本發(fā)明涉及一種病毒檢測(cè)方法，具體是一種食品中禽流感病毒的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
禽流感(Avianinfluenza，AI)是由A型流感病毒引起的一種嚴(yán)重危害禽類健康的傳染性疾病。禽類感染禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)后,癥狀可表現(xiàn)為非顯性感染、亞臨診感染,或輕度呼吸道疾病、產(chǎn)蛋量降低直至急性全身致死性疾病等多種形式。根據(jù)AIV對(duì)易感雞致病性的差異,可將AIV分為高致病性AIV和低致病性AIV。高致病性AIV(HPAIV)感染禽類所導(dǎo)致的禽流感對(duì)養(yǎng)禽業(yè)具有毀滅性的打擊,故被國(guó)際獸疫局規(guī)定為A類疾病;而一些低致病性AIV，如H9AIV的感染雖然對(duì)感染禽的致死率低,但可引起產(chǎn)蛋量的減少和淘汰率的上升,并造成免疫抑制,引起其他疫病的發(fā)生或混合感染，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失也相當(dāng)可觀。因此,AI一直是威脅世界養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一，世界各國(guó)都十分重視對(duì)AIV的研究工作。已有研究表明來自于禽類的H9N2禽流感病毒能偶爾從禽類傳染給哺乳動(dòng)物，包括人和豬。Ck/Bei-like和G1-likeH9N2禽流感病毒在1990底首次從人和豬中分離到。2003年分離到的人H9N2禽流感病毒是一個(gè)新的重組體，很可能來源于當(dāng)?shù)氐幕钋菔袌?chǎng)。這種跨種間傳播表明目前的H9N2禽流感病毒對(duì)人仍有潛在的感染性。AIV存在著廣泛的抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變現(xiàn)象,其抗原變異頻率很高。因此測(cè)定AIV的全基因序列，對(duì)于研究禽流感病毒的檢測(cè)、分布、流行規(guī)律以及控制禽流感的流行、蔓延均具有重要的意義。本研究分離鑒定了2002-2008年上海地區(qū)活禽市場(chǎng)的H9N2亞型禽流感病毒，經(jīng)全基因序列測(cè)定分為三種基因型，對(duì)這三種基因型毒株的8個(gè)基因片段進(jìn)行關(guān)鍵位點(diǎn)的分析以及基因進(jìn)化關(guān)系分析，表明這三種基因型與目前報(bào)道的基因型存在差異，為H9N2禽流感病毒Ck/Bei系中的三種新的基因型，分別命名為Y1,Y2,Y3。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便的食品中禽流感病毒的檢測(cè)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種食品中禽流感病毒的檢測(cè)方法，采用恒溫?cái)U(kuò)增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特異序列為靶序列，SYBER Green I為熒光染料，隨后進(jìn)行熒光定量檢測(cè)分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品通過生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后轉(zhuǎn)移到雞胚中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36-38℃，培養(yǎng)時(shí)間為6-8h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后提取總RNA,隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制得DNA；
（2）構(gòu)建恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系：
DNA模板 4μL，SYBER Green I熒光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸鈉溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，檸檬酸裂合酶4μL，硬脂酸鋅溶液 1μL，其余用dd H2O補(bǔ)足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7-1.9；
所述SYBER Green I熒光染料為10-20倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、松油醇；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甲酸甲酯溶液的濃度為8-14mmol/L；
所述磺酸鈉溶液的濃度為5-10mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7-1.9；
所述硬脂酸鋅溶液的濃度為20-40mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系加入到熒光定量機(jī)中，隨后進(jìn)行擴(kuò)增，95℃變性6min，90-93℃變性0.5-1.5min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸15min；
（4）檢測(cè)分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進(jìn)行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計(jì)。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：具體步驟（1）中培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為7h。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：具體步驟（2）中所述DNA模板的OD260/OD280值為1.8。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：具體步驟（2）中所述SYBER Green I熒光染料為15倍稀釋。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：具體步驟（2）中所述甲酸甲酯溶液的濃度為11mmol/L。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：具體步驟（2）中所述磺酸鈉溶液的濃度為8mmol/L。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：具體步驟（2）中所述DNA引物的OD260/OD280值為1.8。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：具體步驟（2）中所述硬脂酸鋅溶液的濃度為30mmol/L。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：具體步驟（3）中92℃變性1.0min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明檢測(cè)方法中，實(shí)驗(yàn)流程少，操作簡(jiǎn)便易行，消耗費(fèi)用低，和其他禽流感病毒檢測(cè)的方法相比較，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于通過反轉(zhuǎn)錄避免了RNA降解帶來結(jié)果的不穩(wěn)定性。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
實(shí)施例1
一種食品中禽流感病毒的檢測(cè)方法，采用恒溫?cái)U(kuò)增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特異序列為靶序列，SYBER Green I為熒光染料，隨后進(jìn)行熒光定量檢測(cè)分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品通過生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后轉(zhuǎn)移到雞胚中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36℃，培養(yǎng)時(shí)間為6h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后提取總RNA,隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制得DNA；
（2）構(gòu)建恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系：
DNA模板 4μL，SYBER Green I熒光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸鈉溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，檸檬酸裂合酶4μL，硬脂酸鋅溶液 1μL，其余用dd H2O補(bǔ)足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7；
所述SYBER Green I熒光染料為10倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、松油醇；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甲酸甲酯溶液的濃度為8mmol/L；
所述磺酸鈉溶液的濃度為5mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7；
所述硬脂酸鋅溶液的濃度為20mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系加入到熒光定量機(jī)中，隨后進(jìn)行擴(kuò)增，95℃變性6min，90℃變性0.5min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸15min；
（4）檢測(cè)分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進(jìn)行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計(jì)。
實(shí)施例2
一種食品中禽流感病毒的檢測(cè)方法，采用恒溫?cái)U(kuò)增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特異序列為靶序列，SYBER Green I為熒光染料，隨后進(jìn)行熒光定量檢測(cè)分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品通過生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后轉(zhuǎn)移到雞胚中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36℃，培養(yǎng)時(shí)間為6h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后提取總RNA,隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制得DNA；
（2）構(gòu)建恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系：
DNA模板 4μL，SYBER Green I熒光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸鈉溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，檸檬酸裂合酶4μL，硬脂酸鋅溶液 1μL，其余用dd H2O補(bǔ)足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7；
所述SYBER Green I熒光染料為13倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、松油醇；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甲酸甲酯溶液的濃度為10mmol/L；
所述磺酸鈉溶液的濃度為8mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7；
所述硬脂酸鋅溶液的濃度為25mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系加入到熒光定量機(jī)中，隨后進(jìn)行擴(kuò)增，95℃變性6min，91℃變性0.7min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸15min；
（4）檢測(cè)分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進(jìn)行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計(jì)。
實(shí)施例3
一種食品中禽流感病毒的檢測(cè)方法，采用恒溫?cái)U(kuò)增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特異序列為靶序列，SYBER Green I為熒光染料，隨后進(jìn)行熒光定量檢測(cè)分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品通過生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后轉(zhuǎn)移到雞胚中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為7h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后提取總RNA,隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制得DNA；
（2）構(gòu)建恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系：
DNA模板 4μL，SYBER Green I熒光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸鈉溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，檸檬酸裂合酶4μL，硬脂酸鋅溶液 1μL，其余用dd H2O補(bǔ)足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.8；
所述SYBER Green I熒光染料為15倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、松油醇；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甲酸甲酯溶液的濃度為11mmol/L；
所述磺酸鈉溶液的濃度為8mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.8；
所述硬脂酸鋅溶液的濃度為30mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系加入到熒光定量機(jī)中，隨后進(jìn)行擴(kuò)增，95℃變性6min，92℃變性1.0min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸15min；
（4）檢測(cè)分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進(jìn)行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計(jì)。
實(shí)施例4
一種食品中禽流感病毒的檢測(cè)方法，采用恒溫?cái)U(kuò)增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特異序列為靶序列，SYBER Green I為熒光染料，隨后進(jìn)行熒光定量檢測(cè)分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品通過生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后轉(zhuǎn)移到雞胚中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為38℃，培養(yǎng)時(shí)間為8h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后提取總RNA,隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制得DNA；
（2）構(gòu)建恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系：
DNA模板 4μL，SYBER Green I熒光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸鈉溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，檸檬酸裂合酶4μL，硬脂酸鋅溶液 1μL，其余用dd H2O補(bǔ)足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.9；
所述SYBER Green I熒光染料為18倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、松油醇；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甲酸甲酯溶液的濃度為12mmol/L；
所述磺酸鈉溶液的濃度為9mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.9；
所述硬脂酸鋅溶液的濃度為36mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系加入到熒光定量機(jī)中，隨后進(jìn)行擴(kuò)增，95℃變性6min，92℃變性1.2min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸15min；
（4）檢測(cè)分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進(jìn)行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計(jì)。
實(shí)施例5
一種食品中禽流感病毒的檢測(cè)方法，采用恒溫?cái)U(kuò)增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特異序列為靶序列，SYBER Green I為熒光染料，隨后進(jìn)行熒光定量檢測(cè)分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預(yù)處理：
在無菌環(huán)境下，將食品通過生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后轉(zhuǎn)移到雞胚中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為38℃，培養(yǎng)時(shí)間為8h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復(fù)使用生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后提取總RNA,隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制得DNA；
（2）構(gòu)建恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系：
DNA模板 4μL，SYBER Green I熒光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸鈉溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，檸檬酸裂合酶4μL，硬脂酸鋅溶液 1μL，其余用dd H2O補(bǔ)足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.9；
所述SYBER Green I熒光染料為20倍稀釋；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、松油醇；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甲酸甲酯溶液的濃度為14mmol/L；
所述磺酸鈉溶液的濃度為10mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.9；
所述硬脂酸鋅溶液的濃度為40mmol/L；
（3）熒光定量反應(yīng)：
將恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系加入到熒光定量機(jī)中，隨后進(jìn)行擴(kuò)增，95℃變性6min，93℃變性1.5min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸15min；
（4）檢測(cè)分析：
根據(jù)熒光定量分析軟件進(jìn)行定量分析，結(jié)果統(tǒng)計(jì)。
上面對(duì)本專利的較佳實(shí)施方式作了詳細(xì)說明，但是本專利并不限于上述實(shí)施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。