專利名稱：麥芽糖測(cè)定試劑盒及麥芽糖濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種麥芽糖測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定麥芽糖濃 度的方法，屬于食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景麥芽糖分子為無色或白色晶體，還原性二糖，有醛基反應(yīng)，能發(fā)生銀鏡 反應(yīng)，也能與班氏試劑(用硫酸銅、碳酸鈉或苛性鈉、擰檬酸鈉等溶液配 制)共熱生成磚紅色氧化亞銅沉淀。能使溴水褪色，被氧化成麥芽糖酸。 用作食品、營養(yǎng)劑等。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(CoupleReaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原 型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測(cè)定麥 芽糖濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的麥芽糖測(cè)定試 劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀 上進(jìn)行麥芽糖濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí) 的推廣應(yīng)用。本發(fā)明麥芽糖濃度測(cè)定方法原理如下麥牙糖+磷酸根麥芽糖磷酸化酶葡萄糖+葡萄糖1-磷酸 葡萄糖+氧葡萄糖氧化酶葡糖酸內(nèi)酯+過氧化氫4過氧化氫+還原型輔酶 NADH過氧化物酶 輔酶+ 2水 這種方法應(yīng)用麥芽糖磷酸化酶(Disaccharidephosphorylases; EC 2.4.1.8) (偶)聯(lián)葡萄糖氧化酶(glucose oxidase; EC 1.1.3.4)、 NADH過氧化物酶 (NADHperoxidase; ECl.ll丄l; EC Ul丄2)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法/終點(diǎn) 比色法。麥芽糖磷酸化酶酶解麥芽糖反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖，再通過(偶)聯(lián)合 葡萄糖氧化酶、NADH過氧化物酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測(cè)定還 原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度，通過測(cè)量340nm處吸光度 下降的程度/速度，可以測(cè)算麥芽糖的濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明麥芽糖測(cè)定試劑盒較 為理想磷酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L麥芽糖磷酸化酶 10000 U/L葡萄糖氧化酶 12000 U/LNADH過氧化物酶 12000 U/L本發(fā)明的麥芽糖測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化 酶、NADH過氧化物酶。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。 試劑2磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NADH過氧化物酶。還原型輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NADH過氧化物酶在試 劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。 試劑2磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖氧化酶、NADH過氧化物酶。 試劑3磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、麥芽糖磷酸化酶。還原型輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NADH過氧化物酶在試 劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定麥芽糖濃度的方法，其還原型 輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的 一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一本實(shí)施例的麥芽糖測(cè)定試劑為單試劑，包括磷酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L麥芽糖磷酸化酶 10000 U/L葡萄糖氧化酶 12000 U/LNADH過氧化物酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長340nm，測(cè)試副波長405nm，被測(cè)麥芽糖樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出麥芽糖的濃度大小。實(shí)施例二本實(shí)施例的麥芽糖測(cè)定試劑為雙試劑，包括-試劑1磷酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶100mmol/L50 mmol/L0.25 mmol/L試劑2磷酸緩沖液 穩(wěn)定劑麥芽糖磷酸化酶 葡萄糖氧化酶 NADH過氧化物f100 mmol/L500 mmol/L10000U/L12000U/L12000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長340nm，測(cè)試副波長405nm，被測(cè)麥芽糖樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出麥芽糖的濃度大小。實(shí)施例三本實(shí)施例的麥芽糖測(cè)定試劑為三試劑，包括 試劑1磷酸緩沖液 穩(wěn)定劑100 mmol/L 50 mmol/L還原型輔酶0.25 mmol/L試劑2磷酸緩沖液 穩(wěn)定劑葡萄糖氧化酶 NADH過氧化物酶100 mmol/L500 mmol/L12000U/L12000U/L試劑3磷酸緩沖液 穩(wěn)定劑麥芽糖磷酸化酶畫mmol/L500 mmol/L10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定麥芽糖濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C,反應(yīng)時(shí) 間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長340nm，測(cè)試副波長405nm， 被測(cè)麥芽糖樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出麥芽糖的濃 度大小。申請(qǐng)人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)il定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用,
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的麥芽糖濃度測(cè)定方法，其方法原理如下麥牙糖+磷酸根 麥芽糖磷酸化酶 葡萄糖+葡萄糖1-磷酸葡萄糖+氧 葡萄糖氧化酶 葡糖酸內(nèi)酯+過氧化氫過氧化氫+還原型輔酶 NADH過氧化物酶 輔酶+2水將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測(cè)算出麥芽糖的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種麥芽糖測(cè)定試劑盒，主要成分包括: 磷酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 麥芽糖磷酸化酶 葡萄糖氧化酶NADH過氧化物酶其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。反應(yīng)中，磷酸緩沖液提供磷酸根底物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述麥芽糖測(cè)定試劑盒，其特征在于 由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、 NADH過氧化物酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述麥芽糖測(cè)定試劑盒，其特征在于由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、 NADH過氧化物酶組成雙劑試劑；試劑l，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、組成；試劑2，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、麥芽糖磷酸化酶、 葡萄糖氧化酶、NADH過氧化物酶組成。還原型輔酶、麥芽糖磷酸化酶、 葡萄糖氧化酶、NADH過氧化物酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述麥芽糖測(cè)定試劑盒，其特征在于-由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、 NADH過氧化物酶組成多劑試劑；試劑l，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、還 原型輔酶、組成；試劑2，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖氧化酶、NADH 過氧化物酶組成；試劑3，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、麥芽糖磷酸化酶組 成。還原型輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NADH過氧化物酶 在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述麥芽糖測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的麥芽糖測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定麥芽糖濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括磷酸緩沖液、還原型輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NADH過氧化物酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出麥芽糖的濃度大小。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK101329260SQ20071002471
公開日2008年12月24日 申請(qǐng)日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司