本發(fā)明涉及一種雙相多酶偶聯(lián)體系高效制備(S)-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

(S)-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷((S)-p-nitrostyrene oxide,(S)-pNSO)分子式為C₈H₇NO₃，與(R)-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷互為對(duì)映異構(gòu)體，是一類在有機(jī)合成和藥物制備中非常重要的中間體物質(zhì)，可用于β-受體阻滯劑硝苯洛爾等藥物的合成。

手性環(huán)氧化物的制備方法有拆分法和合成法。

拆分法包括生物拆分法和化學(xué)拆分法，由于拆分法固有的限制，得到的產(chǎn)物最大理論得率僅為50％。通過(guò)合成法可突破這一限制，得到理論產(chǎn)率為100％的產(chǎn)物。

合成法分為化學(xué)合成法和生物合成法。其中，化學(xué)合成法以金屬催化的不對(duì)稱合成為主，但目前大多數(shù)還存在成本太高、反應(yīng)條件比較苛刻、不綠色環(huán)保、收率太低、光學(xué)純度不夠等諸多問(wèn)題。生物合成法則具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保的特點(diǎn)，目前逐漸成為研究熱點(diǎn)。通過(guò)把微生物的完整全細(xì)胞或者其中的酶當(dāng)作生物催化劑，可實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，有的反應(yīng)可通過(guò)一種酶一步反應(yīng)就可以完成，有的需要多種酶和一定反應(yīng)條件或多種酶幾步反應(yīng)來(lái)完成催化反應(yīng)。

對(duì)于(S)-pNSO合成方法，目前主要集中于化學(xué)合成法和化學(xué)酶促法，也有通過(guò)雙酶串聯(lián)法制備得到(S)-pNSO，但是也需要經(jīng)由化學(xué)法得到雙酶的底物。

其中，化學(xué)合成法是將α-溴代對(duì)硝基苯乙酮溶于適量甲醇中，加入硼氫化鈉還原α-溴代對(duì)硝基苯乙酮，得到消旋體2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷，再通過(guò)手性柱制備得到(S)-pNSO，化學(xué)制備法生成大量副反應(yīng)，得到產(chǎn)品產(chǎn)率低，手性柱制備成本高，難以應(yīng)用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中。

化學(xué)酶促法雖然得到的產(chǎn)物(S)-pNSO的光學(xué)純度大于99％ee，但是步驟復(fù)雜，要通過(guò)一步化學(xué)合成方法和兩步生物合成法得到終產(chǎn)物(S)-pNSO。首先將α-溴代對(duì)硝基苯乙酮溶于甲醇中，加入硼氫化鈉反應(yīng)一定時(shí)間后向反應(yīng)液中加入水，用乙酸乙酯提取混合物，加入鹵水處理以除去雜質(zhì)，經(jīng)干燥、旋蒸去除溶劑，得到消旋體2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇和消旋體2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷的混合物。將混合物溶解后加入緩沖液，添加含有鹵代醇脫鹵酶的全細(xì)胞開始脫鹵閉環(huán)反應(yīng)，待消旋體2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇完全轉(zhuǎn)化為2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷，迅速調(diào)整pH和溫度，添加亞硝酸鈉及鹵代醇脫鹵酶，得到(S)-pNSO的ee值大于99％，最后通過(guò)硅膠色譜柱將產(chǎn)物純化?；瘜W(xué)酶促法步驟冗長(zhǎng)、后處理過(guò)程復(fù)雜使得大規(guī)模經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)(S)-pNSO較為困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種雙相多酶偶聯(lián)的方法，提高生物合成法制備(S)-pNSO的得率和e.e.值，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

(1)將共表達(dá)葡萄糖脫氫酶和羰基還原酶的單質(zhì)粒雙啟動(dòng)子的菌株E.coli/pETDuet-Sygdh-Sys1發(fā)酵后，離心收集菌體，添加到緩沖溶液/異丁醇兩相反應(yīng)溶液中，同時(shí)添加添加一定量的NADP⁺、葡萄糖、對(duì)硝基溴代苯乙酮(BNP)，實(shí)現(xiàn)不對(duì)稱還原對(duì)硝基溴代苯乙酮(BNP)產(chǎn)生中間產(chǎn)物(S)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇((S)-BNE)的過(guò)程；

(2)將單表達(dá)鹵代醇脫鹵酶基因的菌株E.coli/pET-28a(+)-SyHheC發(fā)酵培養(yǎng)后，破碎菌體，離心收集上清液得到鹵代醇脫鹵酶粗酶液，待步驟(1)中底物BNP轉(zhuǎn)化為(S)-BNE后，向其中添加鹵代醇脫鹵酶粗酶液，并補(bǔ)充適量緩沖溶液，反應(yīng)一定時(shí)間；

(3)酶促反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入異丁醇進(jìn)行萃取，離心得到萃取相，并干燥、過(guò)濾得到(S)-pNSO。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(1)所述緩沖溶液/異丁醇兩相反應(yīng)溶液是按體積比7:3或6:4或5:5或4:6或3:7混合的100mmol/L的pH 8.0的磷酸鉀緩沖液與異丁醇。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(1)所述緩沖溶液/異丁醇兩相反應(yīng)溶液是按體積比7:3混合的100mmol/L的pH 8.0的磷酸鉀緩沖液與異丁醇。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(1)底物BPN的初始反應(yīng)濃度為10-30mmol/L，葡萄糖初始反應(yīng)濃度為80mmol/L、輔因子NADP⁺的初始濃度為0.2mmol/L，重組大腸桿菌E.coli/pETDuet-Sygdh-Sys1的用量以濕細(xì)胞計(jì)為70mg/ml。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(1)反應(yīng)溫度為35℃，攪拌轉(zhuǎn)速為220rpm，反應(yīng)時(shí)間為0.5～9h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(1)反應(yīng)溫度為35℃，攪拌轉(zhuǎn)速為220rpm，反應(yīng)時(shí)間為4～9h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(1)反應(yīng)時(shí)間為9h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(2)是向步驟(1)的體系中添加50μl的3.03U/ml的鹵代醇脫鹵酶粗酶液和一定量的磷酸鉀緩沖液，反應(yīng)180min。

本發(fā)明先利用葡萄糖脫氫酶和羰基還原酶催化BNP得到中間產(chǎn)物(S)-BNE，再通過(guò)鹵代醇脫鹵酶催化(S)-BNE反應(yīng)得到(S)-pNSO；本發(fā)明通過(guò)有機(jī)-水兩相反應(yīng)體系可解決單相溶液系統(tǒng)中底物溶解度差和環(huán)氧底物會(huì)發(fā)生自發(fā)水解的問(wèn)題，利用多酶偶聯(lián)的方法，不用經(jīng)過(guò)化學(xué)法合成酶的底物，僅需相對(duì)便宜的前手性底物、廉價(jià)的輔助底物和添加少量的輔酶就可以得到高e.e.值、高收率的目標(biāo)產(chǎn)品，產(chǎn)物(S)-2-(4-硝基苯基)環(huán)氧乙烷摩爾產(chǎn)率可達(dá)99.9％，e.e.值＞99％。可見，本發(fā)明能使生產(chǎn)成本降低，且條件溫和、方法簡(jiǎn)便。

附圖說(shuō)明

圖1：水/有機(jī)兩相體系中多酶偶聯(lián)催化合成(S)-pNSO的工藝路線；

圖2：BNP濃度對(duì)多酶催化反應(yīng)的影響；

圖3：不同配比的緩沖液/異丁醇對(duì)多酶催化反應(yīng)的影響；

圖4：反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成(S)-pNSO第一步反應(yīng)的影響；

圖5：反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成(S)-pNSO第二步反應(yīng)的影響。

具體實(shí)施方式

以2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇為底物，每分鐘消耗1μmol底物所需的酶量定義為1個(gè)鹵代醇脫鹵酶酶活性單位(U)。

產(chǎn)物的檢測(cè)方法：在反應(yīng)體系中加入等體積的異丁醇進(jìn)行萃取，離心吸取異丁醇相，適量無(wú)水硫酸鎂干燥，0.22μm有機(jī)膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。所用HPLC檢測(cè)(S)-BNE、(S)-pNSO產(chǎn)率和e.e.值的方法：高效液相色譜(HPLC)為Waters高效液相色譜儀，反相色譜柱為AS-H(4.6mmΦ×250mmL×5μm)，柱溫為30℃，采用2489紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，一步等度洗脫，流動(dòng)相為異丙醇/正己烷(8/2,v/v)，流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量為10μL。(S)-BNE的出峰時(shí)間為15.783min，(S)-pNSO的出峰時(shí)間為16.940min，底物BPN出峰時(shí)間為22.518min。

計(jì)算產(chǎn)物的產(chǎn)率和e.e.值采用外標(biāo)法計(jì)算：分別配置0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L和2mmol/L的(S)-BNE、(S)-pNSO的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。c_待＝A_待×c_標(biāo)/A_標(biāo)，其中c_待和A_待代表待測(cè)樣品的摩爾濃度和峰面積；c_標(biāo)和A_標(biāo)代表標(biāo)準(zhǔn)品的摩爾濃度和峰面積。e.e.值＝[(S-R)/(S+R)]×100％：其中S和R分別代表(S)-和(R)-BNE或(S)-和(R)-pNSO的最終摩爾濃度。

實(shí)施例1重組菌E.coli BL21/pETDuet-Sygdh-Sys1及E.coli/pET-28a(+)-SyHheC的發(fā)酵及菌液、酶液的獲取

共表達(dá)葡萄糖脫氫酶和羰基還原酶的單質(zhì)粒雙啟動(dòng)子的菌株E.coli/pETDuet-Sygdh-Sys1的構(gòu)建方法，參見公布號(hào)為CN104388373A的、發(fā)明名稱為“一種共表達(dá)羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌系統(tǒng)的構(gòu)建”的中國(guó)專利申請(qǐng)。

單表達(dá)鹵代醇脫鹵酶基因的菌株E.coli/pET-28a(+)-SyHheC的構(gòu)建方法參見《食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)》2015年34(5)：494-500發(fā)表的文章《新型鹵代醇脫鹵酶基因的克隆，序列分析及表達(dá)》。是登錄號(hào)為KF853591.1的編碼鹵代醇脫鹵酶的基因SyHheC，與表達(dá)載體pET28a連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-SyHheC，酶切位點(diǎn)為NcoⅠ和NotⅠ，轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)。

將E.coli BL21/pETDuet-Sygdh-Sys1菌株接種于含終濃度為100μg/mL氨芐青霉素的2mL LB培養(yǎng)基中，37℃、215rpm培養(yǎng)過(guò)夜；再分別以2mL/dL轉(zhuǎn)接入30mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD₆₀₀約為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度0.6mmol/L，26℃誘導(dǎo)表達(dá)12h。離心培養(yǎng)液(8 000rpm,10min)收集得到E.coli BL21/pETDuet-Sygdh-Sys1濕菌體。

將E.coli/pET-28a(+)-SyHheC菌株接種于含終濃度為100μg/mL卡那霉素的2mL LB培養(yǎng)基中，37℃、215rpm培養(yǎng)過(guò)夜；再分別以2mL/dL轉(zhuǎn)接入30mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD₆₀₀約為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度0.1mmol/L，30℃誘導(dǎo)表達(dá)8h。離心培養(yǎng)液(8 000rpm,10min)收集得到E.coli/pET-28a(+)-SyHheC菌體后，用6mL磷酸鉀緩沖液(20mmol/L,pH 8.0)懸浮。以功率200W、工作3s、間隔8s的條件冰浴超聲波破碎E.coli/pET-28a(+)-SyHheC菌體，破碎時(shí)間為15min。超聲破碎后，冷凍離心機(jī)離心(14000rpm,15min)，上清即是SyHheC粗酶液。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2有機(jī)溶劑的選擇

分別選用對(duì)三種酶活性影響較少的幾種有機(jī)溶劑，包括二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、正己烷、環(huán)己烷、正辛烷、異辛烷、正庚烷和異丁醇，溶解底物BNP，肉眼觀察底物的溶解情況。由于底物BNP的溶解性非常差，不溶于水和烷類等有機(jī)溶劑，只溶于DMF等高極性溶劑，而另一方面對(duì)于產(chǎn)物的檢測(cè)技術(shù)有限，需要高效液相色譜的檢測(cè)方法，而高效液相色譜采用的手性色譜柱AS-H是極性填料，對(duì)于BNP的助溶劑的要求是不能使用DMF等極性溶劑。故要選擇一種對(duì)BNP、(S)-BNE和(S)-pNSO都有很好的溶解性的且對(duì)色譜柱無(wú)傷害或傷害最小的，又對(duì)涉及的三種酶的酶活性影響小的有機(jī)溶劑。本發(fā)明選定異丁醇作為有機(jī)溶劑。

實(shí)施例3底物BNP濃度對(duì)中間產(chǎn)物生成的影響

向按體積比4:6混合的100mmol/L的pH 8.0磷酸鉀緩沖液/異丁醇中添加終濃度為80mmol/L的D-葡萄糖、0.2mmol/L的NADP⁺和70mg/mL的E.coli/Sygdh-Sys1濕菌體，構(gòu)成1mL反應(yīng)體系，添加不同濃度的BNP(10～30mmol/L)進(jìn)行酶促反應(yīng)，35℃、220rpm搖床中反應(yīng)12h后，加入1mL異丁醇進(jìn)行萃取，10000rpm，2min離心吸取異丁醇相，適量無(wú)水硫酸鎂干燥，0.22μm有機(jī)膜過(guò)濾。用高效液相色譜對(duì)中間產(chǎn)物(S)-BNE的產(chǎn)率和e.e.值進(jìn)行分析，結(jié)果如下圖2所示，當(dāng)BNP濃度低于15mmol/L時(shí)，中間產(chǎn)物(S)-BNE的產(chǎn)率可達(dá)90％以上；而隨著底物濃度的繼續(xù)加大，產(chǎn)率急速下降。

實(shí)施例4緩沖液/異丁醇配比的選擇對(duì)中間產(chǎn)物生成的影響

向按體積比4:6混合的100mmol/L的pH 8.0磷酸鉀緩沖液/異丁醇中添加終濃度為15mmol/L的BNP作為底物、80mmol/L的D-葡萄糖、0.2mmol/L的NADP⁺作為輔酶循環(huán)底物和輔酶、70mg/mL的E.coli/Sygdh-Sys1濕菌體，構(gòu)成1mL反應(yīng)體系；改變磷酸鉀緩沖液(100mmol/L,pH 8.0)/異丁醇的兩相配比為7:3、6:4、5:5、4:6、3:7，反應(yīng)體系終體積為1mL，置于35℃、220rpm搖床中反應(yīng)12h后，加入1mL異丁醇進(jìn)行萃取，離心吸取異丁醇相，干燥過(guò)濾。高效液相色譜對(duì)中間產(chǎn)物(S)-BNE的產(chǎn)率和e.e.值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在不同比例的緩沖液/異丁醇反應(yīng)體系中，如圖3所示，中間產(chǎn)物(S)-BNE的產(chǎn)率隨著有機(jī)相異丁醇的增大而下降。酶在有機(jī)溶劑中會(huì)損失一部分的酶活性，而且菌體需要一定的水相保持流動(dòng)性而增加底物和酶的接觸，所以選擇緩沖液/異丁醇配比為7:3，此時(shí)(S)-BNE的產(chǎn)率最大。

實(shí)施例5合成(S)-pNSO第一步的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程

1mL體系中含體積比為7:3的100mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)/異丁醇、15mmol/L底物BNP、80mmol/LD-葡萄糖、0.2mmol/LNADP⁺和E.coli/Sygdh-Sys1濕菌體70mg/mL，于35℃、220rpm分別反應(yīng)0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h，加入1mL異丁醇進(jìn)行萃取，離心吸取異丁醇相，干燥，0.22μm有機(jī)膜過(guò)濾。高效液相色譜對(duì)中間產(chǎn)物(S)-BNE的產(chǎn)率和e.e.值進(jìn)行分析，如圖4，時(shí)間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)率和e.e.值為縱坐標(biāo)所得曲線即為合成(S)-pNSO第一步的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程。在反應(yīng)開始的前6h產(chǎn)物(S)-BNE的摩爾產(chǎn)率增加比較快速；6h后趨于平緩；反應(yīng)9h后(S)-BNE的摩爾產(chǎn)率可達(dá)99.8％；反應(yīng)過(guò)程中e.e.值始終保持在99.9％以上。所以選擇合成(S)-pNSO第一步的最佳時(shí)間為9h。

實(shí)施例6合成(S)-pNSO第二步的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程

實(shí)施例4的第一步反應(yīng)完成后，加入50μL的3.03U/ml的SyHheC酶液(每分鐘消耗1μmol中間產(chǎn)物(S)-BNE所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位U)，并添加適量100mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)至反應(yīng)終體積為2mL，于35℃、220rpm分別反應(yīng)30～180min，間隔30min，加入2mL異丁醇進(jìn)行萃取，離心吸取異丁醇相，適量無(wú)水硫酸鎂干燥，0.22μm有機(jī)膜過(guò)濾。高效液相色譜對(duì)中間產(chǎn)物(S)-pNSO的產(chǎn)率和e.e.值進(jìn)行分析，如圖5，時(shí)間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)率和e.e.值為縱坐標(biāo)所得曲線即為合成(S)-pNSO第二步的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程。反應(yīng)前2h反應(yīng)速率較大，后趨于平穩(wěn)，3h后(S)-pNSO的摩爾產(chǎn)率可達(dá)99.9％，反應(yīng)過(guò)程中e.e.值始終保持在99.9％以上。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。