H9n2流感病毒血凝素蛋白elisa試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及H9N2流感病毒血凝素蛋白特異性單克隆抗體 制備，W及一種定量H9N2流感病毒血凝素蛋白雙抗夾也化ISA檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感是一種由禽流感病毒引起的疾病，所表現(xiàn)的臨床癥狀隨病毒亞型不同而 異。至今已發(fā)現(xiàn)的甲型流感病毒的血凝素16個亞型化1~化6)和神經(jīng)氨酸酶9個亞型 (N1~N9)均能從禽中分離到，但它們并不是都能引起禽流感。目前發(fā)現(xiàn)能感染人的禽流感 病毒主要有；冊N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3 和 H7N9 亞型。
[0003] H9N2是一種禽流感病毒，屬于正黏病毒科A型流感病毒屬。1966年化Mee從患溫 和呼吸道病的火雞中分離到第一株H9N2亞型禽流感病毒，之后H9N2亞型禽流感在世界范 圍內(nèi)迅速流行，尤其是1994~1999年在世界范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年，對我 國部分省市雞場進(jìn)行的禽流感血清學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，221個禽流感陽性雞群中H9亞型陽性雞 群占陽性群總數(shù)的93. 67%，證實了 H9N2亞型禽流感在我國廣泛存在，是當(dāng)前禽流感流行 的主要亞型。研究表明，近年來H9N2亞型部分流行株的致病力明顯變異，尤其對肉仔雞，死 亡率可達(dá)到30% W上；對產(chǎn)蛋高峰期的蛋雞，其產(chǎn)蛋下降幅度大，恢復(fù)困難，因此對養(yǎng)禽業(yè) 有巨大危害。
[0004] H9N2病毒在人類身上發(fā)現(xiàn)比較罕見，可W感染人但一般不致人死亡，主要傳染源 為禽類，在人群中不易傳播。1998年廣東省的流感監(jiān)測系統(tǒng)在韶關(guān)、燦頭市分別發(fā)現(xiàn)4例和 5例H9N2禽流感病毒感染病例，為全球首次發(fā)現(xiàn)人H9N2感染病例。W前認(rèn)為禽流感和人是 有種屬屏障的，但近幾年的禽流感感染人事件表明，該種屏障正在減弱或消失看，而且禽流 感不僅在雞、鴨、鶴、候鳥等禽類上發(fā)生，目前已經(jīng)開始波及到豬、老虎、海獅等哺乳類動物， 因此潛在危害性不斷加大。
[0005] H9N2禽流感病毒亞型毒性雖然弱于冊N1亞型，人群發(fā)病率低，但近年來，隨著傳 染源愈來愈多，感染譜逐漸擴(kuò)大，W及非典型性禽流感流行增多，給禽流感的消滅和控制帶 來了巨大困難，H9N2發(fā)生變異導(dǎo)致致病性增加和人際傳播，引發(fā)嚴(yán)重流感疫情的可能性一 直存在，因此人類在高度警惕冊N1的同時，也不能忽視H9N2的威脅。
[0006] 綜上所述，H9N2不但嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，其公共衛(wèi)生意義也日漸顯著。對 H9N2的檢測，在減少世界經(jīng)濟(jì)損失和提高人類衛(wèi)生健康方面，都具有深遠(yuǎn)的意義。目前 H9N2還是W基于核酸檢測的定量PCR方法為主，該種方法對環(huán)境，樣品W及儀器要求較高， 需要專業(yè)人員操作，不易推廣。另外，現(xiàn)有的基于化ISA原理的H9N2檢測試劑，缺點是無法 進(jìn)行定量檢測，而且針對不同流感病毒亞型的檢測特異性差，因此亟需一種操作簡單，靈敏 度好，特異性高的定量檢測試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、低成本的H9N2流感病毒血凝 素蛋白雙抗夾也法檢測試劑盒。
[0008] 本發(fā)明所提供的檢測試劑盒包括包含有包被單克隆抗體的固相載體，酶標(biāo)檢測多 克隆抗體W及蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、洗涂液、底物顯色液和反應(yīng)終止液。
[0009] 其中所述包被單克隆抗體為鼠單克隆抗體，其輕鏈和重鏈氨基酸序列分別為SEQ ID N0;1和SEQ ID N0;2;所述酶標(biāo)檢測多克隆抗體為辣根過氧化物酶Olorseradish peroxidase, HR巧標(biāo)記的兔多克隆抗體；所述蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為重組H9N2流感病毒血凝素蛋 白。
[0010] 所述鼠單克隆抗體采用重組H9N2流感病毒血凝素蛋白免疫動物，然后選擇高血 清效價小鼠通過經(jīng)典雜交瘤技術(shù)制備獲得；所述酶標(biāo)兔多克隆抗體采用H9N2流感病毒血 凝素蛋白免疫動物，通過蛋白A純化和抗原親和純化技術(shù)制備純化的多克隆抗體，然后按 照常規(guī)方法利用HRP標(biāo)記抗體獲得。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案為優(yōu)選具有高靈敏度、高特異性的單克隆抗體與酶標(biāo)多克隆 抗體配對組合，將單克隆抗體作為包被抗體吸附于固相載體上，包被抗體可W特異性的捕 獲樣本中的H9N2流感病毒血凝素蛋白W及蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，加入酶標(biāo)檢測抗體后，形成包被抗 體、抗原、檢測抗體復(fù)合物，相應(yīng)底物顯色后終止，讀取樣本吸光值，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即 可得出樣本中H9N2流感血凝素蛋白的含量。
[0012] 血凝素蛋白是流感病毒感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵功能蛋白，同時，也是流感治療性藥 物及疫苗開發(fā)的重要祀點，本發(fā)明采用雙抗夾也法，能夠定性或定量檢測樣本中的甲型 H9N2流感血凝素蛋白水平，檢驗方法方便易行，檢測靈敏度和準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)、能夠同 時快速檢測大批樣本，作為試劑盒關(guān)鍵組成部分的包被和檢測抗體均為自主研發(fā)，因此成 本低，可靠性強(qiáng)，易溯源，預(yù)計將在H9N2的相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究中發(fā)揮重要作用。
【附圖說明】
[0013] 圖1. H9N2流感病毒血凝素蛋白ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
【具體實施方式】
[0014] W下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述和說明。
[0015] 實施例1H9N2流感血凝素蛋白ELISA試劑盒的組分制備
[0016] 1.小鼠單克隆抗體的制備：
[0017] 1)動物免疫
[001引采用Ba化/c小鼠作為免疫動物，W義翅神州生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的重組H9N2 流感血凝素蛋白（貨號；11229-V08H)為免疫原，免疫劑量為每次每只小鼠免疫50yg的蛋 白。首次免疫時將免疫原與等量的完全弗氏佐劑制成乳化劑，腹部皮下多點注射，間隔2~ 3周后取相同劑量免疫原與等量不完全弗氏佐劑制成乳化劑，加強(qiáng)免疫兩次，H次免疫后使 用間接化ISA法測定血清效價，血清效價達(dá)到1 : 16000 W后，選擇效價最高的小鼠腹腔加 強(qiáng)免疫一次，4天后取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0019] 2)細(xì)胞融合和克隆化
[0020] 取小鼠脾臟，研磨過濾后離也獲得單個脾細(xì)胞息液，細(xì)胞計數(shù)后，按5 : 1或 10 : 1的比例與處于對數(shù)生長期的SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合，采用聚己二醇（PEG)法進(jìn) 行細(xì)胞融合，鋪板，通過選擇培養(yǎng)基的作用，骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞等未融合或未有效融合的 細(xì)胞將無法生長，而有效融合的雜交瘤細(xì)胞將在培養(yǎng)孔內(nèi)生長、增殖，并分泌抗體。H次換 液后，融合后第9-12天取細(xì)胞培養(yǎng)上清，W重組H9N2流感血凝素蛋白作為包被抗原，利用 間接ELISA法測定上清液，篩選陽性孔，并通過有限稀釋法對陽性細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，直 至得到穩(wěn)定分泌特異性抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。W上細(xì)胞融合和克隆化方法均為免疫 學(xué)單克隆抗體技術(shù)中的常用經(jīng)典方法。
[0021] 3)單克隆抗體的生產(chǎn)與純化
[0022] 選取雜交瘤細(xì)胞株，利用培養(yǎng)瓶或生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清， 利用常規(guī)蛋白A親和層析柱進(jìn)行純化，獲得的抗體通過SDS-PAGE電泳和間接化ISA法鑒定 抗體純度和特異性后分裝，于-2(TC低溫保存?zhèn)溆谩?br>[0023] 4)單克隆抗體的序列測定
[0024] 雜交瘤細(xì)胞長期保存可能由于多次傳代后不穩(wěn)定W及污染問題導(dǎo)致陽性克隆丟 失，為解決上述問題，在本發(fā)明過程中，利用分子生物學(xué)技術(shù)分別提取了陽性克隆的抗體輕 鏈和重鏈基因，進(jìn)行了序列測定，包含有抗體基因的質(zhì)?？蒞在-2(TC條件下長期穩(wěn)定保 存，同時，根據(jù)抗體基因序列，本專業(yè)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可W按照常規(guī)分子生物學(xué)方法克隆 表達(dá)獲得相同的單克隆抗體。
[00巧]抗體基因提取具體方法如下：收集生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，按BBI公司的 classical total RNA isolation kit說明書的操作方案提取雜交瘤細(xì)胞總RNA，通過電泳 檢測質(zhì)量，UV測定濃度。按BBI公司的MMLV first strand cDNA synthesis kit說明書的 操作方案將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-2(TC凍存?zhèn)溆谩７崔D(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為；lly 1 RNA(2.7yg)， SXreaction buffer4 u 1, RNase inhibitor (20U/ u 1) 1 u 1, dNTP mix (lOmmol/L) 2 u 1, M-MuLV reverse transcriptaselyl，總反應(yīng)體積為20 yl。根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計引物， W cDNA為模板分別PCR獲得抗體的輕鏈和重鏈片段，反應(yīng)體系為；2. 0 y llOXpyrobest buffer，1.6y 12.5mM dNTP，1.4y llOuM 引物對，0.4y 1 雜交瘤細(xì)胞 cDNA，0.2y 15U/y 1 Pyrobest DM Polymerase,反應(yīng)體系為 20 y 1。擴(kuò)增條件；變性 94°C 4min ;變性 94°C Imin, 退火58°C Imin，延伸72°C lmin，30個循環(huán)；延伸72°C 5min。將輕鏈和重鏈片段插入到 PCDNA3T載體上，構(gòu)建pcDNA3-anti-冊N2-L和pcDNA3-anti-冊N2-H載體。將載體轉(zhuǎn)化大腸 桿菌，挑取陽性克隆，進(jìn)行測序鑒定，分析測序結(jié)果，獲得正確的輕鏈和重鏈氨基酸序列。測 定結(jié)果及序列分析顯示該抗體的輕鏈氨基酸序列為SEQ ID NO ;1 ;重鏈氨基酸序列為SEQ ID NO ;2,詳見序列表。具體實驗操作參考本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的【薩幕布魯克J等，《分子 克隆試驗指南》，北京科學(xué)出版社】。
[0026] 2.兔多克隆抗體的制備：
[0027] 選取新西蘭兔作為免疫動物，W重組H9N2流感血凝素蛋白為免疫原進(jìn)行免疫，免 疫劑量