專利名稱：一種富馬酸產(chǎn)生菌及其誘變篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)有機酸的領(lǐng)域，具體涉及 一株產(chǎn)富馬酸的菌株，以及獲得該菌株的誘變篩選方法和利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的方 法。
背景技術(shù)：
富馬酸(fumaricacid)，又名反丁烯二酸、延胡索酸，是生物體的重要中間代謝產(chǎn)物， 同時也是一種重要有機化工原料，廣泛用于食品、醫(yī)藥、材料及化工等領(lǐng)域。并且富馬酸 作為一種重要的四碳平臺化合物，還可以通過酶催化轉(zhuǎn)化、酯化、加氫等工藝生產(chǎn)L-天 冬氨酸、蘋果酸、琥珀酸、馬來酸、1,4-丁二醇(BDO)、 ？丁內(nèi)酯(GBL)和四氫呋喃(THF) 等大宗化學(xué)品。
目前全世界富馬酸的生產(chǎn)能力為34萬噸/年，其中我國富馬酸年產(chǎn)量達到5萬噸/年 左右，我國富馬酸的消費結(jié)構(gòu)大致為不飽和聚酯樹脂50%，紙張料助劑22%，食品添 加劑13%，醫(yī)藥10%,其他5%。與世界范圍內(nèi)的富馬酸消費結(jié)構(gòu)相比較，我國富馬酸的 應(yīng)用范圍小、用途單一，隨著其應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，尤其作為一種平臺化合物，從它出 發(fā)可以合成很多高分子材料和四碳化合物，在石油資源日益短缺的情況下，其開發(fā)應(yīng)用前 景將越來越廣闊。
目前工業(yè)上富馬酸主要通過順酐異構(gòu)和糠醛氧化等化學(xué)方法獲得。其中又以順酐異構(gòu) 法為主，但該工藝的主要原料順酐多采用苯法和正丁烷法生產(chǎn)，需要石油資源，工藝條件 要求苛刻；雖然糠酵氧化法的主要原料糠醛可由植物纖維原料經(jīng)水解獲得，但工藝副反應(yīng) 多，生產(chǎn)成本較高。化學(xué)法制備富馬酸所面臨的主要難題是化石資源的短缺、生產(chǎn)成本的 提高以及對環(huán)境的污染等，同時化學(xué)法制備的富馬酸品質(zhì)達不到食品級或者飼料級要求， 限制了其使用范圍。而生物法合成富馬酸具有操作條件溫和、環(huán)境污染小、可持續(xù)發(fā)展性 強等優(yōu)點，同時富馬酸純度較高且副產(chǎn)物無毒無害，符合食品級標(biāo)準(zhǔn)。因此利用生物法替 代化學(xué)法進行富馬酸的工業(yè)化生產(chǎn)受到了越來越多的關(guān)注，意大利、德國、美國以及日本 等國家的專家學(xué)者都在進行相關(guān)的研究工作。
微生物發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸最早可追溯到20世紀(jì)初期，Wehmer C.教授發(fā)現(xiàn)以葡萄糖 作為底物在有氧的情況下可以由曲霉菌(Ar，A^7/w)產(chǎn)生富馬酸。隨后，Butkevich V. S. 等人發(fā)現(xiàn)加入乙酸和CaC03有助于毛霉菌(Mwco。發(fā)酵產(chǎn)生富馬酸。從上世紀(jì)40年代 開始，科學(xué)家開始研究根霉菌(i /z/zo;nw)，例如米根霉(/ /n'zo;ms o叮zae)、少根根霉 (i /z/zo; ^r a r/z/z^)以及黑根霉(i /u'zo; ^ w/g〃'cara)等的發(fā)酵產(chǎn)酸條件。Foster J. W. 等人利用i . 厭氧發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸，得率為20% (g/100g葡萄糖，下同)，同時
還產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物乙醇、乳酸等。RauchJ.等人對根霉菌的深層液體培養(yǎng)進行了研究， 發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入中和試劑Na2C03維持pH在5.0-6.0之間，可使富馬酸的得率最高 達到30%-40% 。 Rhodes等人進行了一系列i /u'zo;nw a/r/z/zws產(chǎn)富馬酸的培養(yǎng)條件優(yōu)化研 究，在20L發(fā)酵罐中利用CaC03做中和劑，100g葡萄糖可以產(chǎn)生65g富馬酸。Lorraine B. 等人通過分階段溶氧控制策略，利用/ /^op^fl/T/n'z^發(fā)酵生產(chǎn)有機酸，130g/L的葡萄糖 最高可以得到135g/L的富馬酸，占發(fā)酵產(chǎn)總酸的比例約為78%，同時發(fā)酵液中含有琥珀 酸、蘋果酸、a-酮戊二酸等多種有機酸。George T. Tsao等人采用反應(yīng)分離耦合及循環(huán)補 料技術(shù)，利用i /n'zc^w or;^7e發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸，糖酸轉(zhuǎn)化率最高可達85% (100 g/L的葡 萄糖產(chǎn)出85 g/L的富馬酸)?？茖W(xué)家還研究發(fā)現(xiàn)利用假絲酵母(a7"A'^)以石蠟作為底 物以及利用假單胞菌(尸wi^omo^^)以馬來酸作為轉(zhuǎn)化對象都可以得到富馬酸，但石蠟 和馬來酸也是石化產(chǎn)品，隨著原油價格的年年攀升，富馬酸的生產(chǎn)成本也不斷提高，工業(yè) 應(yīng)用前景不被看好。
我國科學(xué)家對微生物發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的研究始于20世紀(jì)70年代中期。1975年，山 西微生物研究所的張俊賢等人篩選出一株具有產(chǎn)富馬酸能力的i /n'z叩^ a/r/^M,并對其 發(fā)酵條件進行了初步探索。當(dāng)i /^o; ^mrWz^振蕩培養(yǎng)于含有12%的葡萄糖培養(yǎng)基時， 富馬酸產(chǎn)量有53.5g/L，得率為44.6 %，同時發(fā)酵液中還含有較多的副產(chǎn)物L(fēng)-蘋果酸 (21.2g/L)。后來由于生物合成富馬酸產(chǎn)量低、成本高、副產(chǎn)物較多、應(yīng)用前景不明朗等 原因，而沒能繼續(xù)深入研究下去，使得目前我國富馬酸的發(fā)酵技術(shù)嚴(yán)重落后于國際水平。 于是選育營養(yǎng)要求簡單、糖酸轉(zhuǎn)化率高、副產(chǎn)物少的富馬酸生產(chǎn)菌，是實現(xiàn)自主創(chuàng)新、提 升我國富馬酸發(fā)酵水平的必然需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株能耐受高底物濃度及高產(chǎn)物濃度的富馬酸高產(chǎn)菌株。 本發(fā)明的另一目的是提供上述菌株的誘變篩選方法。
本發(fā)明還有一個目的是提供利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的方法。 本發(fā)明的目的可以通過以下措施達到
一種富馬酸產(chǎn)生菌，其分類命名為米根霉(i /n'zo/^w Oryzae) ME-FU，已保藏于中 國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO: M 207066。
得到富馬酸產(chǎn)生菌米根霉(W/zo/nw O少zae) ME-F11的誘變篩選方法，將具有富馬 酸生產(chǎn)能力的米根霉經(jīng)化學(xué)和離子束復(fù)合誘變后再次篩選獲得富馬酸產(chǎn)生菌米根霉 (腸'zopiw 0，ae) ME-F11 。
本發(fā)明的具有富馬酸生產(chǎn)能力的米根霉原料可以是購自菌種保藏中心，也可以是按常 規(guī)方法從森林樹下土壤中篩選出來。
其中化學(xué)和離子束復(fù)合誘變由以下步驟組成
(1) 配制培養(yǎng)基
液體培養(yǎng)基l:酵母浸出汁1.0~5.0g/L，麥芽浸出汁1.0~5.0g/L，蛋白胨1.0~5.0g/L， 甘油10~30g/L;
固體培養(yǎng)基h酵母浸出汁1.0-5.0g/L，麥芽浸出汁1.0~5.0g/L，蛋白胨1.0-5.0g/L， 甘油10-30 g/L，瓊脂20g/L;
(2) 制備孢子懸浮液將具有富馬酸生產(chǎn)能力的米根霉接種于固體培養(yǎng)基1，30~40°C 培養(yǎng)4~6天，待孢子成熟后，用無菌水、生理鹽水、吐溫溶液或磷酸鹽緩沖溶液洗脫孢 子，接于已經(jīng)滅菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，30 4(TC及100~150rpm下充分振蕩 20 60min，使孢子均勻分散，用滅過菌的脫脂棉、兩層紗布或兩層擦鏡紙過濾，即制得 孢子懸浮液l，孢子濃度控制在105~108個/1111備用；
(3) 孢子萌發(fā)培養(yǎng)將孢子懸浮液l以體積比h 5的比例與已滅菌的液體培
養(yǎng)基1混合后裝入三角瓶，30 4(TC及120 180rpm下振蕩培養(yǎng)l~2h后離心洗滌收集孢子；
(4) 化學(xué)誘變:將收集的孢子用磷酸鹽緩沖溶液稀釋，孢子濃度控制在105~108個/!111，
然后將稀釋所得的孢子懸浮液按照一定比例與一定濃度的化學(xué)誘變劑溶液亞硝基胍溶液 或硫酸二乙酯溶液混合，30 4(TC及150~250rpm下振蕩處理20 120min;然后在離心機 中4000 12000rpm離心5 20min，棄去上清液，用無菌水、生理鹽水、吐溫溶液或磷酸鹽 緩沖溶液洗孢子，然后加入上述液體(無菌水、生理鹽水、吐溫溶液或磷酸鹽緩沖溶液) 得孢子懸浮液2，孢子濃度控制在105~108個/1111;
(5) 離子束誘變?nèi)℃咦討腋∫?,均勻涂布于無菌空白培養(yǎng)皿中，在無菌條件下
室溫風(fēng)干；然后將這些含孢子培養(yǎng)皿放入離子注入機內(nèi)，耙室抽真空至l(T2~l(r4Pa，選 用10 30keV氮離子，2xl()U 4xlO"ions/cn^S劑量率，2xl0"~4xl015ions/cm2劑量對這些 孢子進行注入處理；最后取出培養(yǎng)皿，以無菌水洗脫，再進行稀釋調(diào)整孢子濃度為105~108 個/ml得到所需孢子懸浮液。
本發(fā)明所用到的亞硝基胍溶液的濃度為1.0~2.0g/L，硫酸二乙酯溶液的濃度為 100~150g/L，化學(xué)誘變劑溶液(亞硝基胍溶液或硫酸二乙酯溶液)與孢子懸浮液的體積比 為1- 5~h 9。
誘變篩選中所述的篩選由以下步驟組成 (1)配制培養(yǎng)基
液體培養(yǎng)基2:葡萄糖20 50g/L，尿素1.0~5.0g/L， KH2PO40.5~2.0g/L， MgS04.7H20 0.1~1.0g/L, MnSO4.H2O0,02~0.15g/L， CuS04.5H20 O.001~0.01g/L，通過向培養(yǎng)基中添加 H2S04、 HCl、 CaC03、 Ca(OH)2、 NaOH、 NaHC03、 Na2C03或NH3.H20中的一種或幾種 控制pH為2.0~6.0;
液體培養(yǎng)基3:葡萄糖120 200g/L，尿素0.5~2.0g/L， KH2PO40.1~1.0g/L， MgS04.7H20 0.1~1.0g/L， ZnS04.7H20 0.01~0.1g/L， FeS04.7H20 0.0卜0.1g/L,通過向培養(yǎng)基中添加 H2S04、 HCl、 CaC03、 Ca(OH)2、 NaOH、 NaHC03、 Na2C03或NH3.H20中的一種或幾種 控制pH為2.0-6.0;
固體培養(yǎng)基2:在PDA培養(yǎng)基(注 一種常見的霉菌培養(yǎng)基)中添加溴甲酚綠和脫
氧膽酸鈉，使其濃度分別為0.1 0.2g/L和1.0~2.0g/L;
固體培養(yǎng)基3: KMnO40.1~0.5g/L， KBr0.1~0.5g/L，瓊脂20g/L;
固體培養(yǎng)基4: 丁二酸30 60g/L，尿素1.0~5.0g/L， KH2PO40.5 2.0g/L， MgS04.7H20 0.1~1.0g/L， MnSO4.H2O0.02 0.15g/L， CuS04.5H20 0.001~0.01g/L，瓊脂20g/L;
固體培養(yǎng)基5:葡萄糖200 300g/L，尿素1.0~5.0g/L， KH2PO40.5~2.0g/L， MgS04.7H20 0.卜1.0g/L， MnSO4.H2O0.02~0.15g/L， CuS04.5H20 0.001~0.01g/L， CaC03 100~150g/L， 瓊脂20g/L;
固體培養(yǎng)基6:葡萄糖20 50g/L，尿素1.0~5.0g/L， KH2PO40.5~2.0g/L， MgS04.7H20 0.1~1.0g/L, MnSO4.H2O0.02~0.15g/L， CuS04.5H20 0.001~0.01g/L，富馬酸10~20g/L，瓊 脂20g/L;
固體培養(yǎng)基7:尿素1.0 5.0g/L， KH2P04 0.5~2.0g/L， MgS04.7H20 0.1~1.0g/L，
MnSO4.H2O0.02 0.15g/L， CuS04.5H20 0.001~0.01g/L，富馬酸10~20g/L，瓊脂20g/L;
(2) 初篩將經(jīng)過復(fù)合誘變后所得孢子懸浮液涂布接種于固體培養(yǎng)基2上，米根霉
生長過程中產(chǎn)生的富馬酸可以使菌落周圍的培養(yǎng)基出現(xiàn)黃色的變色圈。通過測量變色圈直 徑與菌落直徑，計算二者比值，選取比值較大的菌株保藏，進行第二次初篩。
將第一次初篩得到的黃色變色圈較大的培養(yǎng)基，用平板挖井法移入固體培養(yǎng)基3上進 行第二次初篩。培養(yǎng)24小時后，菌株生長產(chǎn)生的富馬酸會分泌到固體培養(yǎng)基3中，產(chǎn)生 特異性變色圈，同樣測量變色圈直徑與菌落直徑，計算二者比值，選取比值較大的菌株保 藏，進行復(fù)篩。
(3) 復(fù)篩將初篩得到的菌株接種于固體培養(yǎng)基1上，按照復(fù)合誘變(2)所述方法 制備孢子懸浮液，即30 4(TC培養(yǎng)4 6天，待孢子成熟后，用無菌水、生理鹽水、吐溫 溶液或磷酸鹽緩沖溶液洗脫孢子，接于已經(jīng)滅菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，30 40'C及 100 150rpm下充分振蕩20 60min，使孢子均勻分散，用滅過菌的脫脂棉、兩層紗布或 兩層擦鏡紙過濾，制得孢子懸浮液，孢子濃度控制在10^1()8個/ml;
將上述孢子懸浮液涂布接種于固體培養(yǎng)基4上，30 4(TC培養(yǎng)24~48小時后，挑出比 原始對照菌株生長明顯緩慢的突變株保藏，進行第二次復(fù)篩；將上述突變株接種于固體培 養(yǎng)基5上，將能夠在高葡萄糖濃度平板上迅速生長的菌株，轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基6上，挑選 出能夠繼續(xù)在高富馬酸濃度平板上生長的正突變菌株保藏，進行第三次復(fù)篩；將上述正突 變菌株接種于固體培養(yǎng)基7上，篩選出不分解利用富馬酸做為碳源的菌株保藏，進行再篩。
(4) 再篩將復(fù)篩得到的菌株接種于固體培養(yǎng)基1上，按照復(fù)合誘變(2)所述方法 制備孢子懸浮液，以1%~5%的接種量將上述孢子懸浮液接種于液體培養(yǎng)基2中進行種子 培養(yǎng)，30 40'C培養(yǎng)24 48小時后，將所得種子按照10%~30%的接種量接種于液體培養(yǎng) 基3中進行發(fā)酵培養(yǎng)，最終發(fā)酵所得富馬酸濃度達到60g/L以上為再篩指標(biāo)；
(5) 經(jīng)過初篩、復(fù)篩及再篩三級篩選程序，篩選得到復(fù)合誘變后的能耐受高底物濃 度及高產(chǎn)物濃度的富馬酸高產(chǎn)菌株。
一種利用本發(fā)明的i /n'加/7^07^eME-F11菌株發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的方法，由以下步驟 組成
(1)培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基為能提供碳源、氮源及無機鹽的固體培養(yǎng)基；
種子培養(yǎng)基為pH2.0 6.0的能提供碳源、氮源及無機鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基；
發(fā)酵培養(yǎng)基為pH2.0 6.0的能提供碳源、有限氮源及無機鹽的限氮液體培養(yǎng)基；
(2) 斜面培養(yǎng)將i /z/zo; ^ C^z^ME-Fll菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，在常規(guī)培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)，溫度30 4(TC，培養(yǎng)4 6天，待孢子成熟后用無菌水、生理鹽水、吐溫溶液或 磷酸鹽緩沖溶液洗脫孢子，接于已經(jīng)滅菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，30 40'C及 100 150rpm下充分振蕩20 60min，使孢子均勻分散，用滅過菌的脫脂棉、兩層紗布或兩 層擦鏡紙過濾，制得孢子懸浮液用于種子培養(yǎng)或菌株保藏；
(3) 種子培養(yǎng)裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶在115 121'C的高溫下滅菌15 30min，冷卻 后按照1%~5%的接種量接入孢子懸浮液，置于溫度為30~40°C、轉(zhuǎn)速為150~250rpm的 搖床上，培養(yǎng)36-60小時后的/ /n'zo; ^ C^zaeME-F11菌株用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種；
(4) 兩種發(fā)酵培養(yǎng)方法-
搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶在115 121'C的高溫下滅菌15 30min，冷卻 后按照10-30%的接種量接入經(jīng)過種子培養(yǎng)的i Wzopzw O^aeME-Fll菌株，置于溫度為 30~40°C、轉(zhuǎn)速為150 250rpm的搖床上，發(fā)酵培養(yǎng)60~96小時，發(fā)酵終止時富馬酸濃度 為90 120g/L;分離提取富馬酸，其中富馬酸產(chǎn)量占總酸產(chǎn)量的90~95%。
發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐在U5 121'C的高溫下滅菌15 30min, 冷卻后按照5~20%的接種量接入經(jīng)過種子培養(yǎng)的i /n'zo; iw OyzaeME-Fll菌株，溫度為 30~40°C，通氣比率為0.5 1.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速150 300rpm，發(fā)酵過程中采用碳酸鹽、碳 酸氫鹽、氫氧化物、氨水、無機酸或有機酸控制pH2.0 6.0，發(fā)酵培養(yǎng)60 96小時，發(fā)酵 終止時富馬酸濃度為90~120g/L;分離提取富馬酸，其中富馬酸產(chǎn)量占總酸產(chǎn)量的 90~95%。
發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的方法中，培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖、蔗糖、木糖、淀粉、甘露糖、果
糖或甘油中的一種或多種；氮源為尿素、蛋白胨、牛肉膏、麥芽浸出汁、酵母浸出汁、玉 米漿、硫酸銨、氯化銨或硝酸銨中的一種或多種；無機鹽為磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳、 硫酸銅、硫酸鋅、硫酸亞鐵、氯化鈣或氯化鈷中的一種或多種。
發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的方法中斜面培養(yǎng)基優(yōu)選為酵母浸出汁1.0 5.0g/L，麥芽浸出汁
1.0~5.0g/L，蛋白胨1.0~5.0g/L，甘油10 30g/L， 20 g/L的瓊脂；種子培養(yǎng)基優(yōu)選為葡 萄糖20~50g/L，尿素1.0~5.0g/L， KH2P040.5~2.0g/L， MgS04.7H20 0.1~l,0g/L， MnS04.H20 0.02~0.15g/L， CuS04.5H20 0.001~0.01 g/L，通過向培養(yǎng)基中添加H2S04、 HCl、 CaC03、 Ca(OH)2、 NaOH、 NaHC03、 Na2C03或NH3.H20中的一種或幾種控制pH為2.0 6.0;發(fā)
酵培養(yǎng)基優(yōu)選為葡萄糖120~200g/L,尿素0.5~2.0g/L, KH2P04 0.1-1.Og/L， MgS04.7H20 0.1~1.0g/L， ZnS04.7H20 0.01~0.1g/L， FeS04.7H20 0.01~0.1g/L，通過向培養(yǎng)基中添加 H2S04、 HCl、 CaC03、 Ca(OH)2、 NaOH、 NaHC03、 Na2C03或NH3.H20中的一種或幾種 控制pH為2.0~6.0;
本發(fā)明所用到的吐溫溶液的濃度為0.1~1.0 g/L,磷酸鹽緩沖溶液的濃度為 O.05~0.5mol/L， pH為5.0-7.0，磷酸鹽為磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二 氫鉀中的一種或多種。
本發(fā)明經(jīng)化學(xué)及離子束復(fù)合誘變后篩選獲得一株富馬酸的高產(chǎn)菌ME-Fll，保存編號 為CCTCC M 207066，該菌株具有以下特性
(1) 菌落形態(tài)將i /2feopw;y ory加e CCTCC M 207066接種于PDA培養(yǎng)基，35。C培養(yǎng)， 初時有毛絨狀菌絲長出，然后迅速向四周蔓延，生長旺盛時氣生菌絲的高度可達lcm左 右，呈毛發(fā)狀。菌落初期為白色，后變?yōu)榛液稚蚧液谏?，老熟后菌絲叢中密布黑色孢子。
(2) 菌體形態(tài)將^/zo/nwo^加e CCTCC M 207066置于光學(xué)顯微鏡下觀察，菌絲 呈匍匐枝狀，假根發(fā)達，分枝呈指狀或根狀，呈褐色。孢囊梗直立或稍彎曲，2~4株成束， 與假根對生，有時膨大或分枝，呈褐色，長210~2500pm，直徑5~18|^m。囊軸呈球形或 橢圓形，呈淡褐色，直徑30 20(^m，囊托呈楔形。孢子囊呈球形或近球形，老熟后呈黑 色，直徑60 250pm。孢囊孢子呈橢圓形或球形，直徑5 8pm。有厚垣孢子，其形狀、大 小不一致，未見接合孢子。
(3) 底物i /j/z叩MW7zaeCCTCCM 207066可以利用葡萄糖、蔗糖、木糖、淀粉、 甘油、果糖、甘露糖等作為底物。
(4) 代謝產(chǎn)物i /2/z印^wj加eCCTCCM 207066的主要代謝產(chǎn)物為富馬酸，同時 還產(chǎn)生少量的乳酸、蘋果酸及乙醇等。
分析方法
高效液相色譜法DIONEX HPLC P680工作站；AUtech有機酸色譜柱No. 88645 column 250mmx4.6mm;紫外檢測波長210nm;流速lmL/rain;進樣量20)iL;流動相 25mmoI/LKH2P04， pH2.5;柱溫室溫。
本發(fā)明提出了一種富馬酸高產(chǎn)菌i /2/zo/w;y CCTCC M 207066，該菌株營養(yǎng)需求
簡單，應(yīng)用該菌經(jīng)液體深層發(fā)酵可生產(chǎn)富馬酸，富馬酸濃度達到90~120g/L，富馬酸產(chǎn)量 占總酸產(chǎn)量的90 95%，具備優(yōu)異的工業(yè)化生產(chǎn)前景。
具體實施方式
實施例l:復(fù)合誘變
(1) 將按常規(guī)方法從森林樹下土壤篩選出的具有富馬酸生產(chǎn)能力的米根霉接種于固
體培養(yǎng)基1 (酵母浸出汁3 g/L，麥芽浸出汁3 g/L，蛋白胨3g/L，甘油20 g/L，瓊脂20g/L)， 35'C培養(yǎng)5天，待孢子成熟后，用pH6.0、 0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫孢子，接于已經(jīng) 滅菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，35'C、 130rpm充分搖動20min，使孢子均勻分散，用滅 過菌的脫脂棉過濾，濾液即為孢子懸浮液l，調(diào)整孢子濃度為106個/1111備用。
(2) 將20ml上述孢子懸浮液1以1: 1 (體積比)的比例與已滅菌的液體培養(yǎng)基1 (酵母浸出汁3g/L，麥芽浸出汁3g/L，蛋白胨3g/L，甘油20g/L)，混合后裝入250ml
三角瓶中，置于35。C、 150rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)2h，離心洗滌收集孢子，然后用20ml pH6.0、 O.lmol/L的磷酸鹽緩沖溶液稀釋制得孢子懸浮液2。
(3) 將前面收獲的孢子懸浮液2，按照9: 1的體積比與lg/L的亞硝基胍溶液混合， 35°C， 180rpm振蕩處理30min。然后在離心機中10000rpm離心15min,棄去上清液，用 pH6.0、 O.lmol/L的磷酸鹽緩沖溶液洗孢子三次，然后加入與化學(xué)誘變處理前等量的磷酸 鹽緩沖溶液得孢子懸浮液3。
(4) 取0.1ml上述孢子懸浮液3，均勻涂布于無菌空白培養(yǎng)皿中，在無菌條件下室 溫風(fēng)干。然后將這些含孢子培養(yǎng)皿放入離子注入機內(nèi)，靶室抽真空至l(T3Pa，選用15keV 氮離子，2.4xl013ions/cm2'S劑量率，2.4xl015ions/cm2劑量對這些孢子進行注入處理。然 后取出培養(yǎng)皿，以lml無菌水洗脫，調(diào)整孢子濃度為1()S個/ml備用。
實施例2:菌種篩選
(O初篩將經(jīng)過復(fù)合誘變后所得孢子懸浮液涂布接種于固體培養(yǎng)基2 (在PDA培 養(yǎng)基中添加溴甲酚綠和脫氧膽酸鈉，使其濃度分別為0.1g/L和1.0g/L)，米根霉生長過程 中產(chǎn)生的富馬酸可以使菌落周圍的培養(yǎng)基出現(xiàn)黃色的變色圈。通過測量變色圈直徑與菌落 直徑，計算二者比值，選取比值較大的菌株保藏，進行第二次初篩。
將第一次初篩得到的黃色變色圈較大的培養(yǎng)基，用平板挖井法移入固體培養(yǎng)基3 (KMn042g/L, KBr2.5g/L，瓊脂20g/L)進行第二次初篩。培養(yǎng)24小時后，菌株生長產(chǎn) 生的富馬酸會分泌到固體培養(yǎng)基3中，產(chǎn)生特異性變色圈，同樣測量變色圈直徑與菌落直 徑，計算二者比值，選取比值較大的菌株保藏，進行復(fù)篩。
(2)復(fù)篩將初篩得到的菌株接種于固體培養(yǎng)基1 (酵母浸出汁3.0g/L，麥芽浸出
汁3.0g/L，蛋白胨3.0g/L，甘油20g/L，瓊脂20g/L), 35'C培養(yǎng)5天后，用無菌水洗脫 孢子，接于已經(jīng)滅菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，35°C、 130rpm充分搖動20min，使孢子 均勻分散，用滅過菌的脫脂棉過濾，濾液即為孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)后，調(diào)整孢 子濃度為1()S個/ml備用。
將上述孢子懸浮液涂布接種于固體培養(yǎng)基4( 丁二酸30g/L，尿素2g/L， KH2P04 1 .Og/L， MgS04.7H20 0.5 g/L， MnS04.H20 0.05g/L， CuS04.5H20 0.006g/L，瓊脂20g/L)， 35。C培
養(yǎng)36小時后，挑出比原始對照菌株生長明顯緩慢的突變株保藏，進行第二次復(fù)篩；將上
述突變株接種于固體培養(yǎng)基5 (葡萄糖300g/L，尿素5g/L， KH2PO41.0g/L， MgS04.7H20 0.5g/L， MnS04.H20 0.05g/L， CuS04.5H20 0.006g/L, CaC03 150g/L，瓊脂20g/L)，將能 夠在高葡萄糖濃度平板上迅速生長的菌株，轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基6(葡萄糖50g/L，尿素2 g/L， KH2PO41.0g/L， MgS04.7H20 0.5g/L， MnS04.H20 0.05g/L， CuS04.5H20 0.006g/L，富馬 酸15g/L，瓊脂20g/L)，挑選出能夠繼續(xù)在高富馬酸濃度平板上生長的正突變菌株保藏， 進行第三次復(fù)篩；將上述正突變菌株接種于固體培養(yǎng)基7 (尿素3 g/L， KH2PO41.0g/L， MgS04.7H20 0.5g/L， MnS04.H20 0.05g/L， CuS04.5H20 0.006g/L，富馬酸10g/L，瓊脂 20g/L)，篩選出不分解利用富馬酸做為碳源的菌株保藏，進行再篩。
(3) 再篩將復(fù)篩得到的菌株接種于固體培養(yǎng)基1 (酵母浸出汁3.0g/L，麥芽浸出 汁3.0g/L，蛋白胨3.0g/L，甘油20g/L，瓊脂20g/L)， 35'C培養(yǎng)5天后，用無菌水洗脫 孢子，接于已經(jīng)滅菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，35°C、 130rpm充分搖動20min，使孢子 均勻分散，用滅過菌的脫脂棉過濾，濾液即為孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)后，調(diào)整孢 子濃度為1()S個/ml備用；
將上述孢子懸浮液以3%的接種量接種于液體培養(yǎng)基2 (葡萄糖50g/L，尿素2g/L， KH2PO41.0g/L， MgS04.7H20 0.5g/L， MnS04.H20 0.05g/L， CuS04.5H20 0.006g/L， pH3.0)， 置于轉(zhuǎn)速為220rpm的搖床上，35'C培養(yǎng)48小時后，將所得種子以15%的接種量接種于 液體培養(yǎng)基3 (葡萄糖120g/L，尿素lg/L， CaC03 80g/L, KH2P04 0.6g/L， MgS04.7H20 0.5g/L， ZnS04.7H20 0.02g/L， FeS04,7H20 0.01 g/L， pH5.5)，置于35。C、轉(zhuǎn)速為150rpm 的搖床上發(fā)酵培養(yǎng)72小時后，發(fā)酵液中富馬酸濃度達到60g/L以上為復(fù)篩指標(biāo)。
(4) 按照上述篩選程序得到的菌株為能耐受高底物濃度及高產(chǎn)物濃度的富馬酸高產(chǎn) 菌株ME-Fll，根據(jù)本實驗室鑒定，ME-F11是米根霉(i / /zo/7Mo^yzae)，已于2007年5 月14 R保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保存編號為CCTCCM 207066。
實施例3:搖瓶發(fā)酵
(1) 將誘變篩選獲得的富馬酸高產(chǎn)菌株接種于斜面培養(yǎng)基(酵母浸出汁3 g/L,麥 芽浸出汁3g/L，蛋白胨3g/L,甘油20g/L,瓊脂20g/L)，按照實施例2 (2)所述的培養(yǎng) 方法制備濃度為1(^個/ml的孢子懸浮液備用。
(2) 將上述孢子懸浮液以3%的接種量接入經(jīng)過121'C滅菌20min并冷卻后的種子 培養(yǎng)基(葡萄糖50g/L,尿素2 g/L， KH2P04 LOg/L， MgS04.7H20 0,5g/L， MnS04.H20 0.05g/L， CuS04.5H20 0.006g/L， pH3.0)，置于轉(zhuǎn)速為220rpm的搖床上，35'C培養(yǎng)48小 時后得種子液。
(3) 將上述種子液以15%的接種量接入經(jīng)過12rC滅菌20min并冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng) 基(葡萄糖120g/L，尿素lg/L， CaC03 80g/L， KH2P04 0.6g/L， MgS04.7H20 0.5g/L， ZnS04.7H20 0.02g/L， FeS04.7H20 0.01 g/L),置于35。C、轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上發(fā)酵培 養(yǎng)72小時，檢測發(fā)酵液中富馬酸濃度為108g/L,占總酸產(chǎn)量的95%。
實施例4: 5L罐發(fā)酵
按照實施例3的方法培養(yǎng)種子液，將種子液以10X的接種量接入已滅菌的裝有3L發(fā) 酵培養(yǎng)基(葡萄糖150g/L，尿素lg/L， KH2P04 0.6g/L， MgS04.7H20 0.5g/L， ZnS04.7H20 0.02g/L， FeS04.7H20 0.01 g/L)的5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵過程中用10g/L的NaHC03控制發(fā) 酵液pH值為5.5，于35'C、 0.7vvm的通氣比率、180rpm的攪拌轉(zhuǎn)速下發(fā)酵培養(yǎng)84小時， 檢測發(fā)酵液中富馬酸濃度為120g/L，占總酸產(chǎn)量的90%。
權(quán)利要求
1、一種富馬酸產(chǎn)生菌，其分類命名為米根霉(Rhizopus Oryzae)ME-F11，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM 207066。
2、 權(quán)利要求1所述的富馬酸產(chǎn)生菌的誘變篩選方法，其特征在于將具有富馬酸生產(chǎn) 能力的米根霉經(jīng)化學(xué)和離子束復(fù)合誘變后再次篩選獲得富馬酸產(chǎn)生菌米根霉(/ /^op^ Or戸e) ME-Fll。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的化學(xué)和離子束復(fù)合誘變由以下步驟組成(1) 配制培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基l:酵母浸出汁1.0~5.0g/L，麥芽浸出汁1.0~5.0g/L，蛋白月東1.0 5.0g/L， 甘油10~30g/L;固體培養(yǎng)基h酵母浸出汁1.0~5.0g/L，麥芽浸出汁1.0~5.0g/L,蛋白月東1.0~5.0g/L， 甘油10 30 g/L，瓊脂20 g/L;(2) 制備孢子懸浮液將具有富馬酸生產(chǎn)能力的米根霉接種于固體培養(yǎng)基1，30~40'C 培養(yǎng)4 6天，待孢子成熟后，用無菌水、生理鹽水、吐溫溶液或磷酸鹽緩沖溶液洗脫孢 子，接于已經(jīng)滅菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，30-40'C及100~150rpm下充分振蕩 20 60min，使孢子均勻分散，用滅過菌的脫脂棉、兩層紗布或兩層擦鏡紙過濾，即制得 孢子懸浮液l，孢子濃度控制在10S l()8個/ml備用；(3) 孢子萌發(fā)培養(yǎng)將孢子懸浮液l以體積比l: 1~1: 5的比例與已滅菌的液體培養(yǎng)基1混合后裝入三角瓶，30 4(TC及120 180rpm下振蕩培養(yǎng)l~2h后離心洗滌收集孢子；(4) 化學(xué)誘變:將收集的孢子用磷酸鹽緩沖溶液稀釋，孢子濃度控制在105~108個/1111，然后將稀釋所得的孢子懸浮液與化學(xué)誘變劑溶液亞硝基胍溶液或硫酸二乙酯溶液混合， 30 40。C及150~250rpm下振蕩處理20 120min;然后在離心機中4000~12000rpm離心 5-20min，棄去上清液，用無菌水、生理鹽水、吐溫溶液或磷酸鹽緩沖溶液洗孢子，然后 再加入無菌水、生理鹽水、吐溫溶液或磷酸鹽緩沖溶液，調(diào)整孢子濃度為105~108個/1111， 得孢子懸浮液2;(5) 離子束誘變?nèi)℃咦討腋∫?，均勻涂布于無菌空白培養(yǎng)皿中，在無菌條件下 室溫風(fēng)干；然后將這些含孢子培養(yǎng)皿放入離子注入機內(nèi)，靶室抽真空至10—2~104Pa，選 用10 30keV氮離子，2xlOl3~4xl014ions/cm2'S劑量率，2xl014~4xl015ions/cm2劑量對這些 孢子進行注入處理；最后取出培養(yǎng)皿，以無菌水洗脫，調(diào)整孢子懸浮液孢子濃度為105~108 個/ml。
4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的篩選由以下步驟組成(1) 配制培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基2:葡萄糖20 50g/L，尿素1.0~5.0g/L， KH2PO40.5~2.0g/L， MgS04.7H20 0.1~1.0g/L, MnSO4.H2O0.02~0.15g/L， CuS04.5H20 0.001-0.0lg/L,通過向培養(yǎng)基中添加 H2S04、 HCl、 CaC03、 Ca(OH)2、 NaOH、 NaHC03、 Na2C03或NH3.H20中的一種或幾種 控制pH為2.0 6.0;液體培養(yǎng)基3:葡萄糖120~200g/L，尿素0.5~2.0g/L， KH2PO40.1~1.0g/L， MgS04.7H20 0.1~1.0g/L， ZnS04.7H20 0.01~0,lg/L， FeS04.7H20 0.01~0.1g/L，通過向培養(yǎng)基中添加 H2S04、 HCl、 CaC03、 Ca(OH)2、 NaOH、 NaHC03、 Na2C03或NH3.H20中的一種或幾種 控制pH為2.0 6.0;固體培養(yǎng)基2:在PDA培養(yǎng)基中添加溴甲酚綠和脫氧膽酸鈉，使其濃度分別為 0.1 0.2g/L禾口 1.0~2.0g/L;固體培養(yǎng)基3: KMnO41.0~5.0g/L， KBr 1.0~5.0g/L，瓊脂20g/L;固體培養(yǎng)基4: 丁二酸30 60g/L，尿素1.0~5.0g/L， KH2PO40.5~2.0g/L， MgS04.7H20 0.1~1.0g/L， MnSO4.H2O0.02~0.15g/L， CuS04.5H20 0.001~0.01g/L，瓊脂20g/L;固體培養(yǎng)基5:葡萄糖200~300g/L，尿素1.0~5.0g/L， KH2P04 0.5 2.0g/L， MgS04.7H20 0.1~1.0g/L， MnSO4.H2O0.02~0.15g/L， CuS04.5H20 0.001~0.01g/L， CaC03 100-150g/L， 瓊脂20g/L;固體培養(yǎng)基6:葡萄糖20 50g/L，尿素1.0 5.0g/L， KH2PO40.5~2.0g/L， MgS04.7H20 0.1~1.0g/L， MnSO4.H2O0.02~0.15g/L， CuS04.5H20 0.001 ~0.01g/L，富馬酸10~20g/L，瓊 脂20g/L;固體培養(yǎng)基7:尿素1.0~5.0g/L， KH2P04 0.5~2.0g/L， MgS04.7H20 0.1 1.0g/L， MnSO4.H2O0.02~0.15g/L， CuS04.5H20 0.001~0.01g/L，富馬酸10~20g/L，瓊脂20g/L;(2) 初篩將經(jīng)過復(fù)合誘變后所得孢子懸浮液涂布接種于固體培養(yǎng)基2上，米根霉生長過程中產(chǎn)生的富馬酸可以使菌落周圍的培養(yǎng)基出現(xiàn)黃色的變色圈，通過測量變色圈直徑與菌落直徑，計算二者比值，選取比值較大的菌株保藏，進行第二次初篩；將第一次初篩得到的黃色變色圈較大的培養(yǎng)基，用平板挖井法移入固體培養(yǎng)基3上進 行第二次初篩；培養(yǎng)24小時后，菌株生長產(chǎn)生的富馬酸會分泌到固體培養(yǎng)基3中，產(chǎn)生 特異性變色圈，同樣測量變色圈直徑與菌落直徑，計算二者比值，選取比值較大的菌株保 藏，進行復(fù)篩；(3) 復(fù)篩將初篩得到的菌株接種于固體培養(yǎng)基1上，按照權(quán)利要求3 (2)所述方 法制備孢子懸浮液，然后將上述孢子懸浮液涂布接種于固體培養(yǎng)基4上，30 4(TC培養(yǎng) 24~48小時后，挑出比原始對照菌株生長明顯緩慢的突變株保藏，進行第二次復(fù)篩；將上 述突變株接種于固體培養(yǎng)基5上，將能夠在高葡萄糖濃度平板上迅速生長的菌株，轉(zhuǎn)接到 固體培養(yǎng)基6上，挑選出能夠繼續(xù)在高富馬酸濃度平板上生長的正突變菌株保藏，進行第 三次復(fù)篩；將上述正突變菌株接種于固體培養(yǎng)基7上，篩選出不分解利用富馬酸做為碳源 的菌株保藏，進行再篩；(4) 再篩將復(fù)篩得到的菌株接種于固體培養(yǎng)基1上，按照權(quán)利要求3 (2)所述方 法制備孢子懸浮液，按照1%~5%的接種量將上述孢子懸浮液接種于液體培養(yǎng)基2中進行 種子培養(yǎng)，30 40'C培養(yǎng)24 48小時后，將所得種子按照10%~30%的接種量接種于液體 培養(yǎng)基3中進行發(fā)酵培養(yǎng)，最終發(fā)酵所得富馬酸濃度達到60g/L以上為再篩指標(biāo)；(5) 經(jīng)過初篩、復(fù)篩及再篩三級篩選程序，篩選得到復(fù)合誘變后的能耐受高底物濃 度及高產(chǎn)物濃度的富馬酸高產(chǎn)菌株。
5、 一種利用權(quán)利要求1所述的富馬酸產(chǎn)生菌發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的方法，其特征在于該 方法由以下歩驟組成(1) 培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基為能提供碳源、氮源及無機鹽的固體培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基為pH2.0~6.0的能提供碳源、氮源及無機鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基為pH2.(K6.0的能提供碳源、有限氮源及無機鹽的限氮液體培養(yǎng)基；(2) 斜面培養(yǎng)將權(quán)利要求1所述的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，在常規(guī)培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，溫度30 40。C，培養(yǎng)4 6天，待孢子成熟后用無菌水、生理鹽水、吐溫溶液或磷酸鹽 緩沖溶液洗脫孢子，接于已經(jīng)滅菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，30 40'C及100~150rpm下 充分振蕩20 60min,使孢子均勻分散，用滅過菌的脫脂棉、兩層紗布或兩層擦鏡紙過濾，制得孢子懸浮液用于種子培養(yǎng)或菌株保藏；(3) 種子培養(yǎng)裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶在115 121'C的高溫下滅菌15 30min，冷卻 后按照1%~5%的接種量接入孢子懸浮液，置于溫度為30 4(TC、轉(zhuǎn)速為150 250rpm的 搖床上，培養(yǎng)36~60小時后的菌株用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種；(4) 發(fā)酵培養(yǎng) 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶在115 121'C的高溫下滅菌15 30min，冷卻 后按照10~30%的接種量接入經(jīng)過種子培養(yǎng)的菌株，置于溫度為30~40°C、轉(zhuǎn)速為 150 250rpm的搖床上，發(fā)酵培養(yǎng)60~96小時后，分離提取富馬酸；發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐在115 12rC的高溫下滅菌15 30min， 冷卻后按照5~20%的接種量接入經(jīng)過種子培養(yǎng)的菌株，溫度為30~40°C，通氣比率為 0.5 1.5wm,攪拌轉(zhuǎn)速150 300rpm，發(fā)酵過程中采用碳酸鹽、碳酸氫鹽、氫氧化物、氨 水、無機酸或有機酸控制pH2.0 6.0，發(fā)酵培養(yǎng)60 96小時后，分離提取富馬酸。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖、蔗糖、木糖、 淀粉、甘露糖、果糖或甘油中的一種或多種；氮源為尿素、蛋白胨、牛肉膏、麥芽浸出汁、 酵母浸出汁、玉米漿、硫酸銨、氯化銨或硝酸銨中的一種或多種；無機鹽為磷酸二氫鉀、 硫酸鎂、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸亞鐵、氯化鈣或氯化鈷中的一種或多種。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于培養(yǎng)基中，斜面培養(yǎng)基為酵母浸出汁1.0~5.0g/L，麥芽浸出汁1.0~5.0g/L，蛋白胨1.0~5.0g/L, 甘油10~30 g/L， 20 g/L的瓊脂；種子培養(yǎng)基為葡萄糖20 50g/L，尿素1.0~5.0g/L, KH2PO40.5~2.0g/L， MgS04.7H20 0.1~1.0g/L， MnSO4.H2O0.02~0.15g/L， CuS04.5H20 0.001~0.01g/L，通過向培養(yǎng)基中添加 H2S04、 HCl、 CaC03、 Ca(OH)2、 NaOH、 NaHC03、 Na2C03或NH3.H20中的一種或幾種 控制pH為2.0-6.0;發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖120 200g/L，尿素0.5~2.0g/L，KH2PO40.1~1.0g/L'MgSO4.7H2O 0.1~1.0g/L， ZnS04.7H20 0.01~0.1g/L， FeS04.7H20 0.01~0.1g/L，通過向培養(yǎng)基中添加 H2S04、 HCl、 CaC03、 Ca(OH)2、 NaOH、 NaHC03、 Na2C03或NH3.H20中的一種或幾種 控制pH為2.0-6.0。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在發(fā)酵終止時富馬酸濃度為90~120g/L，富 馬酸產(chǎn)量占總酸產(chǎn)量的卯~95%。
9、 根據(jù)權(quán)利要求3、 4或5中任一所述的方法，其特征在于吐溫溶液的濃度為0.1-1.0 g/L，磷酸鹽緩沖溶液的濃度為O.05~0.5mol/L， pH為5.0 7.0，磷酸鹽為磷酸氫二鈉、磷 酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀中的一種或多種。
10、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(4)中亞硝基胍溶液的濃度為 1.0~2.0g/L，硫酸二乙酯溶液的濃度為100~150g/L，化學(xué)誘變劑溶液與孢子懸浮液的體積 比為1: 5~1: 9。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種富馬酸產(chǎn)生菌及其誘變篩選方法和利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的方法。該菌株分類命名為米根霉(Rhizopus Oryzae)ME-F11，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM 207066。本發(fā)明的菌種營養(yǎng)需求簡單，應(yīng)用該菌經(jīng)液體深層發(fā)酵可生產(chǎn)富馬酸，富馬酸濃度達到90～120g/L，富馬酸產(chǎn)量占總酸產(chǎn)量的90～95％，具備優(yōu)異的工業(yè)化生產(chǎn)前景。
文檔編號C12P7/46GK101100645SQ20071002450
公開日2008年1月9日 申請日期2007年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月20日
發(fā)明者付永前, 寧 劉, 昆 張, 晴 徐, 霜 李, 萍 韋, 振 高, 和 黃 申請人:南京工業(yè)大學(xué)