胰臟和微生物是脂肪酶的主要來源。目前脂肪酶已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于食品釀造、 農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥化學(xué)、制漿造紙工業(yè)、污水處理和生物修復(fù)等領(lǐng)域。其中，有些脂肪酶能在有機(jī)介 質(zhì)中起催化作用，被廣泛應(yīng)用于酯類化合物的合成。目前，在有機(jī)介質(zhì)中脂肪酶催化相應(yīng)的 酸和醇合成辛酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯和戊酸乙酯已有相關(guān)的報(bào)道。在食品加工方面， 固定化的脂肪酶現(xiàn)在已被用于芳香酯的合成，比如利用脂肪酶制備的呈天然水果味的低分 子量芳香酯。
[0004] 目前有關(guān)辛酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯等酯類化合物的酶法合成均是以相應(yīng)的 酸和醇為底物在正己烷、正庚烷、異辛烷等有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行，最終的酯化率一般為90%左 右，底物酸的濃度在〇. 04?I. OM之間。由于大部分脂肪酶對(duì)高濃度的酸或者醇極為敏感， 故在合成反應(yīng)中底物濃度往往較低進(jìn)而獲得產(chǎn)物的含量較少，無法滿足工業(yè)化的需求。因 此尋找天然耐高濃度的酸或者醇的脂肪酶，使其在酯類化合物的合成中提高催化效率以及 產(chǎn)物的含量具有重要的實(shí)用意義。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種耐多種純有機(jī)溶劑的脂肪酶SSL1970。該脂肪 酶SSL1970來源于鏈霉菌Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46,能在多種純有機(jī)溶劑 中長時(shí)間保持其結(jié)構(gòu)和生物活性的完整，特別是能耐受多種醇，并以各種醇為反應(yīng)介質(zhì)催 化這些醇作為底物之一與多種不同鏈長的脂肪酸反應(yīng)，用于多種高產(chǎn)酯類化合物的生物制 造。
[0006] 本發(fā)明的脂肪酶SSL1970,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種編碼脂肪酶SSL1970的基因，其特征在于，編碼 氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的脂肪酶SSL1970的基因。
[0008] 本發(fā)明的編碼脂肪酶SSL1970的基因，優(yōu)選，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種表達(dá)載體，其特征在于，含有上述編碼脂肪酶 SSL1970的基因。
[0010] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種含有上述表達(dá)載體的微生物。
[0011] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供脂肪酶SSL1970在催化多種酸的羧基與多種醇的羥 基進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)產(chǎn)生酯類化合物中的應(yīng)用。
[0012] 當(dāng)本發(fā)明的脂肪酶SSL1970在催化多種酸的羧基與多種醇的羥基進(jìn)行脫水縮合 反應(yīng)產(chǎn)生酯類化合物時(shí)，所有反應(yīng)不需要加入額外的反應(yīng)介質(zhì)而是直接以其中一種底物 (醇）作為反應(yīng)的介質(zhì)進(jìn)行高效的催化合成。
[0013] 所述的酯類化合物，優(yōu)選為乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、 十一酸分別與乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇合成相 應(yīng)的中短鏈脂肪酸酯化合物，或月桂酸、十四酸、軟脂酸分別與丙醇、異丙醇、丁醇、戊醇、己 醇合成相應(yīng)的長鏈脂肪酸酯化合物。
[0014] 所述的脂肪酶SSL1970在催化多種酸的羧基與多種醇的羥基進(jìn)行脫水縮合反應(yīng) 產(chǎn)生酯類化合物中的應(yīng)用，底物酸的濃度為1?4M，最適為2?3M ;催化反應(yīng)的溫度為40? 50°C ;脂肪酶SSL1970在催化反應(yīng)體系中的用量為10g/L。
[0015] 在本發(fā)明的催化合成反應(yīng)體系中，所述的各種醇分別作為反應(yīng)的介質(zhì)，同時(shí)作為 其中的底物之一提供羥基，所述的各種底物酸的濃度為I. 0M，合成反應(yīng)溫度為40°C，脂肪 酶SSL1970的使用量為10g/L的條件下，合成相應(yīng)的芳香酯類香料，反應(yīng)20h后酯化率全部 達(dá)到100%。
[0016] 本發(fā)明的脂肪酶SSL1970,水解活性最高的底物為對(duì)硝基苯基辛酸酯（p-NP C8)， 其次為對(duì)硝基苯基月桂酸酯（P-NP C12)與對(duì)硝基苯基己酸酯（p-NP C6)。反應(yīng)的最適pH 值為8. 5,在pH = 7. 5?10. 0之間具有較高的水解活性。反應(yīng)的最適溫度為40°C，30? 45°C之間保留有較高的水解活性。
[0017] 本發(fā)明的脂肪酶SSL1970經(jīng)冷凍干燥制成酶粉后，對(duì)多種純有機(jī)溶劑具有很好的 耐受性，特別是對(duì)多種醇具有很好的耐受性，使得在不需要添加額外的反應(yīng)介質(zhì)的條件下 可應(yīng)用于各種脂肪酸酯化合物的合成。合成反應(yīng)中，底物酸的最高濃度達(dá)到4. OM以上；合 成反應(yīng)的最適溫度為50°C;合成反應(yīng)中催化劑脂肪酶SSL1970的使用量為10g/L ;各種酯類 化合物獲得的最高酯化率為100%，最高初始酯化速率達(dá)到50mmol
[0018] 本發(fā)明與傳統(tǒng)的化學(xué)合成相比，具有反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)能耗低、產(chǎn)品質(zhì)量好和無 污染的優(yōu)點(diǎn)；與目前報(bào)道的酶法合成相比，不需要添加額外的反應(yīng)介質(zhì)，產(chǎn)物含量高，分離 步驟更簡捷。該酶用于各種酯類化合物香料以及生物表面活性劑的合成，制備的化合物純 度高、品質(zhì)好、分離步驟簡捷等，屬于天然產(chǎn)物，可應(yīng)用于食品、香煙和日化產(chǎn)品等生產(chǎn)行 業(yè)，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0019] 本發(fā)明從來源于鏈霉菌Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46中克隆到一個(gè) 新的脂肪酶SSL1970,該脂肪酶的一大特點(diǎn)是，能耐受多種純有機(jī)溶劑，特別是多種醇，在這 些有機(jī)溶劑中能長時(shí)間保持酶整體結(jié)構(gòu)和生物活性的完整；另一新穎的特點(diǎn)是，能夠催化 多種醇（從乙醇到癸醇，以及比癸醇分子量更大的醇）作為反應(yīng)介質(zhì)的同時(shí)也作為底物之 一與多種羧酸（從丁酸到十一酸）進(jìn)行反應(yīng)，高效合成一系列相應(yīng)的中短鏈脂肪酸酯類化 合物，并且酯化率最高均能達(dá)到100%，初始酯化速率在較高濃度的底物酸存在下表現(xiàn)較高 數(shù)值，以及催化丙醇、異丙醇、丁醇、戊醇、己醇分別與月桂酸、十四酸、軟脂酸反應(yīng)生成相應(yīng) 的長鏈脂肪酸酯類化合物，酯化率大于95%。
[0020] 用于本發(fā)明的鏈霉菌Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46為本發(fā)明人所在 的實(shí)驗(yàn)室從南海深海沉積物中分離得到并保藏。本 申請(qǐng)人:保證自申請(qǐng)日起20年內(nèi)向公眾 提供該鏈霉菌 Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46〇

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0021] 圖1是脂肪酶對(duì)不同底物p-NP (C2-C16)進(jìn)行水解分析的圖；
[0022] 圖2是以p-NP C8為底物，在不同pH的緩沖液下分析脂肪酶SSL1970水解活性的 影響圖；
[0023] 圖3是以p-NP C8為底物，在pH = 8. 5的Tris-HCl緩沖液下分析不同反應(yīng)溫度 對(duì)脂肪酶SSL1970水解活性的影響圖；
[0024] 圖4是在各種純的有機(jī)溶劑處理下脂肪酶SSL1970的耐受性；
[0025] 圖5是脂肪酶SSL1970催化各種酸和醇生成中短鏈脂肪酸酯的反應(yīng)模式；
[0026] 圖6是脂肪酶SSL1970催化各種酸和醇生成長鏈脂肪酸酯的反應(yīng)模式；
[0027] 圖7是脂肪酶SSL1970催化戊醇與戊酸生成戊酸戊酯的底物酸濃度影響初始酯化 速率的分析圖；
[0028] 圖8是脂肪酶SSL1970催化戊醇與戊酸生成戊酸戊酯的底物酸濃度影響酯化率的 分析圖；
[0029] 圖9是脂肪酶SSL1970催化戊醇與戊酸生成戊酸戊酯的反應(yīng)溫度影響初始酯化速 率的分析圖；
[0030] 圖10是脂肪酶SSL1970催化戊醇與戊酸生成戊酸戊酯的反應(yīng)溫度影響酯化率的 分析圖。

【具體實(shí)施方式】：
[0031] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0032] 在本發(fā)明實(shí)施例中所用到的限制性內(nèi)切酶EcoRI和Hind III購自ThermoFisher公 司；表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)購自Novagen公司；大腸桿菌BL21(DE3)菌株的感受態(tài)細(xì)胞購自 北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0033] 實(shí)施例1 :
[0034] 1、鏈霉菌 Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46 的分離與鑒定
[0035] 鏈霉菌Streptomyces scopuliridis分離自南海深海沉積物，培養(yǎng)好的菌體用 于總 DNA 的提取。所用試劑盒為 GeneJET Genomic DNA Purification Kit (購自 Thermo scientific 公司）。
[0036] 2、脂肪酶SSL1970基因的克隆、表達(dá)及酶粉制備
[0037] 根據(jù)全基因組中脂肪酶SSL1970的基因序列分析，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物擴(kuò)增該基因并連 接到表達(dá)載體pET-28a(+)上，然后導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行高效表達(dá)。
[0038] 設(shè)計(jì)引物如下：上游引物為V -CGGAATTCGTCCGGGCCACAGGGCTGAC-3，；下游引 物為 Y -ACCCAAGCTTTCAGCCGAGCACCGACGAGC-3,，上下游引物的 Y 端分別設(shè)計(jì)了 EcoRI 和Hind III酶切位點(diǎn)（下劃線標(biāo)記部分），以鏈霉菌Streptomyces scopuliridis的基因組 DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：弘乃訓(xùn)設(shè)抓1' FastPfu Buffer 10 yL，dN ??？8(6&(*2.51111)5 4 1^，上游引物（1(^]\〇14 1^，下游引物（1(^]\〇14 1^，模板0嫩（10〇1^/ μ L) 1 μ L, TransStart" FastPfu DNA PolyMerase (2. 5U/ μ L) 1 μ L，ddH20 31 μ L。PCR 擴(kuò)增 反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C保溫2分鐘，然后95°C 20秒、60°C 20秒、72°C 30秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后 72°C進(jìn)行5分鐘。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，上述引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其含有951bp的堿基，命名為SSL1970基因，將其在ncbi中進(jìn)行blastx比對(duì) 分析，表明其與來源 Streptomyces scopuliridis 的脂肪酶（ACCESSION :WP_030354947)具 有96%的一致性，同時(shí)也與其它的Streptomyces屬來源的脂肪酶具有較高的序列一致性， 但均小于87%。根據(jù)這株菌中的DNA序列，以及生物信息學(xué)知識(shí)推測這個(gè)orf編碼一個(gè)脂 肪酶，但是并沒有對(duì)這個(gè)脂肪酶的功能進(jìn)行相應(yīng)鑒定以及應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。脂肪酶SSL1970 基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，含有316個(gè)氨基酸，命名為脂肪酶SSL1970。
[0039] 對(duì)上述含有脂肪酶SSL1970基因的PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒（購自Magen公司） 純化回收目的擴(kuò)增片段，分別用EcoRI和Hind III酶切含有脂肪酶SSL1970基因的PCR產(chǎn)物 (目的擴(kuò)增片段）和表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)，然后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，使脂肪酶SSL1970基 因插入到表達(dá)質(zhì)粒pET-28a (+)中，經(jīng)測序驗(yàn)證，確認(rèn)脂肪酶SSL1970基因插入到表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a(+)的EcoRI和Hind III位點(diǎn)之間，由此得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-SSL1970。
[0040] 把重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-SSL1970轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)菌株的感受態(tài) 細(xì)胞中，挑取轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)基中，在37°C搖床中培養(yǎng)，當(dāng)OD6c?達(dá)到0. 8左右時(shí)，加入 IPTG使其終濃度達(dá)到0. 2mmol/L，轉(zhuǎn)置20°C繼續(xù)培養(yǎng)20h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)好 的發(fā)酵液離心收集菌體，利用破胞緩沖液洗滌菌體一次，再利用破胞緩沖液重懸菌體后在 冰浴條件下利用超聲波進(jìn)行破胞，破胞至菌液澄清，ll〇〇〇rpm/min離心20分鐘離心收集上 清，所收集的上清液即為粗酶液，可用于純酶與酶粉的制備。粗酶液通過鎳離子親和層析柱 純化后得到純酶（由脂肪酶SSL1970基因編碼的脂肪酶SSL1970,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示）。酶粉直接用粗酶液凍結(jié)后，在冷凍干燥機(jī)中制備。
[0041] 3、脂肪酶SSL1970的水解活性分析
[0042] 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系為lmL，包含0. 05 μ g純酶（脂肪酶SSL1970)，IOOmM的p-NP酯底 物，IOOmM的pH = 8. 0的磷酸鹽緩沖液，30°C反應(yīng)10分鐘，然后利用酶標(biāo)儀在405nm處檢測 底物的水解情況，并以相對(duì)酶活性進(jìn)行表征。
[0043] (1)、底物特異性分析
[0044] 按照標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，對(duì)不同底物p-NP (C2-C16)進(jìn)行水解分析，結(jié)果如圖1所示。
[0045] 脂肪酶SSL1970水解活性最高的底物為對(duì)硝基苯基辛酸酯（p-NP C8)，其次為對(duì) 硝基苯基月桂酸酯（p-NP C12)與對(duì)硝基苯基己酸酯（p-NP C6)。
[0046] (2)、最適反應(yīng)pH值的分析
[0047] 按照標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，以p-NP C8為底物，在不同pH的緩沖液下分析脂肪酶SSL1970 的水解活性，結(jié)果如圖2所示。
[0048] 脂肪酶SSL1970的最適pH值為8. 5,在pH = 7. 5?10. 0之間具有較高的水解活 性。
[0049] (3)、最適反應(yīng)溫度的分析
[0050] 按照標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，以p-NP C8為底物，在pH = 8. 5的Tris-HCl緩沖液下分析不 同反應(yīng)溫度對(duì)脂肪酶SSL1970水解活性的影響，結(jié)果如圖3所示。
[0051] 脂肪酶SSL1970的最適溫度為40°C，30?45°C之間保留有較高的水解活性。
[0052] 4、脂肪酶SSL1970對(duì)純有機(jī)溶劑耐受性的分析
[0053] 等量的酶粉在室溫條件下（25°C )用各種純的有機(jī)溶劑（乙醇、丙醇、丁醇等）溶 解處理24h，然后離心除去有機(jī)溶劑并抽干后用適量的緩沖液溶解。以不加任何有機(jī)溶劑處 理的組份作為對(duì)照并設(shè)定為100%酶活，在最適PH值、最適反應(yīng)溫度等條件下測定經(jīng)各種 有機(jī)溶劑處理后脂肪酶SSL1970的相對(duì)酶活，結(jié)果如圖4所示。
[0054] 5、脂肪酶SSL1970催化羧酸與醇合成酯類化合物
[0055] 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系為10ml，以相應(yīng)的醇（乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、戊醇、 己醇、庚醇、辛醇、壬醇或癸醇）作為反應(yīng)的介質(zhì)以及底物之一，添加濃度為I. OM的羧酸 (乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸或十一酸）混勻，加入l〇g/L脂肪酶 SSL1970,在200rpm/min的搖床中進(jìn)行反應(yīng)，中短鏈脂肪酸酯合成的反應(yīng)樣式如圖5所示。 產(chǎn)物通過GC/MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，酯化率通過酸堿滴定法以及GC測定底物酸的消耗量間接計(jì) 算得出，反應(yīng)20h后酯化率均可達(dá)到100%。
[0056] 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系為10ml，以相應(yīng)的醇（丙醇、異丙醇、丁醇、戊醇或己醇）作為反應(yīng)的 介質(zhì)以及底物之一，添加濃度為I. OM的羧酸（月桂酸、十四酸或軟脂酸）混勻，加入10g/L 脂肪酶SSL1970,在200rpm/min的搖床中進(jìn)行反應(yīng)，長鏈脂肪酸酯合成的反應(yīng)樣式如圖6所 示。產(chǎn)物通過GC/MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，酯化率通過酸堿滴定法以及GC測定底物酸的消耗量間 接計(jì)算得出，酯化率大于95%。
[0057] 6、各種反應(yīng)參數(shù)對(duì)初始反應(yīng)速度和酯化率的影響
[0058] 在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，以脂肪酶SSL1970催化戊醇與戊酸合成戊酸戊酯作為展示的 例子試驗(yàn)了不同底物酸濃度以及不同合成溫度對(duì)初始酯化速率與酯化率的影響。
[0059] (1)、底物酸的濃度對(duì)初始酯化速率的分析
[0060] 按照標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，以脂肪酶SSL1970催化戊醇與戊酸的反應(yīng)為例，分析不同酸 濃度對(duì)初始酯化速率的影響，結(jié)果如圖7所示。當(dāng)?shù)孜镂焖岬臐舛葹?. OM時(shí)，初始酯化速 率等于20mmol 而當(dāng)?shù)孜镂焖岬臐舛冗_(dá)到4. OM時(shí)，由于受高濃度底物酸的抑制作 用，初始酯化速率有所下降，但酯化率仍然能達(dá)到98 %以上。
[0061] ⑵、底物酸的濃度對(duì)酯化率的分析
[0062] 按照標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，以脂肪酶SSL1970催化戊醇與戊酸的反應(yīng)為例，分析不同酸 濃度對(duì)酯化率的影響，結(jié)果所示如圖8。當(dāng)?shù)孜镂焖岬臐舛炔淮笥?. OM時(shí)，酯化率能達(dá)到 100%;而當(dāng)?shù)孜镂焖岬臐舛却笥?. OM時(shí)，由于反應(yīng)過程產(chǎn)生大量水分子使得最終酯化率有 所下降，為98%。
[0063] (3)、反應(yīng)溫度對(duì)初始酯化速率的分析
[0064] 按照標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，以脂肪酶SSL1970催化3. OM濃度的戊醇與戊酸的反應(yīng)為例， 分析不同反應(yīng)溫度對(duì)初始酯化速率的影響，結(jié)果如圖9所示。當(dāng)反應(yīng)溫度為50 °C時(shí)，初始酯 化速率最大。
[0065] (4)、反應(yīng)溫度對(duì)酯化率的分析
[0066] 按照標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，以脂肪酶SSL1970催化3. OM濃度的戊醇與戊酸的反應(yīng)為例， 在50°C的條件下分析不同溫度對(duì)酯化率的影響，結(jié)果如圖10所示。在各種反應(yīng)溫度的條 件下，酯化率均能達(dá)到100% ;而當(dāng)反應(yīng)溫度為50°C或者60°C時(shí)，由于反應(yīng)的初始速率比較 快，反應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)便達(dá)到最高的酯化率。
[0067] 以上所述實(shí)施方式是為了更好的解釋本發(fā)明，而不應(yīng)該被解釋為限制本發(fā)明，所 述內(nèi)容屬于本發(fā)明的主要內(nèi)容，但并不僅僅限于這些內(nèi)容。有些可以顯而易見地?cái)U(kuò)展的內(nèi) 容雖然并未在說明書中出現(xiàn)，但也應(yīng)屬于本發(fā)明的專利請(qǐng)求范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種脂肪酶SSL1970,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -種編碼權(quán)利要求1所述的脂肪酶SSL1970的基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼脂肪酶SSL1970的基因，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
4. 一種表達(dá)載體，其特征在于，含有權(quán)利要求2或3所述的編碼脂肪酶SSL1970的基 因。
5. -種含有權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體的微生物。
6. 權(quán)利要求1所述的脂肪酶SSL1970在催化多種酸的羧基與多種醇的羥基進(jìn)行脫水縮 合反應(yīng)產(chǎn)生酯類化合物中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂肪酶SSL1970在催化多種酸的羧基與多種醇的羥基進(jìn)行 脫水縮合反應(yīng)產(chǎn)生酯類化合物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的酯類化合物，為乙酸、丙酸、丁 酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸分別與乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、戊 醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇合成相應(yīng)的中短鏈脂肪酸酯化合物，或月桂酸、十四酸、軟 脂酸分別與丙醇、異丙醇、丁醇、戊醇、己醇合成相應(yīng)的長鏈脂肪酸酯化合物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述脂肪酶SSL1970在催化多種酸的羧基與多種醇的羥基進(jìn)行 脫水縮合反應(yīng)產(chǎn)生酯類化合物中的應(yīng)用，其特征在于，脂肪酶SSL1970在催化反應(yīng)體系中 的用量為l〇g/L。
【文檔編號(hào)】C12P7/62GK104480084SQ201410842886
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月30日
【發(fā)明者】胡云峰, 梁甲元, 張?jiān)? 孫愛君, 鄧盾 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院南海海洋研究所