本發(fā)明涉及檢測和鑒定病原微生物制劑領(lǐng)域，特別涉及一種廣譜檢測致癌病原微生物的方法。

背景技術(shù)：

2010年12月Patrick S.Moore(美國匹茲堡大學(xué)資深病毒學(xué)家，美國科學(xué)院院士)與夫人Yuan Chang教授作為卡波西肉瘤病毒(KSHV)以及默克爾細(xì)胞多瘤病毒(MCV)的共同發(fā)現(xiàn)人聯(lián)名發(fā)表了“為什么病毒會引起癌癥？人類腫瘤病毒學(xué)的第一個百年大事記”。自1911年弗朗西斯·佩頓·勞斯(Francis Peyton Rous)首次發(fā)現(xiàn)禽肉瘤病毒，劃時代地提出“癌性腫瘤是病毒所致”成為“腫瘤病毒”第一人，并于1966年獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。此后，病毒成為現(xiàn)代腫瘤研究的核心，1964年首次在Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)人類腫瘤病毒EB病毒；1965年發(fā)現(xiàn)肝炎由乙肝病毒(HBV)引起，1981年證實與肝癌相關(guān)，乙肝疫苗成為第一個抗癌疫苗上市；1983年德國科學(xué)家哈拉爾德·楚爾·豪森在宮頸癌病人樣本中發(fā)現(xiàn)高危型人乳頭瘤病毒(HPV)，2006年疫苗獲美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，2008年哈拉爾德·楚爾·豪森獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎；1989年美國科學(xué)家邁克爾·侯頓(Michael Houghton)和他的同事們發(fā)現(xiàn)并克隆丙肝病毒(HCV)；1989年Varmus和Bishop因發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒癌基因的細(xì)胞學(xué)起源而獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎；1994年P(guān)atrick S.Moore課題組在卡波濟(jì)肉瘤中發(fā)現(xiàn)卡波濟(jì)肉瘤病毒(KSHV),2008年在梅克爾細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)致癌病毒梅克爾細(xì)胞多瘤病毒(MCV)。

2009年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)召集16個國家的36名專家，對已經(jīng)歸類為人類致癌的生物因子是否確有致癌性進(jìn)行了重新評估，并對致癌的部位和癌癥發(fā)生的機(jī)理作了進(jìn)一步鑒定，并于2012年正式發(fā)表專論。明確提出：在全世界有17.8-26％的癌癥是由下列一種人類病毒、細(xì)菌或寄生蟲所引起，包括：7種病毒(EB病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、卡波濟(jì)肉瘤皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒1(HIV-1)、人乳頭狀瘤病毒、嗜人類T淋巴細(xì)胞病毒I型)(HTLV-1)，1種細(xì)菌(幽門螺旋菌)，三種寄生蟲(埃及血吸蟲、中華肝吸蟲和泰國肝吸蟲)等共11種。到目前為止總共有16個型：HPV16和18型為IARC于1995年首次確認(rèn)的主要高危致癌型，HIV-1和HIV-2型(2型為新出現(xiàn)的耐藥型)，HTLV-1，2,3,4型(后兩個型為2008年3后發(fā)現(xiàn)的新型株)。

2014年美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)分子微生物學(xué)主任Dr.Kuan-Teh Jeang在“病毒與人類癌癥：從基礎(chǔ)科學(xué)到臨床預(yù)防”一書中提出：此類微生物可導(dǎo)致相關(guān)臟器細(xì)胞的癌變，與惡性腫瘤的形成關(guān)系密切，如：EB病毒與鼻咽癌、淋巴瘤，乙肝病毒、丙肝病毒與肝癌，幽門螺桿菌與胃癌、胃淋巴瘤，人類乳頭狀瘤病毒與宮頸癌、陰戶、陰道、陰莖、肛門、口腔、扁桃體癌、喉癌，嗜人類T淋巴細(xì)胞病毒I型HTLV-1與成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤，卡波濟(jì)肉瘤皰疹病毒8與卡波濟(jì)肉瘤、淋巴瘤，其中梅克爾細(xì)胞多瘤病毒(MCV)是2008年新發(fā)現(xiàn)的病毒與梅克爾細(xì)胞癌(MCC)有關(guān)等。本結(jié)論基于最近50年來大量實驗研究和流行病學(xué)研究積累結(jié)果。鑒定出更多的癌癥與生物致癌因子的關(guān)系，意味著更多的癌癥是可以預(yù)防的。目前亟需一種全面涵蓋所有生物致癌因子的檢測方法，用于篩查那些目前尚未發(fā)現(xiàn)但可能與感染相關(guān)的癌癥，如基因測序發(fā)現(xiàn)與自身免疫抗病毒蛋白基因突變相關(guān)的16種癌癥，包括：急性淋巴細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、慢性淋巴性白血病、食道癌、頭頸癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌、肺腺癌、骨髓瘤、肺鱗癌、淋巴B細(xì)胞癌、胰腺癌、胃癌、甲狀腺癌、子宮癌。

2011年12月瑞典卡羅林斯卡研究所John Inge Johnsen報道人巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus HCMV_HHV5)在以下多種腫瘤中檢出，包括：腦膠質(zhì)瘤、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌涎腺粘液表皮樣腫瘤，因此可以利用這一分子靶向選擇性殺傷該腫瘤細(xì)胞。

在癌癥病因?qū)W研究中，一個最顯著的成果就是確立了人類病毒的某些特定型別感染，是引起人類某些惡性腫瘤的主要原因。

2016年1月25日國家癌癥中心赫捷院士和陳萬青教授團(tuán)隊，在CA Cancer J Clin.發(fā)布“2015年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)”。預(yù)計有429.2萬例新發(fā)腫瘤病例。約22％的全球新發(fā)癌癥出現(xiàn)在中國，27％的癌癥死亡病例在中國。且國人的癌癥譜與西方發(fā)達(dá)國家相差甚大，中國四種最常見腫瘤分別為肺癌、胃癌、肝癌和食管癌，占全國癌癥病例的57％，而在美國這四種癌僅占18％。約60％的癌癥死亡是可以通過減少可控危險因素暴露來預(yù)防的，減少國人癌癥死亡的最可行途徑就是控制慢性感染，29％的癌癥死亡是與慢性感染相關(guān)，主要是胃癌(幽門螺桿菌Hp感染)、肝癌(肝炎病毒HBV和HCV感染)和宮頸癌(人乳頭瘤病毒HPV感染)。大多數(shù)惡性腫瘤都有10至15年的潛伏時間來糾正，不要錯過這個機(jī)會。

根據(jù)2012年國際腫瘤研究機(jī)構(gòu)確定的11種共16個型生物致癌因子和國際權(quán)威雜志最新報道的癌癥相關(guān)病毒MCV和HCMV，總共13種18個型，建立了一個完善的DNA+RNA生物致癌因子雙基因探針(除外HTLV的四種型為四對單基因探針)，高靈敏度、高特異性檢測試劑盒。

DNA生物致癌因子(10種11個型)包括：

EB病毒(Epstein-Barr virus，HUMAN HERPES VIRUS皰疹病毒4)是一種皰疹病毒，1964年由Epstein和Barr首次從非洲兒童Burkitt淋巴瘤細(xì)胞中分離建株。該病毒被認(rèn)為是多種惡性腫瘤(如鼻咽癌)的病因之一，它主要感染人類口咽部的上皮細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。在中國南方鼻咽癌患病人群中大多都檢測到有EB病毒基因組存在。病毒攜帶者和病人是本病的傳染源，經(jīng)口密切接觸為主要傳播途徑。EB病毒俗稱為“接吻病毒”，原因是EB病毒的傳播途徑是唾液交換，接吻為最常見的傳播方式。由于迄今還沒有可消滅EB病毒的藥物，市民要避免與陌生人接吻。除了鼻咽癌外，接吻還會引發(fā)一系列傳染病，在臺灣，經(jīng)常會有20多歲的青年因接吻感染EB病毒，并引致嚴(yán)重咽喉扁桃體炎、喉嚨痛、發(fā)燒、疲倦、頸部及全身淋巴腺腫大。在本檢測中包括兩個基因和一個重復(fù)序列非基因區(qū)，以提高檢測靈敏度，

卡波濟(jì)肉瘤皰疹病毒(KAPOSI SARCOMA HERPESVIRUS，HUMAN HERPES VIRUS 8，KSHV)是1872年匈牙利皮膚科專家Kaposi首先報道的一種罕見的腫瘤，在非洲多見，并可形成地方性流行，且多發(fā)于60歲以上的老人及免疫系統(tǒng)受損人群，如艾滋病患者等。近10年來，在歐美男性同性戀者中出現(xiàn)了暴發(fā)性流行，同時，卡波濟(jì)肉瘤與艾滋病有一定的關(guān)系，它被認(rèn)為是艾滋病的一種常見腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，約30％同性戀的白種人中，卡波濟(jì)肉瘤是艾滋病感染者的首要表現(xiàn)，且多最早出現(xiàn)。在我國新疆地區(qū)有報告，主要見于維吾爾族等少數(shù)民族。隨著器官移植的廣泛開展及免疫抑制劑的普遍應(yīng)用，與移植物有關(guān)的卡波濟(jì)肉瘤的發(fā)病有所增加。特別是近年來艾滋病的傳播，艾滋病型卡波濟(jì)肉瘤明顯增多，而且進(jìn)展快，治療困難，死亡率高。

乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)的致癌性：現(xiàn)在已經(jīng)肯定，HBV是致肝癌的重要因子，約80％—90％的肝癌都有HBV背景。有人觀察發(fā)現(xiàn)，有20年HBV感染史者，約有5％—10％的發(fā)生癌變，癌變的原因是HBV的x基因整合到肝細(xì)胞基因上，發(fā)生了突變，導(dǎo)致肝癌。啟動子(BCP)變異：基本核心蛋白的啟動子(BCP)的變異是多位點和復(fù)合的，主要是1762(A→T)、l764(G→A)的雙突變，BCP區(qū)是富含AT區(qū)域，具有肝臟富含因子的獨立結(jié)合點，變異的BCP可改變這種結(jié)合，降低Prec區(qū)的RNA轉(zhuǎn)錄，最終使HBeAg表達(dá)減少，導(dǎo)致病情加重或為重型肝炎。BCP的變異還可使前基因組RNA轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，病毒的復(fù)制能力增加。目前，亦有文獻(xiàn)報道該區(qū)域的突變有可能導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。在本檢測中包括兩個基因：S和X基因,及一個BCP突變位點，僅見X基因陽性可能發(fā)生致癌整合，BCPl764(G→A)陽性，提示導(dǎo)致癌癥的可能性增加。Jiang et al.,Genome Res.2012 22:593-601

人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)可感染人體的表皮與黏膜組織，部分型別可引起性傳播疾病。其中，高危型HPV16和18型明確為強(qiáng)高危致癌型別，可引起子宮頸、陰戶、陰道、陰莖、肛門、口腔、口咽和扁桃腺癌。

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)首先由Barry J.Marshall和J.Robin Warren)二人發(fā)現(xiàn)，并因此獲得2005年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。幽門螺桿菌感染是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界衛(wèi)生組織/國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(WHO/IARC)將幽門螺桿菌定為Ⅰ類致癌原。

中華肝吸蟲(C.sinensis)和泰國睪吸蟲(O.viverrini)是一種可寄生在人類膽管和膽囊的吸蟲，以膽汁為食。生食被肝吸蟲污染的淡水魚螺和腌制魚類是感染的主要原因。中國有超過1200萬人感染肝吸蟲，其中大多數(shù)分布在東南、東北省份，這些地區(qū)群眾喜歡吃生魚片，淡水魚很容易感染肝吸蟲的幼蟲。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其歸類為1類致癌物—O.viverrini是導(dǎo)致人類膽管癌的一個明確原因，而C.sinensis是一個可能原因。

埃及血吸蟲(S.haematobium)1994年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將埃及血吸蟲感染與麝貓后睪吸蟲感染評定為確認(rèn)人類致癌物(Group 1)，將華支睪吸蟲感染評定為對人很可能致癌(Group 2A)，將日本血吸蟲感染評定為對人可能致癌(Group 2B)。

梅克爾細(xì)胞多瘤病毒(MCPyV，MCV)是2008年匹茲堡大學(xué)癌癥研究院分子病毒研究組的研究人員Patrick S.Moore與Yuan Chang等發(fā)現(xiàn)可引起梅克爾細(xì)胞癌,大約80％的梅克爾細(xì)胞癌與梅克爾細(xì)胞多瘤病毒感染相關(guān)，20％的梅克爾細(xì)胞癌未發(fā)現(xiàn)梅克爾細(xì)胞病毒感染，提示梅克爾細(xì)胞癌還有其他致病因素。在過去的20年間，MCC增長了三倍，每年出現(xiàn)1500個病例，這種癌癥主要發(fā)生在免疫系統(tǒng)受到AIDS，或者移植相關(guān)免疫抑制藥物破壞的個體身上，一半患有MCC的病人只能存活至多9個月，三分之二的病人在5年內(nèi)會死亡。

人類巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)屬皰疹病毒科,又稱為涎病毒,是人類皰疹病毒組中最大的一種病毒。這種病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)以后會導(dǎo)致細(xì)胞增大，所以叫做巨細(xì)胞病毒。在我國巨細(xì)胞病毒感染廣泛流行，通常情況下，很多正常人身上都潛伏有巨細(xì)胞病毒，潛伏部位常在唾液腺、乳腺、腎臟、子宮頸、睪丸、白細(xì)胞以及其它腺體中，病毒可長期或間歇地自唾液、乳汁、尿液、精子及子宮頸分泌物中排出。但在大多數(shù)免疫正常個體呈無癥狀感染，而在免疫抑制個體、胎兒和嬰幼兒如果感染則可出現(xiàn)明顯病癥。瑞典和美國等科學(xué)家最新報道，許多最新證據(jù)提示HCMV可能特定的與人類某些腫瘤如：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌，以及涎腺粘液表皮樣癌等有關(guān)。

生物致癌因子RNA組合(3種7型)包括：

丙肝病毒(Hepatitis C virus,HCV)是慢性肝炎的主要致病因子。在美國慢性肝病患者中，40～60％感染了HCV。全世界約有一億七千萬人感染了HCV，這個數(shù)字高于感染了HIV的人口。流行病學(xué)研究表明：約20％慢性肝炎患者要發(fā)展為肝纖維化和肝硬化，在這些肝硬化病人當(dāng)中，20％要發(fā)展為肝癌。

人類T淋巴細(xì)胞病毒I型(HUMAN T-CELL LEUKEMIA VIRUS 1,HTLV-1)是80年代初第一個被明確為與引起人類癌癥(成人T淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤，ATLL)有關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒。此外，該病毒還可以引起炎癥性疾病，如HTLV-1相關(guān)脊髓病(HAM)/熱帶痙攣性下肢輕癱(TSP)，眼色素層炎，傳染性皮炎和肌炎。目前HTLV-1在全世界的感染人數(shù)大約有2千萬人。HTLV-2,3,4型為2008年后在喀麥隆(非洲西部國家)發(fā)現(xiàn)的新型株。

人類免疫缺陷病毒I型(HUMAN IMMUNODEFICIENCEY VIRUS-1,HIV)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中的人類慢病毒組，分為1型和2型。目前世界范圍內(nèi)主要流行HIV-1。HIV-1引起機(jī)體免疫缺陷，當(dāng)與其它病毒共感染時，易發(fā)生各種腫瘤，如卡波濟(jì)肉瘤,非霍奇金淋巴瘤，子宮頸、肛門、眼球結(jié)膜癌，以及陰戶、陰道、陰莖、非黑色素瘤皮膚癌、肝細(xì)胞癌。HIV-2型為新出現(xiàn)的耐藥型。HIV-2是經(jīng)常用抗HIV-1感染的一些抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療后產(chǎn)生天然抗性的新型株，治療它需要選擇其它確實有效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療。

美國食品和藥品管理局(FDA)目前批準(zhǔn)的多種病原微生物檢測方法有：呼吸道病毒檢測試劑盒，例如：Biofire FilmArray RP20種呼吸道相關(guān)病原體檢測,Genmark eSensor RVP 14種流感相關(guān)病毒和Luminex xTAG RVP fast multiplex assays 18種呼吸道病毒基因檢測等。與致癌病原體相關(guān)的檢測試劑盒均以單種病原體檢測形式存在：如羅氏cobas人乳頭瘤病毒(HPV)檢測試劑盒可識別HPV 16和18基因型，能檢測其它12種高風(fēng)險基因型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)；AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV檢測；Abbott RealTime HBV檢測，HIV-1檢測,CT/NG衣原體/淋病檢測等。

中國食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)目前批準(zhǔn)上市的多種病原微生物檢測方法有：博奧生物的8種常見下呼吸道病原菌；中幟生物七項呼吸道病原體核酸檢測試劑盒；肺炎支原體/肺炎衣原體核酸檢測試劑盒(雙擴(kuò)增法)；8種常見食源性細(xì)菌(沙門菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌、奇異變形桿菌、大腸桿菌O157)核酸的快速檢測，用于食源性疾病的輔助診斷。用于與致癌病原體相關(guān)的檢測試劑盒不論是PCR方法還是ELISA免疫反應(yīng)檢測法,均為同類病原微生物的檢測。如：凱普21種基因型HPV分型；廈門安普利乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒鑒別B、C、D基因型；賽默飛世爾合資公司立菲達(dá)安HBV耐藥、HCV分型等。

目前國際、國內(nèi)還沒有一個商用試劑盒能夠針對所有10多種生物致癌因子的基因檢測試劑盒，也沒有一個實驗室具備同時對10多種生物致癌因子進(jìn)行檢測的能力。如果分別用實時PCR檢測，需要抽十幾管血，送到不同的實驗室，用各種不同試劑和方法進(jìn)行檢測。不但其檢測成本高，周期長,而且樣本變質(zhì)和被污染的可能性也大。對于器官移植和血液制品，以及日益高發(fā)的因生物致癌因子導(dǎo)致的感染性癌癥，缺乏強(qiáng)有力的全面精準(zhǔn)檢測手段。

采用常規(guī)抗原與抗體的ELISA免疫反應(yīng)檢測法，其檢測結(jié)果只能代表患者是否曾經(jīng)感染過這些病原體。而大多數(shù)人在生活中均已感染過生物致癌因子，當(dāng)人體自然免疫反應(yīng)正常時，可以自身產(chǎn)生抗體清除病原體，使免疫反應(yīng)呈現(xiàn)陽性。如同結(jié)核和乙肝，中國大多數(shù)人檢測呈免疫反應(yīng)陽性，但健康人體內(nèi)的結(jié)核桿菌和乙肝病毒的DNA檢測必須是陰性。一些癌癥病人，由于機(jī)體缺乏免疫力，當(dāng)EB病毒DNA強(qiáng)陽性時，EB病毒IgM抗體檢測反而為陰性(本發(fā)明檢測結(jié)果，尚未發(fā)表)。因此，只有檢測生物致癌因子的DNA或RNA,才能真實反應(yīng)病原體感染的活動狀況。

質(zhì)譜掃描檢測生物致癌因子法，采用21世紀(jì)最先進(jìn)的DNA質(zhì)譜技術(shù)。通過數(shù)字化光電檢測器，不僅能一次檢測到所有10多種已知生物致癌因子，而且針對每種生物致癌因子均采用了2種以上靶向基因及致癌突變位點檢測。相當(dāng)于同時采用兩種不同廠家的試劑盒進(jìn)行平行檢測，最大限度的避免了因DNA/RNA突變或降解造成的假陰性。其檢測結(jié)果的靈敏度之高1-10copies/反應(yīng)、特異性之強(qiáng)、重復(fù)性之好、檢測動態(tài)范圍之寬1-1.0X10¹⁰copies/反應(yīng)，且費用相對低廉，出報告時間短，是目前其它方法所無法比擬的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種廣譜檢測致癌病原微生物的方法，其中所述的致癌病原微生物包括：2012年國際腫瘤研究機(jī)構(gòu)確定的11種共16個型生物致癌因子，和國際權(quán)威雜志最新報道的與癌癥相關(guān)的病毒MCV和HCMV總共13種18個型。所述的致癌病原微生物分為DNA和RNA兩種，本發(fā)明的檢測方法分為對DNA的檢測和對RNA的檢測。

本發(fā)明提供了一種廣譜檢測致癌病原微生物的方法，其中，方法一是對DNA生物致癌因子的檢測，方法二是對RNA生物致癌因子的檢測，以下分別描述：方法一、對DNA生物致癌因子的檢測，即對11種DNA病原微生物進(jìn)行檢測，對于每一種每種DNA病原微生物需要兩個或兩個以上的探針，這些DNA病原微生物包括：

1、EB病毒_人類皰疹病毒4(EPSTEIN-BARRVIRUS,EBV_HHV-4)覆蓋AB亞型；

2、卡波濟(jì)肉瘤病毒_人類皰疹病毒8(KAPOSI SARCOMA HERPESVIRUS,KSHV_HHV-8)；

3、人巨細(xì)胞病毒_人類皰疹病毒5(HUMAN CYTOMEGALOVIRUS,HCMV_HHV-5)；

4、乙肝病毒(HEPATITIS B VIRUS,HBV)：S基因、X基因及BCP致癌突變；

5、人乳頭狀瘤病毒16型(HUMAN PAPILLOMAVIRUSES,HPV-16)E6/L1基因；

6、人乳頭狀瘤病毒18型(HUMAN PAPILLOMAVIRUSES,HPV-18)E6/L1基因；

7、梅克爾細(xì)胞多瘤病毒(MERKEL CELL POLYOMAVIRUS,MCV)；

8、幽門螺旋菌(Helicobacter pylori,Hp)；

9、中華肝吸蟲(CLONORCHIS SINENSIS，C-SINENSIS)；

10、泰國肝吸蟲(OPISTHORCHIS VIVERRINI，O-VIVERRINI)；

11、埃及血吸蟲(SCHISTOSOMA HAEMATOBIUM，S-HAEMATOBIUM)。

方法二、RNA生物致癌因子的檢測，即對7種RNA病毒病原微生物進(jìn)行檢測，對于每一種每種RNA病毒病原微生物需要兩個或兩個以上的探針，這些RNA病毒病原微生物包括：

1、丙肝病毒(HEPATITIS C VIRUS，HCV)；

2、人類免疫缺陷病毒(HUMAN IMMUNODEFICIENCEY VIRUS-1，HIV-1)；

3、人類免疫缺陷病毒(HUMAN IMMUNODEFICIENCEY VIRUS-1，HIV-2)；

4、嗜人類T淋巴細(xì)胞病毒I型(HUMAN T-CELL LEUKEMIA VIRUS 1，

5、HTLV-1)嗜人類T淋巴細(xì)胞病毒II型(HUMAN T-CELL LEUKEMIA VIRUS 2，HTLV-2)；

6、嗜人類T淋巴細(xì)胞病毒III型(HUMAN T-CELL LEUKEMIA VIRUS 3，HTLV-3)；

7、嗜人類T淋巴細(xì)胞病毒IV型(HUMAN T-CELL LEUKEMIA VIRUS 4，HTLV-4)。

本發(fā)明所述方法，包括以下步驟：

步驟1、引物設(shè)計：涵蓋國際腫瘤研究機(jī)構(gòu)IARC在2009年提出的全部生物致癌因子和國際權(quán)威機(jī)構(gòu)新近發(fā)表的與癌癥相關(guān)的生物致癌病毒，總共18種型。全部檢測分為兩部分，第一部分為DNA病原微生物，包括：EBV_HHV-4、KSHV_HHV-8、HCMV_HHV-5、HBV、HPV-16、HPV-18、MCV、Hp、C-SINENSIS、O-VIVERRINI和S-HAEMATOBIUM，總共11種型，分別采用了雙基因探針包括致癌基因或突變位點檢測。第二部分為RNA病毒，包括：HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、HTLV-2、HTLV-3和HTLV-4，總共7種型，分別采用了雙基因探針(除外HTLV的四種型為四對單基因探針)。選擇每個型別的特異性保守序列，設(shè)計一對PCR引物，在引物的5’端帶有10個堿基(ACGTTGGATG)任意組合的標(biāo)簽序列，使總長度達(dá)到30個堿基以上，用以從分子量上將引物與探針區(qū)別開，避免干擾。在擴(kuò)增區(qū)中的保守序列區(qū)設(shè)計一條單堿基延伸探針，探針的長度為14-28個堿基，在探針的3’末端，允許延伸一個經(jīng)設(shè)計確定的堿基，作為該基因型特異性序列標(biāo)記，單堿基延伸后總長度不超過29個堿基，每個探針的延伸產(chǎn)物之間分子量相差至少16Da。各種HPV擴(kuò)增引物序列見表1，其對應(yīng)的堿基延伸探針見表2。

步驟2、PCR反應(yīng)：在PCR過程中引入尿嘧啶N糖基化酶(UNG酶)技術(shù)，在首次PCR反應(yīng)體系中，以dUTP替代常規(guī)PCR的dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG酶處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG酶在PCR循環(huán)中一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR反應(yīng)及產(chǎn)物，徹底排除了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染引起的假陽性問題。通過第一輪PCR擴(kuò)增，獲得待測樣本中靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物。

步驟3、蝦堿性磷酸酶(SAP)處理：SAP可使未結(jié)合的剩余核酸(dNTPs)脫磷酸失活，避免干擾下一步堿基延伸反應(yīng)。

步驟4、堿基延伸反應(yīng)：在第二輪擴(kuò)增中進(jìn)行單堿基延伸探針的3’端，延伸一個序列特異性單核苷酸，作分子量標(biāo)記，得到的延伸產(chǎn)物與所述延伸探針及各型別延伸產(chǎn)物之間的分子量差異不小于16Da，

步驟5、樹脂脫鹽：采用樹脂對延伸產(chǎn)物進(jìn)行純化。

步驟6、質(zhì)譜檢測：將純化后的產(chǎn)物采用微量點樣儀點于芯片上，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)系統(tǒng)進(jìn)行分子量檢測，根據(jù)分子量標(biāo)記確定待測HPV基因型別，軟件自動處理報告每個基因型的檢測結(jié)果和可信程度。

優(yōu)選的，本發(fā)明的檢測方法，包括以下步驟：

步驟1，用一對PCR引物，在引物的5’端帶有ACGTTGGATG堿基的任意組合的標(biāo)簽序列，使總長度達(dá)到30個堿基以上，以區(qū)別于探針；在擴(kuò)增區(qū)中的保守序列設(shè)計一條單堿基延伸探針，探針的長度為14-28個堿基，在探針的3’末端，允許延伸一個經(jīng)設(shè)計確定的堿基，作為該基因型特異性序列標(biāo)記，單堿基延伸后總長度不超過29個堿基；

步驟2，第一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，將dUTP/dNTP混合物、UNG酶、Taq酶和多重PCR引物、水、待檢樣本一同加入PCR反應(yīng)體系中，先進(jìn)行dUTP的消化，降解PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后滅活UNG酶，隨后作45個循環(huán)PCR擴(kuò)增，獲得待測樣本中靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物；

步驟3，用蝦堿性磷酸酶處理，使第一輪反應(yīng)中剩余dNTP脫磷酸失活；

步驟4，第二次單堿基延伸擴(kuò)增，將ddNTPs加入反應(yīng)體系中，使之在單堿基延伸探針的3’端，延伸一個序列特異性單核苷酸，作分子量標(biāo)記，擴(kuò)增200個循環(huán)，每個探針的延伸產(chǎn)物之間分子量相差至少26Da；

步驟5，采用陽離子交換樹脂吸附鹽離子，純化延伸反應(yīng)產(chǎn)物；

步驟6，純化后產(chǎn)物采用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分子量檢測，根據(jù)分子量標(biāo)記確定待測病原微生物的類型。

其中所述步驟(1)引物設(shè)計中每一種待測病原微生物型采用2個以上基因區(qū)及致癌突變位點檢測。引物序列為SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.70，探針序列為SEQ ID NO.75至SEQ ID NO.109，

所述步驟1中，優(yōu)選的DNA病原微生物采用β球蛋白基因作為樣品質(zhì)量控制參照，引物序列為SEQ IDNO.71和SEQ ID NO.72，探針序列為SEQ ID NO.110。RNA病毒采用核糖核酸酶P基因作為樣品質(zhì)量控制參照，引物序列為SEQ IDNO.73和SEQ ID NO.74，探針序列為SEQ ID NO.111。

優(yōu)選的在每次反應(yīng)中加入陰性對照，所述陰性對照為去離子雙蒸水。

本發(fā)明的方法，檢測濃度低至1-10拷貝/反應(yīng)。

本發(fā)明還包括，為便于應(yīng)用本發(fā)明的檢測方法而設(shè)計的檢測試劑盒，所述試劑盒中包含表1和表2中的核苷酸。所述核苷酸為DNA/RNA致癌病原微生物的特異基因序列的正向和反向引物序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.70；堿基延伸探針SEQ ID NO.75-SEQ ID NO.109；以及DNA/RNA質(zhì)控引物序列為SEQ IDNO.71-SEQ ID NO.74，探針序列SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.111。

本發(fā)明所述試劑盒，根據(jù)需要，所述試劑盒還可包括任何一種適合本發(fā)明方法的輔助試劑：如，緩沖液，溶液，酶，載體，試紙，試管，棉球等。

本發(fā)明的上述試劑盒的使用是以本發(fā)明方法為基礎(chǔ)，通過定性或定量測定樣本中的DNA,RNA，確定病原微生物存在與否，以達(dá)到診斷疾病的目的，其中所述樣本包括血液，組織，體液，分泌物等。

本發(fā)明的試劑盒，各試劑分別包裝，優(yōu)選使用包裝管，每個包裝管中裝入試劑的量以夠一個樣本使用量為基本量，可以擴(kuò)大到10個，100個，1000個樣本的使用量。

本發(fā)明的試劑盒的使用是根據(jù)上述檢測方法進(jìn)行的，使用時將試劑盒中的試劑根據(jù)需要配制成相應(yīng)的濃度，按照所述方法測定即可。

本發(fā)明表1和表2中的引物和探針，是根據(jù)已知的致癌病原微生物的結(jié)構(gòu)設(shè)計的，電子版本的形式見序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.111。

表1

表2.

與現(xiàn)有相關(guān)致癌病原微生物檢測的其它技術(shù)相比，本發(fā)明技術(shù)方案最大限度地發(fā)揮了PCR-質(zhì)譜聯(lián)用平臺檢測病毒基因型的優(yōu)勢，將國際腫瘤研究機(jī)構(gòu)IARC和國際權(quán)威機(jī)構(gòu)及雜志所述的所有生物致癌因子全部囊括其中，每個型采用了雙基因探針，確保在基因整合缺失或突變時，仍能夠有效檢出該基因型。本發(fā)明將所有18個致癌病原微生物分為DNA病毒、細(xì)菌和寄生蟲和RNA病毒兩個反應(yīng)檢測。臨床可根據(jù)需求和樣本來源分別使用或組合使用，最大程度地降低了使用成本。檢測通量靈活一天可以檢測幾個至幾千個樣本。為致癌病原微生物感染的全面普及篩查提供了不可或缺的檢測工具。

采用大于20重以上PCR反應(yīng)產(chǎn)物，作一次性質(zhì)譜檢測，不需要熒光染料標(biāo)記、不需要洗滌、反應(yīng)在微量體系中進(jìn)行，使試劑耗材成本大大降低。首輪PCR擴(kuò)增區(qū)域為60-140bp的基因型特異性片段，第二輪PCR采用特異性探針末端單點法擴(kuò)增，可以允許使用更多循環(huán)，最大限度地提高了檢測靈敏度和特異性，使檢測靈敏度達(dá)到1aM級單個拷貝水平，極大降低了檢測漏診造成的假陰性問題。同時采用UNG酶技術(shù)和基因型特異性片段擴(kuò)增設(shè)計技術(shù)，徹底排除了PCR產(chǎn)物污染和同源序列探針錯配引起的假陽性問題。為多種腫瘤病因?qū)W研究和相關(guān)疫苗的研制和應(yīng)用提供了可靠的臨床實驗依據(jù)。

附圖說明

圖1、DNA生物致癌因子基因型堿基延伸探針質(zhì)譜峰圖和RNA生物致癌因子基因型堿基延伸探針質(zhì)譜峰圖(1-2)

具體實施方式

本發(fā)明包括同時檢測18種已致癌病原微生物，每種基因型同時采用特異性基因作檢測。此處所描述的具體實施方式僅用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實施方式提供的高精確度檢測和/或鑒定致癌病原微生物基因型的方法，待檢測致癌病原微生物基因型包括：EBV_HHV-4、KSHV_HHV-8、

HCMV_HHV-5、HBV、HPV-16、HPV-18、MCV、Hp、C-SINENSIS、O-VIVERRINI、S-HAEMATOBIUM，HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、HTLV-2、HTLV-3和HTLV-4，總共18種。每種基因型采用2個基因的特異片段檢測。包括如下步驟：

(1)根據(jù)待測致癌病原微生物基因型全序列，獲取特異性分型基因，選擇每個型別的特異性保守序列，設(shè)計一對PCR引物，在引物的5’端帶有10個堿基(ACGTTGGATG)任意組合的標(biāo)簽序列，使總長度達(dá)到30個堿基以上，用以從分子量上將引物與探針區(qū)別開。各種致癌病原微生物基因型的擴(kuò)增引物序列見表1。在擴(kuò)增區(qū)中的保守序列區(qū)設(shè)計一條單堿基延伸探針，探針的長度為14-28個堿基，在探針的3’末端，允許延伸一個經(jīng)設(shè)計確定的堿基，作為該基因型特異性序列標(biāo)記，單堿基延伸后總長度不超過29個堿基，每個探針的延伸產(chǎn)物之間分子量相差至少16Da。各種HPV擴(kuò)增引物序列見表1，其對應(yīng)的堿基延伸探針見表2。

(2)通過PCR擴(kuò)增，獲得待測樣本中靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物。

PCR反應(yīng)體系配制見表3.

表3

試劑最終濃度體積(1×)

Water，HPLC grade N/A 0.3μL

10X Buffer w/20mM MgCl2 2mM MgCl2 0.5μL

25mM MgCl2 2mM 0.4μL

25mM dUTP/dNTP Mix 500mM 0.1μL

UNG Enzyme(1U/ul)0.5U 0.5μL

0.5mM Primer mix 0.1mM 1.0μL

5U/ml PCR enzymea 1Unit 0.2μL

Template DNA(5-20ng/μL)2.0μL

Total 5.0μL

先用37℃-50℃2分鐘，進(jìn)行dUTP的消化，然后94℃4分鐘滅活，(同時這一步

也達(dá)到預(yù)變性的效果)，隨后作PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃

延伸1分鐘，共45個循環(huán)；最終72℃延伸5分鐘，完成后恒溫于4℃。

(3)通過蝦堿性磷酸酶(SAP)處理，使未結(jié)合的剩余核酸(dNTPs)脫磷酸失活，預(yù)

防干擾下一步堿基延伸反應(yīng)。SAP消化酶反應(yīng)體系見表4。

表4

試劑體積/反應(yīng)

Water，HPLC grade 1.53μL

10×SAP buffer 0.17μL

SAP enzyme(1.7U/ml)0.3μL

Total 2.0μL

反應(yīng)條件為37℃孵育40分鐘，去除剩余dNTPs；然后用85℃5分鐘使SAP酶失活。

(4)通過堿基延伸反應(yīng)，在單堿基延伸探針的3’端，延伸一個序列特異性單核苷酸，作分子量標(biāo)記，得到的延伸產(chǎn)物與所述延伸探針及各型別延伸產(chǎn)物之間的分子量差異

不小于16Da，延伸反應(yīng)體系見表5。

表5

試劑體積/反應(yīng)

Water，HPLC grade 0.619μLc

10×iPLEX buffer plus 0.2μL

iPLEX terminator mix 0.2μL

Primer mix*0.94μL

iPLEX enzyme 0.041μL

Total 2.0μL

*延伸反應(yīng)探針mix的濃度，按照各型分子量大小進(jìn)行線性關(guān)系調(diào)節(jié)，總濃度約為

8-15M，最終濃度約為0.84-1.57M。

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SEQUENCE LISTING

<110> 北京萬泉麟科技有限公司

<120> 一種廣譜檢測致癌病原微生物的方法

<130> 1

<160> 111

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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acgttggatg tgcacggtct argagacct 29

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

acgttggatg gcttttcttc tgggtaytac 30

<210> 59

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

acgttggatg gcttttctga asggytctaa g 31

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

acgttggatg gtaaacaatg cagyaccagg 30

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

acgttggatg aaaagaccag ragtcacagc 30

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

acgttggatg tatgaatccr cctatycccc 30

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

acgttggatg tgtacctccr ttgctattcg 30

<210> 64

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

acgttggatg ttaagaatyc cattagagcg 30

<210> 65

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

acgttggatg gcctggtcga yagraccaat 30

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

acgttggatg gggttcatga cytttagctg 30

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

acgttggatg ataaaatrcc sggtcttacc 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

acgttggatg cttccaccta crgggatgag 30

<210> 69

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

acgttggatg caggcaacaa rccagttttc 30

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

acgttggatg agtggtgatg gcattagtgg 30

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

acgttggatg actgtgcttg acctaggaac 30

<210> 72

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

acgttggatg aaagcagcac ttgactagag 30

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

acgttggatg cggtgtttgc agatttggac 30

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

acgttggatg tgaatagcca aggtgagcgg 30

<210> 75

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

ctcacttcgc ttcac 15

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

gatcccgcac ttgtattccc 20

<210> 77

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

gagcctacag cctcctagta caaa 24

<210> 78

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

gcgggagcca aagta 15

<210> 79

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

gacaccatat catctaattg tt 22

<210> 80

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

tgcctaggcc accttctcag tcca 24

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

tcctgctgtt ctaatgttgt 20

<210> 82

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

ctgacacgca gtacaaata 19

<210> 83

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

aagttgtgta tattgcaaga c 21

<210> 84

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

gtttctccct ctccaa 16

<210> 85

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

ctccgatcca gaaagcct 18

<210> 86

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

aggagagcct gtctgaat 18

<210> 87

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

tgtaatacgc gtccca 16

<210> 88

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

tgtagcctac actttggcca cc 22

<210> 89

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

ttcttacttt gtattgttct acc 23

<210> 90

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

gtaacacatc ccacccattt a 21

<210> 91

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

acccaacatc gcttcaat 18

<210> 92

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

cgattctgcg attactag 18

<210> 93

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

tgtctgaagc caacc 15

<210> 94

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

cgatacgacc aaccat 16

<210> 95

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

ggttttgatc tactcaaatt gatt 24

<210> 96

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

tcttaaaata accaaaactc aaacc 25

<210> 97

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

atcatcacca aagaagcc 18

<210> 98

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

gcaaaaatga acaacacata gatac 25

<210> 99

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

ctggggagag ccatagtggt 20

<210> 100

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

aagggttgtg gtactgcctg at 22

<210> 101

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 101

gtgggctgca tgttg 15

<210> 102

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

gggtctggaa aggtgaa 17

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 103

agggcagtca tcataaaggt 20

<210> 104

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 104

gattgctggg tgtattgaaa a 21

<210> 105

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 105

caatagtagg ctgacgact 19

<210> 106

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 106

tgagctggtt ggattg 16

<210> 107

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 107

cctatttgtg aatggcattg t 21

<210> 108

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 108

tcaaggtgga gtggg 15

<210> 109

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 109

tgaggtcatg gataaatcg 19

<210> 110

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 110

gcccaagtga gacattttag 20

<210> 111

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 111

agggttctga cctgaag 17