一種制備可物理再生蛋白質(zhì)芯片的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及一種利用陣列化微小毛細空間固定蛋白質(zhì)溶液和微納磁珠或量子點制備可物理再生蛋白質(zhì)芯片的方法。
技術(shù)背景:
[0002]蛋白質(zhì)是生命體特有的活性物質(zhì)，它們既作為結(jié)構(gòu)單元構(gòu)筑生命體，又作為功能單元執(zhí)行生命活動。許多蛋白質(zhì)可以與另外一些蛋白質(zhì)或基因片段等特異性結(jié)合，如抗體與抗原的結(jié)合、配體與受體的結(jié)合、酶與底物的結(jié)合等。利用蛋白質(zhì)之間這種特異性結(jié)合可以實現(xiàn)對細菌、病毒等有害物質(zhì)的檢測，蛋白質(zhì)芯片就是在此背景下誕生的一種快速高效的檢測手段。蛋白質(zhì)芯片是生物芯片的一種，它與另一大類基因芯片的最大區(qū)別是需要具備保持蛋白質(zhì)活性的能力，蛋白質(zhì)離開水就會失去活性。
[0003]將特定蛋白質(zhì)固定到芯片基板可以使用共價結(jié)合的化學(xué)方法，也可以使用非共價結(jié)合的物理方法。有報道認為，可以將組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)固定到鎳氨三乙酸處理過的蓋玻片上(ZhuH,BilginM,Bangham R,et al.Global Analysis ofProtein Activities UsingProteome Chips.Science2001 ；293(5537):2101-05)，但是結(jié)合不夠穩(wěn)定，容易受到化學(xué)品如鹽類的干擾，而且芯片必須保存在高濕度的密封容器中。也有通過對純化制備蛋白質(zhì)用的凝膠進行化學(xué)修飾處理的辦法，將蛋白質(zhì)以化學(xué)結(jié)合方式固定在富含水分的凝膠中，該方法較好地解決了蛋白質(zhì)活性保持的問題，但是芯片仍為一次性使用，成本較高。
[0004]采用物理方法將蛋白質(zhì)固定到芯片基板，理論上講具有制作成本低和芯片容易再生復(fù)用，但是如何固定牢固并保持蛋白質(zhì)活性是這種方法需要解決的關(guān)鍵問題。單就物理固定方法而言，電場、磁場等技術(shù)復(fù)雜且芯片不透明，給后續(xù)檢測造成很大困難；直接將蛋白質(zhì)點入凝膠簡便易行，不足之處是存在蛋白質(zhì)擴散會使陣點擴大、濃度降低，還可能使陣點相連；在基板上打孔的辦法也是可行的，但是微孔加工成本高，質(zhì)量也難以保證。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]該發(fā)明要解決的關(guān)鍵問題是將蛋白質(zhì)溶液或者將固定在微小磁珠或量子點上的蛋白質(zhì)連同水，通過物理方法固定在芯片基板上，形成實用的蛋白質(zhì)芯片。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先通過刻蝕辦法在單晶硅片上制備出每個陣點具有筒狀結(jié)構(gòu)的陰模；然后采用可硬化透明材料填充陰模即可將陰模上的筒形結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)楸砻嫱怀龅耐?；這些呈陣列分布的微小的筒作為蛋白質(zhì)溶液的容器，筒內(nèi)壁經(jīng)過親水處理，可以較好地固定蛋白質(zhì)溶液并保持其生物活性；在微筒的側(cè)面有狹窄的縫隙，一方面在吸取蛋白液時起到排氣的作用，另一方面在檢測時起到增大與環(huán)境液體或氣體接觸面的作用。
【附圖說明】
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[0006]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0007]圖1是單筒式陣列陰模三維透視圖。
[0008]圖2是多筒式陣列陰模三維透視圖。
[0009]圖3是芯片一級陣列和二級陣列示意圖。
[0010]圖4是單筒式蛋白質(zhì)芯片三維效果圖。
[0011]圖5是多筒式蛋白質(zhì)芯片三維效果圖。
【具體實施方式】
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[0012]第一步是設(shè)計陣列及花樣設(shè)計。
[0013]首先是根據(jù)使用需求和制造工藝設(shè)計單個陣點對應(yīng)筒的結(jié)構(gòu)。筒的結(jié)構(gòu)設(shè)計為柱形，優(yōu)選為圓柱形設(shè)計，以避免拐角處應(yīng)力集中。筒外徑10-100微米，高度10-100微米，筒壁厚3-10微米；每個筒側(cè)面開有1-4條狹縫，狹縫寬度1-5微米。筒可以是單筒，也可以是厚3-10微米肋片分割成的復(fù)合筒。
[0014]圖1和圖2分別對應(yīng)單筒和多筒兩種優(yōu)選設(shè)計實例。對于圖1所示單筒結(jié)構(gòu)，筒外徑50微米，壁厚5微米，筒深30微米，筒壁有一條狹縫，狹縫寬2微米。圖2對應(yīng)多筒結(jié)構(gòu)，一個圓柱形筒被內(nèi)部十字形肋片分割為四個近似三棱柱形筒，每個小筒向外的側(cè)面有一條狹縫；圓柱外徑50微米，壁厚5微米，肋片厚5微米，筒高30微米，狹縫寬2微米。
[0015]接下來設(shè)計筒陣列。考慮到顯微檢測的方便性、檢測結(jié)果的重復(fù)性以及檢測的種類，陣列可以從2X2到1X 10甚至更多。由筒組成的一級陣列還可以作為復(fù)合陣點構(gòu)建更大的二級陣列。
[0016]圖3是一個付諸制造的陣列設(shè)計實例:一級陣列為5X5，陣列周期為100微米；二級陣列也是5 X 5，陣列周期為I毫米；單張芯片尺寸為1X 10毫米。
[0017]第二步是根據(jù)以上設(shè)計制作光刻掩模，可委托專業(yè)服務(wù)機構(gòu)完成。
[0018]第三步是利用掩模在單晶硅片上進行光刻制作陰模，也由專業(yè)服務(wù)機構(gòu)完成。
[0019]第四步是翻模制作蛋白質(zhì)芯片基板。將單晶硅陰模固定在耐熱容器底部，陣列花樣朝上；根據(jù)容器大小和芯片厚度1-5毫米注入適量可硬化有機透明液體；真空脫氣；在干燥箱中烘干硬化；將彈性基板從單晶硅陰模上揭下。作為實例，選用聚二甲基硅氧烷商品，按說明書將兩組份混合，用量按照芯片厚度為I毫米計算，容器為石英培養(yǎng)皿，真空度取0.01兆帕，脫氣時間I小時，烘干溫度80度，烘干時間5小時。圖4和圖5分別為依照以上兩個設(shè)計實例翻模制備的蛋白質(zhì)芯片基板三維效果圖。
[0020]第五步是加載蛋白液?？梢圆捎脷鈮骸⒁簤?、電泳或直接毛細吸附等多種辦法實現(xiàn)。
[0021]作為一個實例，采用已申請專利的實時定量檢測毛細管電泳蛋白質(zhì)芯片制備裝置(申請?zhí)?01210539488.6)，該裝置可以采用電泳工作方式或氣壓方式通過石英毛細管精確加載，根據(jù)芯片陣點筒大小選取內(nèi)徑25-100微米毛細管，對于以上兩個設(shè)計實例，選用內(nèi)徑50微米毛細管，10干伏電壓,持續(xù)I秒。
[0022]另一實例是將固定在直徑20微米磁珠或量子點上的蛋白質(zhì)溶液涂敷在親水的蓋玻片表面，厚度5-20微米；將圖5型芯片基板的陣列花樣面向下壓在蓋玻片表面，基板變形量5-10微米，保持I秒鐘即可。該實例中，一方面，蛋白液通過毛細作用進入陣列筒；另一方面，量子點或磁珠的直徑稍大于陣列筒的內(nèi)徑，下壓芯片基板時借助基板彈性被強制嵌入筒內(nèi)，這種空間卡位辦法起到加強蛋白固定的作用。
[0023]第六步是蛋白質(zhì)芯片的物理再生處理。采用超生波清洗機，先加入去離子水和洗滌劑清洗1-2遍，再用干凈去離子水清洗2-3遍，置于烘干箱70-90度烘干0.5-3小時即可。
【主權(quán)項】
1.一種制備可物理再生蛋白質(zhì)芯片的方法，包括硅片光刻制備模板、透明有機物聚合硬化翻模制備芯片基板、蛋白質(zhì)溶液加載形成芯片等步驟，其特征在于:光刻模板為陰模，經(jīng)過翻模制備的蛋白質(zhì)芯片基板上的陣點為突出基板表面的柱形微筒，微筒外徑10-100微米，高度10-100微米，筒壁厚3-10微米。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:在柱形筒內(nèi)部添加厚度3-10微米肋片，使一個陣點上的一個筒變?yōu)榘瑪?shù)個小筒的復(fù)合筒。
3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:在每個筒的側(cè)面開有1-4條寬度1-5微米的狹縫，在加載蛋白質(zhì)溶液時作為排氣通道。
4.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:蛋白質(zhì)溶液通過毛細管電泳或毛細吸入加載到陣點上的微筒內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的溶劑起到保持蛋白質(zhì)活性的作用。
5.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:通過壓力將固定在直徑稍大于微筒內(nèi)徑的磁珠或量子點上的蛋白質(zhì)連同其結(jié)合的溶劑一起壓入微筒，微筒借助空間卡位將磁珠或量子點連同蛋白質(zhì)和溶劑固定。
6.按照權(quán)利要求4、權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:由于蛋白液借助物理方法被固定在芯片陣點上的微筒中，在芯片使用完畢后，可以使用超聲波清洗等物理方法清除蛋白質(zhì)溶液、磁珠或量子點，實現(xiàn)芯片的物理再生和循環(huán)使用。
【專利摘要】發(fā)明“一種制備可物理再生蛋白質(zhì)芯片的方法”涉及采用毛細吸附和空間卡位的方法將蛋白質(zhì)溶液固定到陣列化微筒中的技術(shù)方法，旨在解決芯片難以保持蛋白質(zhì)活性和一次性使用成本高的問題。該方法先利用硅片光刻技術(shù)制作陰模；之后將可聚合有機物液體涂敷在陰模表面，經(jīng)真空脫氣和加熱聚合硬化，將透明彈性蛋白質(zhì)芯片基板從陰模上揭下，得到具有一級或兩級陣列的、每個一級陣點一筒或一點多筒的陣列；利用毛細管電泳三維點樣技術(shù)或者壓力接觸將蛋白質(zhì)溶液加載到微筒內(nèi)，最終獲得蛋白質(zhì)芯片。微筒側(cè)面設(shè)計有狹縫，在下壓時起到排氣通道的作用。該微筒儲液型蛋白質(zhì)芯片在使用完畢后可通過超聲波清洗和干燥處理等物理方法再生，實現(xiàn)循環(huán)使用。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號】CN104749373
【申請?zhí)枴緾N201310739794
【發(fā)明人】倉懷興, 張力, 段秉亞, 馬建華
【申請人】中國科學(xué)院生物物理研究所
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2013年12月30日