重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系、其構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。作為本發(fā)明技術(shù)方案的典型實(shí)施方案之一，其可以包括：利用蛋白質(zhì)體外剪切系統(tǒng)，在特定位點(diǎn)斷開鱟C因子中能與內(nèi)毒素結(jié)合的功能片段，分別連接到斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N端片段(IN)和C端片段(IC)在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化，復(fù)性以及內(nèi)毒素去除后，體外誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)內(nèi)含子發(fā)生剪切，得到C因子中CES12片段，即，具有內(nèi)毒素結(jié)合活性的重組Sushi多肽。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)鱟C因子中具有內(nèi)毒素結(jié)合活性的功能片段的快速、大量以及低成本表達(dá)，并可有效避免宿主細(xì)胞中所含LPS的影響，有利于低成本內(nèi)毒素檢測(cè)試劑的規(guī)模化生產(chǎn)和應(yīng)用。
【專利說明】重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系、其構(gòu)建方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組多肽，尤其涉及一種重組Sushi多肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外層上特有的結(jié)構(gòu)，其化學(xué)成分為脂多糖(LPS)。細(xì)菌內(nèi)毒素可引起人體發(fā)熱、休克甚至死亡，但它又普遍存在且不易滅活，因而在制藥和醫(yī)療器械制造中內(nèi)毒素檢測(cè)尤為重要。此外，內(nèi)毒素檢測(cè)也可以用于臨床上相關(guān)疾病的診斷和預(yù)防。
[0003]鱉試劑是國(guó)際上至今為止檢測(cè)內(nèi)毒素最常用的試劑，然而鱟數(shù)量有限以及鱟試劑批次間不均一性等局限性，迫切需要開發(fā)鱟試劑的替代品。研究表明，鱟C因子(FactorC)是鱟試劑中對(duì)內(nèi)毒素具有高親和力的絲氨酸蛋白酶原，且其N端的3個(gè)Sushi結(jié)構(gòu)域是LPS的主要結(jié)合部位。Ding利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組Factor C用于內(nèi)毒素檢測(cè)，并合成Sushi3區(qū)域中與LPS結(jié)合的34個(gè)氨基酸的多肽，可用于內(nèi)毒素中和與檢測(cè)。王東寧等利用大腸桿菌表達(dá)了 Factor C，并證實(shí)重組蛋白對(duì)LPS有中和活性。盡管大腸桿菌表達(dá)重組蛋白具有快速、大量以及低成本等優(yōu)點(diǎn)，但是由于大腸桿菌中含有LPS，嚴(yán)重限制了該種重組蛋白的大批量生產(chǎn)與應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系、其構(gòu)建方法及其在制備重組Sushi多肽中的應(yīng)用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的.，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
[0006]一種重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系，包含分別與斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N端片段和C端片段連接的第一基因和第二基因，其中，所述第一基因和第二基因由用于編碼鱟C因子中能與內(nèi)毒素結(jié)合的功能片段的基因在選定位點(diǎn)斷裂而形成。
[0007]作為較為優(yōu)選的實(shí)施方案之一，所述用于編碼鱟C因子中能與內(nèi)毒素結(jié)合的功能片段的基因包括用于編碼sushil和/或sushi3區(qū)域的基因。
[0008]進(jìn)一步的，所述選定位點(diǎn)可選自對(duì)應(yīng)于鱟C因子序列的第492和第493個(gè)核苷酸之間的位置。
[0009]如上所述重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系的構(gòu)建方法，包括:
[0010](I)提供第一選定載體，并將鱟C因子中能與內(nèi)毒素結(jié)合的功能片段的基因序列克隆到所述第一選定載體上，再將斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子插入所述基因序列的選定位點(diǎn)，獲得第一質(zhì)粒；
[0011](2)以第一質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR獲得N片段，以及，Pst I和Nde I分步酶切第一質(zhì)粒，獲得C片段；
[0012](3)另取第一選定載體，并將所述N片段和所述C片段分別克隆到第一選定載體上，而后Pst I和Nde I雙酶切分別連接到第二選定載體上，得到兩種目標(biāo)表達(dá)質(zhì)粒。[0013]其中，所述第一選定載體包括PTA2載體，所述第二選定載體包括pTWINl載體，但均不限于此。
[0014]作為較佳的應(yīng)用方案之一，該構(gòu)建方法可以具體包括:
[0015](I)將鱟C因子的CES12的編碼基因序列TA克隆到PTA2載體上；
[0016]將斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子插入所述CES12的編碼基因序列的選定位點(diǎn)，得到質(zhì)粒PTA2/his-DnaX-CESI2；
[0017](2)以所述質(zhì)粒pTA2/his-DnaX_CES12作為模板，經(jīng)PCR得到N端片段，以及，PstI和Nde I分步酶切pTA2/hi s-DnaX-CES 12獲得C端片段；
[0018](3)將N、C端片段分別經(jīng)TA克隆到PTA2載體，并Pst I和Nde I雙酶切分別連接到pTWINl載體上，獲得目標(biāo)表達(dá)質(zhì)粒pTWINl/his-DnaX-CES12-N和pTWINl/his-DnaX-CESI2-Cο
[0019]如上所述重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系在制備重組Sushi多肽中的應(yīng)用。
[0020]一種宿主細(xì)胞，包含如上所述的重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系。
[0021]一種重組Sushi多肽的制備方法，包括:將如上所述重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系于宿主細(xì)胞中進(jìn)行融合表達(dá)，獲得N端前體蛋白和C端前體蛋白，而后依次經(jīng)純化和去內(nèi)毒素后，再誘導(dǎo)斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接反應(yīng)，獲得具有LPS中和活性的目標(biāo)產(chǎn)物。
[0022]作為較佳的應(yīng)用方案之一，所述N端前體蛋白包含鱟C因子的CES12的N端部分和Ssp DnaX的N端部分及與其直接相連的His6組氨酸標(biāo)簽,所述C端前體蛋白包含SspDnaX的C端部分及與其直接相連的His6標(biāo)簽和CES12的C端部分。
[0023]本發(fā)明系采用了 蛋白質(zhì)反式剪接技術(shù)而實(shí)現(xiàn)的，S卩，利用斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子N端片段(IN)和C端片段(IC)的相互識(shí)別和結(jié)合，在IN和IC緊密結(jié)合的狀態(tài)下，使斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子正確折疊而重建活性中心，釋放斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，連接蛋白質(zhì)外顯子，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)將一個(gè)蛋白質(zhì)分兩段表達(dá)后再剪接起來形成完整的蛋白質(zhì)。
[0024]作為本發(fā)明的一個(gè)典型實(shí)施方案之一,可以通過Overlap extension PCR技術(shù)在特定位點(diǎn)斷開CES12基因(鱟C因子的Cys-rich、EGF-1ike和SushiU Sushi2區(qū))，并分別連接到斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp DnaX的N端片段(IN)和C端片段(IC)進(jìn)行融合表達(dá)、純化和去內(nèi)毒素后，誘導(dǎo)內(nèi)含子剪接反應(yīng)，得到了有LPS中和活性的目標(biāo)蛋白。
[0025]需要指出的是，前述斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子可選自但不限于Ssp DnaX等。
[0026]前述鱟C因子可來源于美洲鱟、東方鱟、南方鱟或圓尾鱟等。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)至少在于:能夠?qū)崿F(xiàn)鱟C因子中具有內(nèi)毒素結(jié)合活性的功能片段(重組Sushi蛋白)的快速、大量以及低成本表達(dá)，并可有效避免宿主細(xì)胞中所含LPS的影響，有利于低成本內(nèi)毒素檢測(cè)試劑的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1是本發(fā)明一較佳實(shí)施方案中鱟C因子功能片段CES12的反式剪接合成流程圖，其中，a為N端如體蛋白，b為C端如體蛋白，c為目標(biāo)蛋白；
[0029]圖 2 是 pTWINl/his-DnaX-CES12-N 和 pTWINl/his-DnaX-CES12_C 構(gòu)建圖；
[0030]圖3是酶切鑒定質(zhì)粒的Agarose Gel電泳圖，其中，1-對(duì)照質(zhì)粒；2_BamHI 酶切 pTA2/his-DnaX-CES12，得到 400bp 的正確條帶；3_Pst I/Nde I 雙酶切pTWINl/his-DnaX-CES12-N 得到 800bp 的正確條帶；4-Pst I/Nde I 雙酶切 pTWINl/hi s-DnaX-CES 12-C 得到 387bp 的正確條帶。
[0031]圖 4 是 Hi s-DnaX-CES 12-N 和 Hi s-DnaX-CES 12-C 融合蛋白的表達(dá)的 SDS-PAGE 圖，其中，1，未誘導(dǎo)菌液沉淀；2，N端蛋白菌液上清(25°C誘導(dǎo))；3，N端蛋白菌液沉淀(25°C誘導(dǎo))；4，N端蛋白菌液上清(37°C誘導(dǎo))；5，N端蛋白菌液沉淀(37°C誘導(dǎo))；6，C端蛋白菌液上清(37°C誘導(dǎo))；7，C端蛋白菌液沉淀(37°C誘導(dǎo))
[0032]圖5是前體蛋白Hi s-DnaX-CES 12-N和His-DnaX-CES12-C及其反式剪接產(chǎn)物的SDS-PAGE 檢測(cè)圖譜(PageRuIer? Plus Prestained Protein Ladder)；
[0033]圖6a是當(dāng)試劑與一定梯度內(nèi)毒素反應(yīng)的突光曲線。Ex = 360nm ；Em = 460nm.內(nèi)毒素含量從左到右依次為:0.05，0.1,0.25,0.5,1,2,5, 1OEU mL-1；
[0034]圖6b是內(nèi)毒素含量對(duì)反應(yīng)時(shí)間的雙對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線.Y=L 2444-0.2270*X ；R2 =0.9977。
【具體實(shí)施方式】
[0035]概括的講，作為本發(fā)明的一個(gè)方面，主要是利用蛋白質(zhì)反式剪切體系表達(dá)鱟C因子的CES12區(qū)域，且剪切得到的蛋白具有內(nèi)毒素結(jié)合活性，能夠?qū)崿F(xiàn)在大腸桿菌系統(tǒng)中低成本地開發(fā)內(nèi)毒素檢測(cè)試劑。
[0036]進(jìn)一步的講，本發(fā)明是利用蛋白質(zhì)反式剪切體系表達(dá)鱟C因子的CES12基因，在該蛋白質(zhì)反式剪切體系的構(gòu)建過程中，選擇的斷裂位點(diǎn)可以是在鱟C因子的Sushil中與內(nèi)毒素結(jié)合的34個(gè)氨基酸區(qū)域，并且，利用該蛋白質(zhì)反式剪切體系分段表達(dá)的兩個(gè)前體蛋白均不具備LPS結(jié)合活性，而剪切后所獲目標(biāo)蛋白CES12具有內(nèi)毒素中和活性。
[0037]作為本發(fā)明的一種較為優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明中蛋白質(zhì)反式剪切體系的建立過程可以包括:根據(jù)Ssp DnaX的剪接活性，選擇在鱟C因子的基因序列492和493核苷酸之間將CES12斷裂成N端和C端兩部分，其中的N端前體蛋白包含鱟C因子功能片段CES12的N端部分(1-492位核苷酸)，Ssp DnaX的N端部分(DnaX-N)以及與之直接相連的His6組氨酸標(biāo)簽(參閱圖1 (a))，而C端前體蛋白包含Ssp DnaX的C端部分(DnaX-C)以及與之直接相連的His6標(biāo)簽和CES12的C端部分(493?723位核苷酸)(參閱圖1 (b))。這兩種前體蛋白都在T7啟動(dòng)子的控制下，分別加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，純化(包涵體需復(fù)性)，在剪接緩沖液中等量混合，借助DnaX-N和DnaX-C之間強(qiáng)的結(jié)合力，釋放DnaX后，CES12的N端和C端部分結(jié)合形成完整的目標(biāo)蛋白(參閱圖1(c))。
[0038]以下結(jié)合一較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。
[0039]本實(shí)施例中所采用的材料及其來源如下:
[0040]大腸桿菌DH5 α和大腸桿菌BL21 (DE3)購自美國(guó)NEB公司；質(zhì)粒載體pTWINl和斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp DnaX來自本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的質(zhì)粒；Taq DNA聚合酶，T4DNA連接酶和各種限制性內(nèi)切酶均購自美國(guó)NEB公司；質(zhì)粒小抽試劑盒和膠回收試劑盒為Qiagen產(chǎn)品；His-binding-resin購自上海Solarbio公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；PCR引物均由上海生工合成。鱟血細(xì)胞，內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒，內(nèi)毒素去除試劑盒由廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司饋贈(zèng)。熒光底物購于美國(guó)sigma公司。
[0041]但需要指出的是，很顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員亦可采用業(yè)界悉知的其他公知途徑獲取和應(yīng)用與上述材料等同的其他材料。
[0042]本實(shí)施例的實(shí)施過程包括:
[0043]1、pTWINl/his-DnaX-CES12-N 和 pTWINl/his-DnaX-CES12_C 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0044]參閱圖2，該步驟是將內(nèi)含子Ssp DnaX插入到質(zhì)粒pTA2CES12中，得到pTA2/his-DnaX-CES12,然后分別通過 PCR 和酶切，構(gòu)建質(zhì)粒 pTA2/his-DnaX-CES12_N 和 pTA2/his-DnaX-CES12-C，最后通過酶切轉(zhuǎn)換到PTWINl表達(dá)載體。
[0045]進(jìn)一步的，該步驟包括:
[0046]以RT-PCR從鱟血細(xì)胞中得到東方鱟C因子的全長(zhǎng)cDNA序列并通過PCR得到CES12的編碼序列(上游引物Primerl和下游引物Primer2)，TA克隆到PTA2載體上。PCR擴(kuò)增斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子片段(上游引物Primer3和下游引物Primer4)。然后用Overlap PCR方法將斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子插入選定位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pTA2/his-DnaX-CES12。以此作為模板，經(jīng)PCR得到N端片段(上游引物Primer5和下游引物Primer6)。PstI和Nde I分步酶切pTA2/his-DnaX-CES12可得C端片段。N、C端片段分別經(jīng)TA克隆到PTA2載體并PstI和Nde I雙酶切分別連接到pTWINl載體上，得到pTWINl/his-DnaX-CES12_N和pTWINl/his-DnaX-CES12-C表達(dá)質(zhì)粒，PCR及酶切鑒定并做進(jìn)一步DNA序列測(cè)定。參閱圖3，酶切結(jié)果顯示構(gòu)建的質(zhì)粒條帶大小正確，測(cè)序證明表達(dá)質(zhì)粒中插入片段核苷酸無突變。
[0047] 2、Hi s-DnaX-CES 12-N 和 His-DnaX-CES12_C 融合蛋白的表達(dá)和純化
[0048]表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌株涂布于含100 μ g/mL Ampicillin的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于5mL含100 μ g/mLAmpicillin的LB液體培養(yǎng)基，37°C，220r/min培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)物以1: 50的比例接種于500mL含100 μ g/mL Ampicillin的新鮮LB液體培養(yǎng)基中37°C，220r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600 = 0.6，加入IPTG至終濃度為0.8mM，37°C，220r/min誘導(dǎo)蛋白表達(dá)3h。
[0049]4°C，5000g離心收集500mL細(xì)菌培養(yǎng)液，用20mL破菌緩沖液(20?50mMTris-HCl，ρΗ7.3-8.3，含0.25Μ?0.5Μ NaCl)重懸沉淀。工作5s，間隔10s，130w*50%超聲破菌15?20min。4°C，5000g離心，分別取少量上清以及沉淀經(jīng)煮沸處理后，用SDS-PAGE電泳分析產(chǎn)物的表達(dá)部位。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，N端前體蛋白集中在包涵體中，C端前體蛋白在上清部分有較高表達(dá)(圖4)。
[0050]包涵體用洗雜緩沖液(1% TritonX-100, ImM EDTA, IM urea)洗三次，再用適量裂解緩沖液(IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris.Cl，8Murea)重懸，留上清。用10倍柱體積破菌緩沖液(20 ?50mM Tris-HCl，ρΗ7.3 ?8.3，含 0.25Μ ?0.5MNaCl，8M urea)平衡純化柱，上樣后，用10倍體積含ImM咪唑的破菌緩沖液洗柱，然后用10?20倍柱體積含20mM咪唑的破菌緩沖液將雜蛋白從純化柱上洗去，最后用4?10倍柱體積含200mM咪唑的破菌緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，純化后的蛋白保存于_20°C。
[0051]3、去除內(nèi)毒素
[0052]按照內(nèi)毒素去除試劑盒說明書操作。加入5mL預(yù)冷再生緩沖液活化樹脂，調(diào)節(jié)流速控制器，保持流速在0.25mL/min (10滴/min),流干后重復(fù)操作兩次。加入6mL預(yù)冷平衡緩沖液，0.5mL/min流干后重復(fù)操作兩次。然后加入樣品,使流速不高于0.25mL/min。待流出液體積達(dá)到1.5mL后，使用無熱原接收管接受樣品。樣品流干后,再加入1.5mL?3.0mL預(yù)冷平衡緩沖液淋洗，合并收集淋洗液。檢測(cè)樣品濃度及內(nèi)毒素水平。[0053]4、包涵體的復(fù)性
[0054]將變性蛋白轉(zhuǎn)移到透析袋(MWC0:7，000,SPECTRUM*,Houston, TX)中，然后依次將透析袋放入含有不同濃度尿素(6M，4M，2M，1M)的復(fù)性緩沖液(20mM Tris-HCl，150mMNaCl，ImM EDTA, PH7.4?8)中，分別放置在攪拌器上透析lh，最后將透析袋轉(zhuǎn)移到完全不含尿素的復(fù)性緩沖液(含2mMDTT)中。參閱圖5，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、His-bingding-resin純化、透析復(fù)性，所獲得的N端(泳道I)和C端前體蛋白(泳道2)的電泳純度能達(dá)到90%以上。并且，SDS-PAGE所顯示的N端和C端前體蛋白的表觀分子量分別為30kDa和14.4kDa，與根據(jù)基因序列所推測(cè)的分子量是一致的。
[0055]5、體外剪接
[0056]純化且復(fù)性的前體蛋白按摩爾比1:1混合裝入透析袋中，置入剪接緩沖液(20mMTris-HCl, 150mM NaCl,lmM DTT，PH7.0)中，室溫密封過夜反應(yīng)，SDS-PAGE分析剪切結(jié)果，參閱圖5 (泳道4)，可以看到產(chǎn)生了 26.6kD處目的蛋白。
[0057]6、剪接產(chǎn)物體外活性測(cè)定
[0058]利用動(dòng)態(tài)熒光法檢測(cè)內(nèi)毒素含量變化來定性檢測(cè)剪接產(chǎn)物的體外活性。
[0059]用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制0.05,0.1,0.25,0.5、1、2、5、10EU/mL的內(nèi)毒素溶液，并準(zhǔn)備好鱟試劑，熒光底物。利用動(dòng)態(tài)熒光法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖6)，并測(cè)定剪接產(chǎn)物內(nèi)毒素含量，結(jié)果顯示低于0.lEU/mL。
[0060]參閱表2，測(cè)定剪切產(chǎn)物對(duì)LPS的結(jié)合活性。向A-H孔中分別加入表中相應(yīng)濃度的蛋白(N端前體蛋白，C端前體蛋白，剪接產(chǎn)物或BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白)和內(nèi)毒素，在37°C恒溫箱孵育30min后,加入100 μ I鱟試劑及10 μ I熒光底物,用內(nèi)毒素檢查用水補(bǔ)足總體積至200 μ I。其中，H孔先將內(nèi)毒素與剪接產(chǎn)物在37 °C恒溫箱孵育30min后，接著調(diào)節(jié)PH至5.0，并加入終濃度為萬分之五的胃蛋白酶，37°C消化反應(yīng)30min，PH值調(diào)回7?8，利用動(dòng)態(tài)熒光法檢測(cè)內(nèi)毒素含量。
[0061]抑制試驗(yàn):以2EU/mL標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素為基準(zhǔn)，加入剪接產(chǎn)物(對(duì)照為N端前體蛋白，C端前體蛋白，BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白)與內(nèi)毒素結(jié)合反應(yīng)后，利用動(dòng)態(tài)熒光法測(cè)定內(nèi)毒素含量變化。
[0062]抑制-釋放試驗(yàn):基于上述抑制試驗(yàn)，利用胃蛋白酶的酶消化作用，將發(fā)生抑制試驗(yàn)的剪接產(chǎn)物從內(nèi)毒素上消化下來，使內(nèi)毒素重新釋放，利用動(dòng)態(tài)熒光法測(cè)定內(nèi)毒素含量變化。
[0063]由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)得的N端前體蛋白含內(nèi)毒素的量為0.14EU/mL, C端前體蛋白含內(nèi)毒素的量為0.10EU/mL ;剪接產(chǎn)物含內(nèi)毒素的量為0.20EU/mL.分別以N端前體蛋白，C端前體蛋白和BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白為對(duì)照，2EU/mL內(nèi)毒素與剪接產(chǎn)物作用結(jié)合后，含量下降至0.73EU/mL，而對(duì)照組基本沒有變化(分別為1.92，1.95，2.03EU/mL)說明此剪接產(chǎn)物可結(jié)合內(nèi)毒素，后經(jīng)胃蛋白酶消化釋放后內(nèi)毒素含量可回復(fù)至3.64EU/mL，推測(cè)在剪接過程中不可避免地引入了少量?jī)?nèi)毒素，故而酶消化之后測(cè)得的內(nèi)毒素高于2EU。
[0064]需要指出的是，以上所述僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉該技術(shù)的人在本發(fā)明所揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
[0065]表I引物序列
【權(quán)利要求】
1.一種重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系，其特征在于，包含分別與斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N端片段和C端片段連接的第一基因和第二基因，其中，所述第一基因和第二基因由鱟C因子中能與內(nèi)毒素結(jié)合的功能片段的編碼基因序列在選定位點(diǎn)斷裂而形成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系，其特征在于，所述用于編碼鱟C因子中能與內(nèi)毒素結(jié)合的功能片段的基因包括用于編碼sushil和/或sushi3區(qū)域的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系，其特征在于，所述選定位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于鱟C因子第492和第493核苷酸之間的位置。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括: (1)提供第一選定載體，并將鱟C因子中能與內(nèi)毒素結(jié)合的功能片段的基因序列克隆到所述第一選定載體上，再將斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子插入所述基因序列的選定位點(diǎn)，獲得第一質(zhì)粒; (2)以第一質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR獲得N片段，以及，PstI和Nde I分步酶切第一質(zhì)粒，獲得C片段； (3)另取第一選定載體，并將所述N片段和所述C片段分別克隆到第一選定載體上，而后Pst I和Nde I雙酶切分別連接到第二選定載體上，得到兩種目標(biāo)表達(dá)質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)質(zhì)粒體系的構(gòu)建方法,其特征在于，所述第一選定載體包括PTA2載體，所述第二選定載體包括pTWINl載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)質(zhì)粒體系的構(gòu)建方法，其特征在于，具體包括: (1)將鱟C因子的CES12的編碼基因序列TA克隆到PTA2載體上； 將斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子插入所述CES12的編碼基因序列的選定位點(diǎn)，得到質(zhì)粒PTA2/his-DnaX-CESI2； (2)以所述質(zhì)粒pTA2/his-DnaX-CES 12作為模板，經(jīng)PCR得到N端片段，以及，Pst I和Nde I分步酶切pTA2/his-DnaX-CES12獲得C端片段； (3)將N、C端片段分別經(jīng)TA克隆到PTA2載體，并PstI和Nde I雙酶切分別連接到pTWINl載體上，獲得目標(biāo)表達(dá)質(zhì)粒pTWINl/his-DnaX-CES12-N和pTWINl/his-DnaX-CESI2-Cο
7.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系在制備重組Sushi多肽中的應(yīng)用。
8.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系。
9.一種重組Sushi多肽的制備方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述重組Sushi多肽的表達(dá)質(zhì)粒體系于宿主細(xì)胞中進(jìn)行融合表達(dá)，獲得N端前體蛋白和C端前體蛋白，而后依次經(jīng)純化和去內(nèi)毒素后，再誘導(dǎo)斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接反應(yīng)，獲得具有LPS中和活性的目標(biāo)產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述重組Sushi多肽的制備方法，其特征在于， 所述N端前體蛋白包含鱟C因子的CES12的N端部分和Ssp DnaX的N端部分及與其直接相連的His6組氨酸標(biāo)簽，所述C端前體蛋白包含Ssp DnaX的C端部分及與其直接相連的His6標(biāo)簽和CE S12的C端部分。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103436549SQ201310115293
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月3日
【發(fā)明者】張春, 王影影, 齊興梅, 劉濤, 祁靜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所