人腎母細胞瘤過度表達基因編碼蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫分析技術(shù)領域中的一種檢測人腎母細胞瘤過度表達基因編碼蛋 白（N0V蛋白）的雙抗體夾也ELISA試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人腎母細胞瘤過度表達基因編碼蛋白（Ne地roblastoma-overexpressed gene protein homolog，N0V),即 NOV 蛋白，也稱為 CCN3 蛋白（CCN family members)或膜島素樣 生長因子結(jié)合蛋白 9(Insulin-l;Lke growth factor-binding protein9，IGFBP9)。NOV 蛋 白屬于CCN家族，該家族是由一組結(jié)構(gòu)相似的分泌性糖蛋白組成，目前已知的家族成員包 括CCN1到CCN6共六種蛋白。CCN家族蛋白在細胞的增殖、分化和黏附W及血管形成、腫瘤 發(fā)生和進展過程中均具有重要作用。
[0003] N0V有多種不同的生理作用，例如有研究顯示N0V具有促進人神經(jīng)干細唯增殖及 促進其向神經(jīng)元分化的作用，延緩TGF-目1所致的腎小管轉(zhuǎn)分化進程W及在妊娠糖尿病的 發(fā)生中起重要作用等。另外，N0V蛋白也可作為妊娠先兆子痛的早期診斷標志物。同時， 已有許多研究結(jié)果顯示N0V是一個新型的腫瘤的標志物；N0V含量與黑色素瘤的細胞惡性 程度呈正性相關；過量表達N0V蛋白可促進食管癌細胞的生長、遷移和侵襲；N0V在宮頸癌 組織中的表達陽性率明顯高于在正常宮頸組織中的表達陽性率，且N0V的表達與宮頸癌的 腫瘤大小及淋己結(jié)轉(zhuǎn)移等有顯著相關性，說明N0V的表達與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展有關，被 認為可作為宮頸癌的診斷及臨床監(jiān)測的分子標志物；有研究者認為N0V是判斷腫瘤惡性程 度，即細胞黏附和侵潤的標志物。
[0004] N0V作為重要的生物標志物，其準確快速的檢測對腫瘤發(fā)生機理的研究、發(fā)展情況 的跟蹤、預后判斷W及臨床治療是十分關鍵的，所W需要建立一種簡便、有效、可用于對各 類常見樣本如血清、血漿進行高通量快速檢測的技術(shù)方法。與其它技術(shù)相比，固相酶聯(lián)免疫 法因為靈敏度高、特異性好、檢測成本低、操作簡單、適合大批量樣本檢測等優(yōu)勢而已被廣 泛應用于各種重要生物標志物的分析檢測中。目前國內(nèi)常用N0V蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒主要 依靠進口，價格昂貴，到貨周期長，而且國內(nèi)尚沒有經(jīng)國家藥監(jiān)局批準的N0V蛋白臨床診斷 用產(chǎn)品，因此亟需開發(fā)相關抗體及試劑盒，支持國內(nèi)N0V蛋白的各項基礎研究，打破進口產(chǎn) 品的市場壟斷，并為進一步研制臨床體外診斷試劑提供關鍵材料，加速產(chǎn)品開發(fā)，填補國內(nèi) 空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測靈敏度高、準確性強、低成本的人腎母細胞瘤過度 表達基因編碼蛋白（N0V蛋白）的雙抗體夾也化ISA試劑盒。
[0006] 本發(fā)明所提供的檢測試劑盒包括特異性的N0V蛋白包被抗體，酶標記的N0V蛋白 檢測抗體W及N0V蛋白的標準品。
[0007] 其中所述N0V蛋白包被抗體為鼠單克隆抗體，其輕鏈和重鏈氨基酸序列分別為 SEQ ID NO ;1和SEQ ID NO ;2,所述酶標檢測抗體為兔多克隆抗體，所述NOV蛋白標準品為 重組N0V蛋白。
[0008] 所述單克隆抗體采用重組N0V蛋白免疫動物，利用雜交瘤技術(shù)制備獲得。所述多 克隆抗體采用重組N0V蛋白免疫動物，通過蛋白A純化和抗原親和純化技術(shù)制備獲得。酶 標抗體按照常規(guī)方法利用辣根過氧化物酶化orseradish peroxidase,HRP)標記抗體獲得。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案為優(yōu)選高靈敏度、高特異性的單克隆抗體和多克隆抗體進行配 對組合，將單克隆抗體作為包被抗體吸附于固相載體上，包被抗體可W特異性的捕獲樣本 中的N0V蛋白W及N0V蛋白標準品，加入酶標檢測抗體后，形成包被抗體、抗原、檢測抗體復 合物，相應底物顯色后終止，讀取樣本吸光值，與標準曲線比較即可得出N0V蛋白的含量。
[0010] 本發(fā)明采用雙抗夾也法定性或定量檢測樣本中的N0V蛋白水平，檢驗方法方便易 行、檢測靈敏度和準確度高、特異性強、能夠同時快速檢測大批量樣本，試劑盒主要組成部 分的包被和檢測抗體均為自主研發(fā)，因此成本低、可靠性強，將在N0V蛋白的相關基礎和臨 床研究中發(fā)揮重要作用。
【附圖說明】
[0011] 圖1. N0V蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測標準曲線圖
【具體實施方式】
[0012] W下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的描述和說明。
[0013] 實施例1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的組分制備
[0014] 1、重組N0V蛋白標準品的制備
[0015] 所述試劑盒中的標準品為重組N0V蛋白，來自北京義翅神州生物技術(shù)有限公司 (貨號為=10264-冊8B)，該蛋白是利用昆蟲細胞在體外進行表達，然后純化獲得的高純度 N0V蛋白，具有生物活性，具體活性和純度數(shù)據(jù)可參見義翅神州公司網(wǎng)站對于該產(chǎn)品的說 明。
[0016] 2、N0V蛋白小鼠單克隆抗體的制備
[0017] 1)動物免疫
[0018] 選用Ba化/c小鼠作為免疫動物，W上述重組N0V蛋白為免疫原進行免疫，免疫劑 量為每次每只小鼠免疫50 y g的N0V蛋白。首次免疫時將免疫原與等量的完全弗氏佐劑 制成乳化劑，腹部皮下多點注射，間隔2~3周后取相同劑量免疫原與等量不完全弗氏佐 劑制成乳化劑，加強免疫兩次，H次免疫后使用間接化ISA法測定血清效價，血清效價達到 1 : 16000 W后，選擇效價最高的小鼠腹腔加強免疫一次，4天后取脾細胞進行細胞融合。
[0019] 2)細胞融合和克隆化
[0020] 取小鼠脾臟，研磨過濾后離也獲得單個脾細胞息液，細胞計數(shù)后，按5 : 1或 10 : 1的比例與處于對數(shù)生長期的SP2/0小鼠骨髓瘤細胞混合，采用聚己二醇（PEG)法進 行細胞融合，鋪板，通過選擇培養(yǎng)基的作用，骨髓瘤細胞和脾細胞等未融合或未有效融合的 細胞將無法生長，而有效融合的雜交瘤細胞將在培養(yǎng)孔內(nèi)生長、增殖，并分泌抗體。H次換 液后，融合后第9-12天取細胞培養(yǎng)上清，W重組N0V蛋白作為包被抗原，利用間接化ISA法 巧1|定上清液，篩選陽性孔，并通過有限稀釋法對陽性細胞進行克隆化培養(yǎng)，直至得到穩(wěn)定分 泌抗NOV蛋白特異性抗體的單克隆雜交瘤細胞株。W上細胞融合和克隆化方法均為免疫學 單克隆抗體技術(shù)中的常用經(jīng)典方法。
[0021] 3)單克隆抗體的生產(chǎn)與純化
[0022] 選取雜交瘤細胞株，利用培養(yǎng)瓶或生物反應器進行細胞培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)上清， 利用常規(guī)蛋白A親和層析柱進行純化，獲得的抗體通過SDS-PAGE電泳和間接化ISA法鑒定 抗體純度和特異性后分裝，于-2(TC低溫保存?zhèn)溆谩?br>[0023] 4)單克隆抗體的序列測定
[0024] 雜交瘤細胞長期保存可能由于多次傳代后不穩(wěn)定W及污染問題導致陽性克隆丟 失，為解決上述問題，在本發(fā)明過程中，利用分子生物學技術(shù)分別提取了陽性克隆的抗體輕 鏈和重鏈基因，進行了序列測定，包含有抗體基因的質(zhì)?？蒞在-2(TC條件下長期穩(wěn)定保 存，同時，根據(jù)抗體基因序列，本專業(yè)領域內(nèi)的技術(shù)人員可W按照常規(guī)分子生物學方法克隆 表達獲得相同的單克隆抗體。
[0025] 抗體基因提取擴增具體方法如下；收集生長狀態(tài)良好的雜交瘤細胞，按BBI公司 的classical total RNA isolation kit說明書的操作方案提取雜交瘤細胞總RNA，通過電 泳檢測質(zhì)量，UV測定濃度。按邸I公司的MMLV first strand cDNA synthesis kit說明書的 操作方案將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-2(TC凍存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄反應體系為；lly 1 RNA(2. 7y g)， SXreaction buffer4 u 1, RNase inhibitor (20U/y 1) 1 y 1，dNTP mix (lOmmol/L) 2 u 1, M-MuLV reverse transcriptaselyl，總反應體積為20]il。根據(jù)參考文獻設計引物，W cDNA為模板分別PCR獲得抗體的輕鏈和重鏈片段。PCR反應體系為；2. 0 y llOXPyrobest buffer，1.6y 12. 5mM dNTP，1.4y llOuM 引物對，0. 4y 1 雜交瘤細胞 cDNA，0. 2y 15U/y 1 Pyrobest DM Polymerase,反應體系為 20 y 1。擴增條件；變性 94°C 4min ;變性 94°C Imin, 退火58°C Imin，延伸72°C lmin，30個循環(huán)；延伸72°C 5min。將輕鏈和重鏈片段插入到 PCDNA3T載體上，構(gòu)建pcDNA3-anti-N0V-L和pcDNA3-anti-N0V-H載體。將載體轉(zhuǎn)化大腸桿 菌，挑取陽性克隆