專(zhuān)利名稱(chēng)：一種雙基因表達(dá)質(zhì)粒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種同時(shí)獨(dú)立表達(dá)兩種外源目的基因的雙基因表 達(dá)質(zhì)粒及其用途。
背景技術(shù)：
質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì) 胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子。現(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專(zhuān)指細(xì)菌、酵母菌和放線菌 等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中，質(zhì)粒常被用做基因的載體，其有多種類(lèi) 型表達(dá)質(zhì)粒、克隆質(zhì)粒、穿梭質(zhì)粒和整合質(zhì)粒等。人工構(gòu)建的質(zhì)?？梢约喾N有用的特征 于一體，如含多種單一酶切位點(diǎn)、具有抗生素耐藥性等，常被用于基因工程。用基因工程的方法使外源基因得到高效表達(dá)的菌類(lèi)細(xì)胞株系一般稱(chēng)“工程菌”，已 被用于各個(gè)方面，如藥品生產(chǎn)、污染物降解等。許多情況下，“工程菌”是采用質(zhì)粒作為外源 基因的載體，當(dāng)表達(dá)外源基因時(shí)，根據(jù)外源基因上游的不同啟動(dòng)子，需要添加不同的誘導(dǎo)劑 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，如IPTG、半乳糖、阿拉伯糖等。為了滿(mǎn)足多功能工程菌的研究需要，Novagen公司開(kāi)發(fā)了 pETDuet和pACYCDuet雙 基因表達(dá)載體，二者可以在同一大腸埃希氏菌中同時(shí)表達(dá)兩種目的蛋白，也可以共轉(zhuǎn)化，聯(lián) 合用于復(fù)雜蛋白復(fù)合物的表達(dá)。該系列的質(zhì)粒采用T7啟動(dòng)子控制外源蛋白表達(dá)，在外源蛋 白表達(dá)時(shí)都需要誘導(dǎo)劑的添加，這增加了工程菌的使用成本和操作步驟，是其應(yīng)用上的不 足，而且有些誘導(dǎo)劑本身就具有一定的毒性，如IPTG。而在原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建中，尚未見(jiàn)到 利用其他啟動(dòng)子構(gòu)建的雙基因表達(dá)質(zhì)粒。目前，有機(jī)磷農(nóng)藥的降解方法主要有光化學(xué)降解、化學(xué)降解和微生物降解三種形 式。傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法降解有機(jī)磷農(nóng)藥雖然效果不錯(cuò)，但成本太高且容易造成二次污 染，因此只能作為一種輔助手段加以利用。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的 降解進(jìn)行了探索，充分肯定了微生物在降解中的重要作用。微生物具有種類(lèi)多，變異快和易 于操縱的特點(diǎn)，至今已分離了許多有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌，其中一些微生物的有機(jī)磷降解酶 的生化性質(zhì)已得到鑒定，少數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥降解基因已得到分離、鑒定和改造。用微生物或無(wú) 細(xì)胞酶制品來(lái)消減農(nóng)藥污染的生物修復(fù)技術(shù)顯出廣闊的應(yīng)用前景(邱道驥等，環(huán)境中有機(jī) 磷農(nóng)藥降解方法的研究進(jìn)展，化工時(shí)刊，2006，20(3) :64-67)。通過(guò)重組DNA技術(shù)構(gòu)建具有 農(nóng)藥降解能力的基因工程微生物，即遺傳工程微生物(GEMs)是有效去除這些污染的新途 徑，目前已經(jīng)有利用基因工程菌株來(lái)降解有機(jī)磷農(nóng)藥的研究，但是已構(gòu)建的基因工程菌株 需要添加誘導(dǎo)劑，增加了有機(jī)磷農(nóng)藥降解應(yīng)用中的使用成本和操作步驟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種能同時(shí)獨(dú)立表達(dá)兩種外源目的基因的雙基因表達(dá)質(zhì) 粒。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供上述雙基因表達(dá)質(zhì)粒的用途。
本發(fā)明的目的是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供了 一種雙基因 表達(dá)質(zhì)粒，其能同時(shí)表達(dá)出兩種外源基因，該表達(dá)質(zhì)粒包括兩組啟動(dòng)子，分別控制位于 其下游的兩種外源基因的表達(dá)；優(yōu)選地，所述是來(lái)源于λ噬菌體的受控于溫度敏感阻 抑物Clts857的熱啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述質(zhì)粒還包括抗性基因、復(fù)制子及多個(gè)酶切位點(diǎn)；更優(yōu)選地，所述抗性 基因選自氨芐青霉素抗性基因、羧芐青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因，最優(yōu)選為氨芐 青霉素抗性基因；所述復(fù)制子選自PMBl復(fù)制子、CoEl復(fù)制子、pSClOl復(fù)制子和pl5A復(fù)制 子，最優(yōu)選為PMBl復(fù)制子；所述酶切位點(diǎn)選自EcoR I.BamH I和Pst I。優(yōu)選地，在所述外源基因中，至少包括一種報(bào)告基因，選自熒光蛋白類(lèi)基因、β-半 乳糖苷酶基因和熒光素酶基因，更優(yōu)選選自熒光蛋白類(lèi)基因，最優(yōu)選為紅色熒光蛋白基因。優(yōu)選地，其中所述外源基因分別為編碼紅色熒光蛋白的基因和編碼有機(jī)磷水解酶 的基因。優(yōu)選地，所述雙基因表達(dá)質(zhì)粒具有圖IB所示的質(zhì)粒圖譜。優(yōu)選地，所述雙基因表達(dá)質(zhì)粒具有如SEQ. ID. NO. 1所示的堿基序列。另一方面，本發(fā)明提供一種包含上述雙基因表達(dá)質(zhì)粒的菌株；優(yōu)選地，所述菌株為 為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)EC-DGEP-LMT001，于2009年1月19日保藏于中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所)，其保藏編號(hào)為CGMCC2881。本發(fā)明還提供由包含上述雙基因表達(dá)質(zhì)粒的菌 株制備的細(xì)胞液體培養(yǎng)物和/或全細(xì)胞蛋白液。又一方面，本發(fā)明提供了上述原核雙基因表達(dá)質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化不表達(dá)溫度敏感阻抑物 的菌株中的用途；優(yōu)選地，所述菌株選自大腸埃希氏菌和假單胞桿菌，更優(yōu)選為大腸埃希氏 菌。綜上所述，本發(fā)明提供了一種人工構(gòu)建的利用λ噬菌體的受控于溫度敏感阻抑 物(clts857)的熱啟動(dòng)子來(lái)控制外源基因表達(dá)的雙基因表達(dá)質(zhì)粒，可同時(shí)表達(dá)兩種目的外 源蛋白。選擇不表達(dá)溫度敏感阻抑物(clts857)的菌株作為宿主菌，則不需要任何誘導(dǎo)作 用就可以直接表達(dá)目的蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該pL-DsRed-pL-OPH質(zhì)粒上的啟動(dòng)子PkPl序列 (其序列如SEQ. ID. NO 2和SEQ. ID. NO 3所示)、氨芐青霉素抗性基因(其序列如SEQ. ID. NO 6所示)、ρΜΒ1復(fù)制子序列(其序列如SEQ. ID. NO 7所示)、rrnBTlT2終止子序列(其序列 如SEQ. ID. N05所示)來(lái)源于質(zhì)粒pBV220,紅色熒光蛋白DsRed基因序列(其序列如SEQ. ID. NO 4所示)來(lái)源于質(zhì)粒pDsRed-Nl，有機(jī)磷水解酶(organophosphorus hydrolase, 0ΡΗ) 基因序列opd (其序列如SEQ. ID. NO 8所示)來(lái)自質(zhì)粒pGEM_T Easy-opd。各段序列通過(guò) PCR、酶切等分子生物學(xué)手段克隆連接成質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH(其堿基序列如SEQ. ID. NOl 所示)。在本發(fā)明提供的雙基因表達(dá)質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH中，帶有一個(gè)氨芐青霉素抗性 基因序列提供氨芐青霉素篩選標(biāo)記，一個(gè)PMBl復(fù)制子序列用以維持質(zhì)粒DNA的自主復(fù)制， 兩組啟動(dòng)子序列用于控制下游目的基因的表達(dá)，DsRed基因序列含有目的蛋白紅色熒 光蛋白DsRed的編碼序列，opd基因序列編碼目的蛋白有機(jī)磷水解酶(organophosphorus hydrolase, ΟΡΗ)，兩個(gè)目的蛋白的基因分別位于兩組啟動(dòng)子PkPl序列下游。
由此可見(jiàn)，本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒載體，其具有兩組來(lái)源于λ噬菌體的受控于溫度 敏感阻抑物(clts857)并控制目的基因表達(dá)的熱啟動(dòng)子序列P1^以及原核生物的高拷貝復(fù) 制子PMB1，該質(zhì)粒含有兩個(gè)獨(dú)立的基因表達(dá)單位，可分別插入兩種目的基因。將該質(zhì)粒導(dǎo) 入不表達(dá)溫度敏感阻抑物(clts857)的大腸埃希氏菌中，該質(zhì)粒所攜帶的兩個(gè)目的基因就 可以進(jìn)行非誘導(dǎo)性表達(dá)，不需添加任何誘導(dǎo)劑。該質(zhì)粒還可以與其他具有相容性復(fù)制子，如 PSClOl和pl5A等復(fù)制子的質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)從而進(jìn)行多基因表達(dá)。表達(dá)外源蛋白的質(zhì)粒能夠延緩宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)，大量的證據(jù)表明，高拷貝數(shù)的質(zhì) 粒和大量的重組蛋白可嚴(yán)重妨礙轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)甚至生存。因此，目前在進(jìn)行外源蛋白表 達(dá)時(shí)，幾乎所有表達(dá)質(zhì)粒都需要添加誘導(dǎo)劑來(lái)調(diào)控外源蛋白的表達(dá)，通常都是選取在宿主 菌的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期添加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)。而本發(fā)明首次利用來(lái)源于λ噬菌體的熱 啟動(dòng)子構(gòu)建了雙基因表達(dá)質(zhì)粒，利用該質(zhì)粒模式可以同時(shí)獨(dú)立表達(dá)兩種外源目的基因，選 擇合適的表達(dá)菌株則可以避免誘導(dǎo)劑的使用，開(kāi)闊了以質(zhì)粒為載體用于生物工程菌構(gòu)建的 應(yīng)用前景。本發(fā)明利用此雙基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建了帶有紅色熒光蛋白基因和有機(jī)磷水解酶基 因的生物工程菌，該工程菌能不經(jīng)藥物誘導(dǎo)表達(dá)有機(jī)磷水解酶和紅色熒光蛋白，前者可用 于對(duì)環(huán)境中有機(jī)磷類(lèi)化學(xué)農(nóng)藥的降解，后者則用于生物工程菌釋放到環(huán)境以后的追蹤與檢 測(cè)，增強(qiáng)了生物工程菌使用的環(huán)境安全性。包含本發(fā)明提供的雙基因表達(dá)質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH的菌株為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)EC-DGEP-LMT001，于2009年1月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)， 其保藏號(hào) CGMCCNo. 2881。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例，其中圖IA為本發(fā)明所提供的雙基因表達(dá)質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH的質(zhì)粒構(gòu)建圖；圖IB為本發(fā)明所提供的雙基因表達(dá)質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH的質(zhì)粒圖譜；圖2為本發(fā)明所提供的雙基因表達(dá)質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH轉(zhuǎn)化E. coliBL21AI 菌 株克隆在熒光顯微鏡下觀察的圖片(放大倍數(shù)IOx4)，其中A為轉(zhuǎn)化菌株，B為未轉(zhuǎn)化菌株；圖3為本發(fā)明所提供的雙基因表達(dá)質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH轉(zhuǎn)化E. coliBL21AI 菌 株克隆在日光下的直接觀察圖片，其中A為轉(zhuǎn)化菌株，B為未轉(zhuǎn)化菌株；圖4為本發(fā)明egfp基因片段的PCR擴(kuò)增片段電泳圖；圖5為本發(fā)明pGEM-T-EGFP載體的酶切鑒定電泳圖，其中酶切位點(diǎn)為EcoR I+BamH I ；圖6為本發(fā)明pBV-EGFP載體的PCR鑒定電泳圖，其中1為egfp基因片段/ pBV-EGFP, 2 為 egfp 基因片段 /pEGFP_N3 ；圖7為本發(fā)明pL-EGFP的PCR擴(kuò)增片段電泳圖；圖8為本發(fā)明pL-EGFP載體的酶切鑒定電泳圖，其中1為酶切位點(diǎn)EcoR I+BamH I，2為酶切位點(diǎn)EcoR I ；圖9為本發(fā)明dsred的PCR擴(kuò)增片段電泳圖；圖10為本發(fā)明pGEM-T-DsRed載體的酶切鑒定電泳圖，其中酶切位點(diǎn)為EcoRI+BamH I ；圖11為本發(fā)明pL-DsRed載體的PCR驗(yàn)證電泳圖，其中1為dsred片段/ pDsRed-Nl,2 為 dsred 片段 /pL-DsRed ；圖12為本發(fā)明pL-DsRed載體的酶切鑒定電泳圖，其中1為酶切位點(diǎn)EcoR I+BamH I，2為酶切位點(diǎn)EcoR I ；圖13為本發(fā)明opd的PCR擴(kuò)增電泳圖；圖14為本發(fā)明pGEM-T-OPH載體的酶切鑒定電泳圖，其中酶切位點(diǎn)為Hindi 11+Xho I ；圖15為本發(fā)明pL-OPH載體的PCR驗(yàn)證電泳圖，其中1為opd基因片段/ pGEM-T-opd, 2 為 opd 基因片段 /pL-OPH ；圖16為本發(fā)明pL-OPH載體的酶切鑒定電泳圖，其中1為酶切位點(diǎn)BamH 1，2為酶 切位點(diǎn) Pst I+BamH I ；圖17為本發(fā)明pL-DsRed片段的PCR擴(kuò)增電泳圖；圖18為本發(fā)明Promoter-OPH-terminator片段的PCR擴(kuò)增電泳圖；圖19為本發(fā)明pL-DsRed-pL-ΟΡΗ載體的PCR驗(yàn)證電泳圖，其中1為dsred和 opd 基因片段 /pL-DsRed-pL-0PH, 2 為 opd 基因片段 /pGEM-T-opd，3 為 dsred 基因片段 / pDsRed-Nl ；圖20為本發(fā)明pL-DsRed-pL-OPH載體的酶切鑒定電泳圖，其中1為酶切位點(diǎn)Nco I，2為酶切位點(diǎn)Sac I ；圖21為本發(fā)明中對(duì)硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中所使用的技術(shù)，包括PCR、酶切等分子生物學(xué)手段，以及菌株培養(yǎng)、轉(zhuǎn) 化、檢測(cè)技術(shù)等，除非特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)；所使用的儀器設(shè) 備、試劑、菌株等，除非是本說(shuō)明書(shū)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的研究和技術(shù)人員可以通過(guò)公共 途徑獲得的。以下各實(shí)施例中所涉及的具體實(shí)驗(yàn)操作方法在此說(shuō)明如下1、50 μ LPCR擴(kuò)增體系的配制如下總體積50 μ L，含0. 1 IOng質(zhì)粒，1 XPCR緩沖液(含Mg2+)，上下游引物各 0. 8 μ mol/L, 0. 2mmol/LdNTP, 2. 5UDNA 聚合酶。2、瓊脂糖凝膠電泳，具體方法參照《分子克隆》(第三版)Sambr00kJ，Russell Dff(2001)Molecular cloning :A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York，采用TAE電泳緩沖液，溴化乙錠染色標(biāo)記，溴酚藍(lán)為 指示劑。3、DNA凝膠純化回收采用DNA凝膠純化回收試劑盒(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限 公司)，具體操作如下1)將無(wú)石蠟油的PCR反應(yīng)液或酶切反應(yīng)液在的普通瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需的DNA條帶裝入1. 5mL離心管中，加入溶液A (膠重/溶液體積=1/3)。2) 50°C保溫10分鐘，每2分鐘顛倒混勻1次，使瓊脂糖凝膠完全融化。待溶化后 置室溫加入15 μ L溶液B，充分混勻。3)將混和液轉(zhuǎn)移入離心柱，靜置2分鐘，12000r/分鐘離心30秒，倒掉收集管中的廢液。4)加入500 μ L溶液C于離心柱中，12000r/分鐘離心30秒，倒掉收集管中的廢液。5)重復(fù)步驟4) 一次。6) 12000r/分鐘離心1分鐘，甩干剩余液體以除去殘余酒精。7)將離心純化柱套入干凈的1. 5mL離心管中，開(kāi)蓋放置5 10分鐘，使乙醇充分 揮發(fā)干凈。8)加入20 30 μ L溶液D (或滅菌去離子水)，靜置2分鐘后，12000r/分鐘離心 30秒。離心管中的液體即是純化的DNA片段，取4μ L電泳(0. 8%瓊脂糖，120V, 10分鐘) 檢測(cè)并目測(cè)定量。-20°C保存?zhèn)溆谩?、T/A克隆方法如下PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收后，進(jìn)行加A反應(yīng)，10 μ L體系中含6 μ LPCR 回收片段，1\ 0 緩沖液，0.8讓01/1 dNTP，0.5U TaqDNA聚合酶，在PCR儀上72°C運(yùn)行20 分鐘，然后直接取反應(yīng)液與T載體進(jìn)行連接。連接體系10 μ L，包括5 μ L2 X緩沖液，IuL T 載體DNA(SOng)JyL加A片段，IyL T4DNA連接酶，4°C連接過(guò)夜。取5μ L連接產(chǎn)物加入 到100 μ L感受態(tài)細(xì)菌TOP 10中，冰浴30分鐘，42°C熱擊90秒，立即冰上放置3分鐘，加入 950 μ L液體LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)Ih后，5000g離心1分鐘，棄上面培養(yǎng)液，保留150 μ L 培養(yǎng)液懸浮菌體，均勻涂布在含IPTG/X- β -gal/氨芐青霉素的LB平板上，倒置平板于37°C 培養(yǎng)16 20小時(shí)后，將平板于4°C放置1 2小時(shí)，使藍(lán)色顯現(xiàn)清楚，挑取白色菌落搖菌鑒 定。5、大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)及轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆》(第 H Hjx ) Sambrook J, Russell Dff (2001)Molecular cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York,具體操作如下1)從37°C培養(yǎng)16 20小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(直徑2 3mm)，轉(zhuǎn)到 含有IOOmL LB培養(yǎng)基的IL燒瓶中。于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約3小時(shí)。為得到有效轉(zhuǎn)化，活 細(xì)胞數(shù)不應(yīng)超過(guò)IO8個(gè)/mL，可每隔20 30分鐘測(cè)量0D600值來(lái)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況， 待菌液0D600達(dá)到0. 35時(shí)開(kāi)始收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。2)在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到用冰預(yù)冷的50mL無(wú)菌聚丙烯管中，在冰上放置10 分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0°c。3)于40Cffl Sorval 1GS3轉(zhuǎn)頭(或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭)以4100r/分鐘離心10分鐘， 以回收細(xì)胞。4)倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。5)每50mL初始培養(yǎng)物用30mL預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2-MgCl2溶液重懸。6)于4°C以4100r/分鐘離心10分鐘，回收細(xì)胞。7)倒出上清，將管倒置1分鐘以使最后殘留的液體流盡。8)每50mL初始培養(yǎng)物用2mL預(yù)冷的0. lmol/LCaCl2懸浮。
9)用冷卻的無(wú)菌吸頭從感受態(tài)細(xì)胞懸液中取200 μ L轉(zhuǎn)移到無(wú)菌微量離心管中， 加入DNA(體積小于10μ L，DNA含量小于50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘。10)將管放到預(yù)加溫到42°C的循環(huán)水浴中放置90秒(其間不要搖動(dòng))。11)快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1 2分鐘。12)向管中加入800 μ L LB培養(yǎng)基，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上溫和搖動(dòng)(轉(zhuǎn)速 不超過(guò)225r/分鐘)，溫育45分鐘使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。13)離心濃縮細(xì)胞，然后用適量LB輕輕重懸細(xì)胞，將適當(dāng)體積(每個(gè)90mm平板可 達(dá)200 μ L)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。14)將平板置于室溫直至液體被吸收。倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12 16小時(shí)后可 出現(xiàn)菌落。6、質(zhì)粒的小量提取(SDS堿裂解法)方法參照《分子克隆》(第三版)Sambrook J, Russell Dff(2001)Molecular cloning :A LaboratoryManual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork,具體操作如下1)挑轉(zhuǎn)化后的單克隆菌落于3mL含抗生素的LB培養(yǎng)基(50 μ g/L抗生素)中于 37°C劇烈振搖培養(yǎng)過(guò)夜。2)將1. 5mL培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4°C以12000g離心30秒，
棄上清，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。3)將所得細(xì)菌沉淀重懸于100 μ L預(yù)冷的溶液I (溶液成分為25mmol/ LTris-HCl (pH8. 0)，10mmol/L EDTA，50mmol/L葡萄糖)中，劇烈振蕩，使細(xì)菌沉淀在溶液I
中完全分散。4)加200 μ L新配制的溶液II (溶液成分為:200mmol/L NaOH, 1 % SDS)，蓋緊管 口，快速顛倒離心管5次，將離心管放置于冰上。5)力Π 150 μ L預(yù)冷的溶液III (溶液成分為3mol/L醋酸鉀(KAc)緩沖液，pH 4.8)， 蓋緊管口，將管倒置后溫和地振蕩10秒，使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后 將管置于冰上3 5分鐘。6)用微量離心機(jī)于4°C，12000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。7)加入2倍體積的無(wú)水乙醇，振蕩混合，于-20°C放置30分鐘。用微量離心機(jī)于 4°C以12000g離心10分鐘。8)小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管 壁的液滴除盡。9)用ImL 70%乙醇洗滌沉淀，按步驟8)所述方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀 干燥8分鐘。10)加入40 μ L含20 μ g/mL RNaseA的滅菌去離子水溶解沉淀，37°C保溫30分鐘 后放入_20°C保存?zhèn)溆谩?、酶切反應(yīng)單酶切反應(yīng)體系總體積20 μ L，質(zhì)?；駾NA片段約500ng，內(nèi)切酶1 μ L，10Χ緩沖 液2 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)足體積至20 μ L0 37°C保溫4小時(shí)，取5 μ L酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳 鑒定，繼續(xù)酶切反應(yīng)直至酶切完全。
雙酶切反應(yīng)體系總體積20yL，質(zhì)?；駾NA片段約500 μ g，兩種內(nèi)切酶各 0.8yL,10X緩沖液2 μ L，用滅菌去離子水補(bǔ)足體積至20 μ L。37°C保溫4h，取5 μ L酶切 產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，繼續(xù)酶切反應(yīng)直至酶切完全。
實(shí)施例1 載體pL-EGFP的構(gòu)建本實(shí)施例為載體pL-EGFP的構(gòu)建，包括先進(jìn)行EGFP基因片段的PCR擴(kuò)增及克隆、 然后構(gòu)建出載體pBV-EGFP，擴(kuò)增出其中的pL-EGFP片段后，最終構(gòu)建出載體pL_EGFP，具體 的操作步驟詳述如下(1) EGFP基因片段的PCR擴(kuò)增及T/A克?、賓gfp基因片段的PCR擴(kuò)增以pEGFP_N3 (Clotech公司)為模板，擴(kuò)增egfp基因 片段，717bp。采用pfuDNA聚合酶(Promega公司)，擴(kuò)增體系50 μ L，上游引物序列為5，_G GGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT (EcoR I)，下游引物序列為 5，-TTGGATCCCTTGTACAGCTC GTCCATGCCGAG(BamH I)，PCR 擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置為94°C預(yù)變性 3 分鐘；94°C，30 秒 /68°C 80 秒 (25個(gè)循環(huán))；72°C 10分鐘。擴(kuò)增片段的進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示；②egfp基因片段的純化回收采用瓊脂糖凝膠電泳純化并回收egfp基因片段；③構(gòu)建質(zhì)粒pGEM-T-EGFP 將回收的egfp基因片段進(jìn)行加A反應(yīng)后，與 pGEM-TEasy載體(Promega公司)連接構(gòu)建質(zhì)粒pGEM_T_EGFP (加A反應(yīng)及連接的具體操作 見(jiàn)Promega公司的使用說(shuō)明書(shū))；④酶切鑒定采用EcoR I和BamH I雙酶切質(zhì)粒pGEM_T_EGFP可以得到egfp片 段，酶切鑒定電泳結(jié)果如圖5所示。(2)載體 pBV-EGFP 的構(gòu)建①酶切處理質(zhì)粒pBV 220 (中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所)和pGEM_T_EGFP的 純化產(chǎn)物分別經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切處理，凝膠電泳回收純化目的條帶；②構(gòu)建質(zhì)粒pBV-EGFP:連接體系25 μ L，包括2. 5 μ LlOX T4 DNA連接酶緩沖液， IOOng酶切pBV 220載體后的回收片段，IOOng酶切pGEM-T-EGFP后的回收片段，IyL T4 DNA連接酶，16°C連接20小時(shí)。③轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PBV-EGFP 用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH 5 α (購(gòu)自北京天根公司)，涂 布在含氨芐青霉素(50yg/mL，下同)的LB瓊脂板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。挑單克隆菌落于含氨 芐青霉素的液體LB中(體積5mL，下同)，在37°C下200 250r/分鐘過(guò)夜培養(yǎng)。④鑒定取1. 5mL菌液進(jìn)行質(zhì)粒小量提取，25倍稀釋原質(zhì)粒作為PCR模板，通 過(guò)PCR驗(yàn)證可以擴(kuò)增出egfp基因片段，電泳結(jié)果如圖6所示，其中1為pBV-EGFP，2為 PEGFP-N3。電泳結(jié)果證明所得質(zhì)粒為目的質(zhì)粒pBVEGFP。(3)載體 pL-EGFP 的構(gòu)建①pL-EGFP片段的PCR擴(kuò)增以pBV-EGFP為模板，采用PCR擴(kuò)增pL-EGFP片段， 3624bp。采用pfuDNA聚合酶，擴(kuò)增體系50 μ L，上游引物序列為5' -TTCGAGCTCCGTGCGTGTT GACTATTTTACCT (Sac I)，下游引物序列為 5，-GCTCTAGATCGGCAAGGTGTTCTGGTC(Xba I)，PCR 擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置為94°C預(yù)變性3分鐘；94°C，40秒/56°C，35秒/72°C，6分鐘10秒(25個(gè)循 環(huán))；72°C，10分鐘。擴(kuò)增片段的電泳結(jié)果如圖7所示；②pL-EGFP片段的純化回收利用 DNA凝膠回收試劑盒回收純化PCR擴(kuò)增的pL-EGFP片段；③pL-EGFP片段的磷酸化，連接及轉(zhuǎn)化
1)磷酸化利用T4多核苷酸激酶(購(gòu)自大連寶生物工程公司)磷酸化PCR產(chǎn)物 pL-EGFP片段末端，按如下體系配置反應(yīng)管PCR產(chǎn)物片段約25pmol/L，5yL10XT4多核 苷酸激酶緩沖液，1 μ L 10mmol/LATP, 1 μ LT4多核苷酸激酶，用滅菌去離子水補(bǔ)充體積至 50 μ L0 37°C，反應(yīng)30分鐘。然后65°C，20分鐘滅活多核苷酸激酶。酚-氯仿抽提2次；2)連接進(jìn)行自身環(huán)化連接，體系如下磷酸化的PCR產(chǎn)物lOOng，1 μ L10XT4DNA 連接酶緩沖液，0. 5 μ L Τ4 DNA連接酶(購(gòu)自大連寶生物工程公司)，1. 5 μ L30% PEG8000, 用水補(bǔ)足體積至10 μ L0 16°C，反應(yīng)20小時(shí)；3)轉(zhuǎn)化及鑒定取8 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε. coli DH5 α，涂布在含氨芐青霉素的LB 瓊脂板，28°C過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單克隆入含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于28°C過(guò)夜培 養(yǎng)。次日，取菌液ImL離心沉淀菌體，菌體顏色呈現(xiàn)明顯綠色的即為所要克隆的菌體，提取 質(zhì)粒，并用EcoR I和BamH I進(jìn)行酶切鑒定，所得條帶大小與預(yù)期一致，電泳結(jié)果如圖8所 示，其中1為酶切位點(diǎn)EcoR I+BamH I，2為酶切位點(diǎn)EcoR I，說(shuō)明pL_EGFP質(zhì)粒構(gòu)建成功。實(shí)施例2 雙基因表達(dá)質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH的構(gòu)建本實(shí)施例為雙基因表達(dá)質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH的構(gòu)建，包括先分別構(gòu)建并擴(kuò)增出 質(zhì)粒pL-DsRed和質(zhì)粒pL-OPH后，連接構(gòu)建出雙基因表達(dá)質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH，其質(zhì)粒構(gòu) 建圖如圖IA所示，相應(yīng)的質(zhì)粒圖譜如圖IB所示，具體的操作步驟詳述如下(1)質(zhì)粒 PL-DsRed 的構(gòu)建①DsRed基因片段的PCR擴(kuò)增及T/A克隆以pDsRed-Nl (購(gòu)自Clontech公司) 為模板，擴(kuò)增DsRed基因片段，其堿基序列如SEQ. ID. N04所示，690bp。采用pfuDNA聚合酶， 擴(kuò)增體系50 μ L，PCR擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置為94°C預(yù)變性3分鐘-MV，30秒/57°C，30秒/72°C， 90秒(25個(gè)循環(huán))；72°C，10分鐘。擴(kuò)增片段的電泳結(jié)果，如圖9所示；上游引物序列為5’ -GGAATTCATGGTGCGCTCCTCCAAGA (EcoR I)，下游引物序列為 5’-CGGGATCCCTCATTACTACAGGAA CAGGTGGTGGC(BamH I)；②DsRed基因片段的純化回收電泳純化回收PCR電泳擴(kuò)增的DsRed基因片段；③質(zhì)粒pGEM-T-DsRed的構(gòu)建進(jìn)行加A反應(yīng)后與pGEM_TEasy載體連接構(gòu)建質(zhì)粒 pGEM-T-DsRed；④酶切鑒定利用EcoR I和BamH I雙酶切構(gòu)建的質(zhì)粒pGEM-T-DsRed，酶切鑒定 電泳結(jié)果如圖10所示。⑤質(zhì)粒PL-DsRed的構(gòu)建1)酶切處理采用EcoR I和BamH I雙酶切處理pGEM-T-DsRed和pL_EGFP ；2)純化回收凝膠電泳純化回收目的條帶；3)構(gòu)建pL-DsRed載體進(jìn)行連接；4)驗(yàn)證利用PCR擴(kuò)增DsRed基因進(jìn)行驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖11所示，其中1為 pDsRed-Nl，2為pL-DsRed ；同時(shí)利用EcoR I和BamH I進(jìn)行雙酶切鑒定，可見(jiàn)雙酶切可切出 DsRed基因片段(690bp)，EcoR I單酶切所得線性化條帶也與預(yù)期一致(3615bp)，電泳結(jié)果 如圖12所示，其中1為酶切位點(diǎn)EcoR I+BamH I，2為酶切位點(diǎn)EcoR I。(2)質(zhì)粒pL-OPH的構(gòu)建①OPH基因片段的PCR擴(kuò)增及T/A克隆以質(zhì)粒pGEM-T-opd (中科院動(dòng)物研究所) 為模板擴(kuò)增OPH的基因opd，其堿基序列如SEQ. ID. NO 8所示，1098bp。采用pfuDNA聚合酶，擴(kuò)增體系50 u L，PCR擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置為94°C預(yù)變性3分鐘；94°C，30秒/57°C，35秒/72°C， 2分鐘(25個(gè)循環(huán))；72°C，10分鐘。擴(kuò)增片段的電泳結(jié)果如圖13所示；②opd基因片段的純化回收電泳純化回收PCR電泳擴(kuò)增的opd基因片段；③質(zhì)粒pGEM-T-OPH的構(gòu)建進(jìn)行加A反應(yīng)后與pGEM-TEasy載體連接構(gòu)建質(zhì)粒 pGEM-T-OPH ；④酶切鑒定利用BamH I和Pst I雙酶切構(gòu)建的質(zhì)粒pGEM-T-OPH，酶切鑒定電泳 結(jié)果如圖14所示。⑤質(zhì)粒pL-0PH的構(gòu)建1)酶切處理采用BamH I和Pst I雙酶切處理pGEM-T-OPH和載體pBV 220 ；2)純化回收凝膠電泳純化回收目的條帶opd ；3)構(gòu)建pBV-OPH載體進(jìn)行連接；4)構(gòu)建pL-0PH載體用EcoR I和Pst I雙酶切處理pBV-OPH切出opd基因，與 用EcoR I和Pst I雙酶切的載體pL-EGFP進(jìn)行連接構(gòu)建pL_0PH載體；5)驗(yàn)證利用PCR擴(kuò)增opd基因進(jìn)行驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖15所示，其中1為 pGEM-T-opd，2為pL-0PH ；同時(shí)利用EcoR I和Pst I進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果如圖16所 示，其中1為酶切位點(diǎn)BamH I，2為酶切位點(diǎn)Pst I+BamH I。(3)雙基因表達(dá)質(zhì)粒pL-DsRed-pL-0PH的構(gòu)建①pL-DsRed 片段和 Promoter-OPH-terminator 片段的 PCR 擴(kuò)增1) pL-DsRed片段的PCR擴(kuò)增以pL-DsRed為模板采用PCR擴(kuò)增pL-DsRed片段， 3615bp。采用pfuDNA聚合酶，擴(kuò)增體系50 u L，PCR擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置為94°C預(yù)變性3分鐘； 94°C，40秒/56°C，35秒/72°C，6分鐘10秒(25個(gè)循環(huán))；72°C，10分鐘。電泳結(jié)果如圖17 所示。2)Promoter-OPH-terminator 片段的 PCR 擴(kuò)增以 pL-OPH 為模板采用 PCR 擴(kuò)增 Promoter-OPH-terminator 片段，2002bp。采用 pfuDNA 聚合酶，擴(kuò)增體系 50 u L, PCR 擴(kuò)增 參數(shù)設(shè)置為94°C預(yù)變性3分鐘；94°C，40秒/53°C，35秒/72°C，4分鐘30秒(25個(gè)循環(huán))； 72°C，10分鐘。電泳結(jié)果如圖18所示。②雙基因表達(dá)質(zhì)粒pL-DsRed-pL-0PH的構(gòu)建1)純化回收利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化pL-DsRed和 Promoter-OPH-terminatorPCR 擴(kuò)增片段；2)磷酸化利用T4多核苷酸激酶磷酸化Promoter-OPH-terminator片段末端。 按如下體系配置反應(yīng)管PCR產(chǎn)物片段約25pmol/L，5uL10X T4多核苷酸激酶緩沖液，1 U L 10mmol/LATP, 1 u L T4多核苷酸激酶，用滅菌去離子水補(bǔ)充體積至50 u L。37°C，反應(yīng)30分 鐘。然后65°C，20分鐘滅活多核苷酸激酶。酚-氯仿抽提2次。3)連接進(jìn)行連接的體系如下pL-DSRed片段純化產(chǎn)物lOOng，磷酸化 Promoter-OPH-terminator 片段 100ng, 1 u L 10 X T4DNA 連接酶緩沖液，0. 5 u L T4 DNA 連 接酶，1.5iiL 30% PEG8000，用水補(bǔ)足體積至10ii L。16°C，反應(yīng)20h。4)轉(zhuǎn)化及鑒定取8 ii L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH 5 a ,涂布在含氨芐青霉素的 LB瓊脂板，28°C過(guò)夜培養(yǎng)。挑單克隆菌落于3mL含氨芐青霉素的液體LB中28 V 200 250r/分鐘過(guò)夜培養(yǎng)。取1. 5mL菌液進(jìn)行質(zhì)粒小量提取，25倍稀釋原質(zhì)粒作為PCR模板，同時(shí)擴(kuò)增DsRed基因片段和opd基因片段，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖19所示，其中1為 pL-DsRed-pL-OPH, 2 為 pGEM-T_opd，3 為 pDsRed-Nl ；分別利用 Sac I 和 Nco I 進(jìn)行單酶切 驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖20所示，其中1為酶切位點(diǎn)Nco I，2為酶切位點(diǎn)Sac I。實(shí)施例3 雙基因表達(dá)質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH轉(zhuǎn)化菌株本實(shí)施例將雙基因表達(dá)質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH轉(zhuǎn)化到菌株中，并對(duì)轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行 了功能鑒定。1、制備質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌株采用氯化鈣法制備E. coli BL21AI 菌株(Invitrogen公司)感受態(tài)細(xì)胞，將質(zhì)粒 pL-DsRed-pL-OPH轉(zhuǎn)入該感受態(tài)細(xì)胞中，將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含氨芐青霉素抗生 素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。將平板置于室溫直至液體被吸收。倒置平皿，于30°C培養(yǎng)，12 16 小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。所得菌落克隆即為質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH轉(zhuǎn)化菌株。2、轉(zhuǎn)化菌株的熒光特性觀察將LB培養(yǎng)基瓊脂平板上質(zhì)粒pL-DsRed-pL-OPH轉(zhuǎn)化菌株的克隆持續(xù)在30°C培養(yǎng) 約2天后，將平板上的克隆置于熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)強(qiáng)烈紅色熒光，如圖2所示，其中其 中A為轉(zhuǎn)化菌株，B為未轉(zhuǎn)化菌株，放大倍數(shù)為10X4。繼續(xù)培養(yǎng)約5天后，在日光下直接觀 察就可見(jiàn)克隆呈現(xiàn)紅色，如圖3所示，其中A為轉(zhuǎn)化菌株，B為未轉(zhuǎn)化菌株。3、制備轉(zhuǎn)化菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取pL-DsRed-pL-OPH轉(zhuǎn)化的E. coli BL21AI 單克隆入含氨芐青霉素的液體LB 中，于30°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜。次日，以2%比例接種于新的含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中， 繼續(xù)在30°C培養(yǎng)14h后獲得轉(zhuǎn)化菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。4、制備轉(zhuǎn)化菌株的全細(xì)胞蛋白取pL-DsRed-pL-OPH轉(zhuǎn)化的E. coli BL21AI 菌株培養(yǎng)液1. 5mL倒入微量離心管 中，用微量離心機(jī)于4°C以12000g離心30秒，棄上清。用IX磷酸鹽緩沖液(PBS) (pH 7. 4)洗滌沉淀兩遍。加入300 ii L的1 XPBS懸浮沉淀，1/100體積的50mg/mL的溶菌酶，1/100體積的 10% TritonX-100o 30°C溫浴 15 分鐘。將離心管放置冰上，超聲破碎(40Hz，2 3分鐘)。所得液體即為全細(xì)胞蛋白液。5、轉(zhuǎn)化菌株的全細(xì)胞蛋白液的有機(jī)磷水解酶活性測(cè)定1)蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度采用Bradford(1976)的方法測(cè)定。2)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用50mmol/LTriS-HCl緩沖液(pH 7. 8)將對(duì)硝基苯酚稀釋成6個(gè)濃度梯度(0、30、 60、90、120、150mmol/L)，分別測(cè)定400nm的吸光度值，然后以0D-值為縱坐標(biāo)，對(duì)硝基苯酚 濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖21)。3)轉(zhuǎn)化菌的0PH活性測(cè)定①取30°C培養(yǎng)14小時(shí)和放置第4天、第8天的菌樣制備全細(xì)胞蛋白。②反應(yīng)體系總體積lmL，50mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7. 8)中含10 y g全細(xì)胞蛋 白，3 ii L 50mmol/L的對(duì)硫磷，混勻。③30°C反應(yīng)1. 5小時(shí)后用分光光度計(jì)測(cè)定0D4(1(1值。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出全細(xì)胞蛋白裂解液(TCP，totalcellprotein)的有機(jī)磷水 解酶活性，結(jié)果如表1所示。表1轉(zhuǎn)化菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解
權(quán)利要求
一種雙基因表達(dá)質(zhì)粒，其能同時(shí)表達(dá)出兩種外源基因，該表達(dá)質(zhì)粒包括兩組PRPL啟動(dòng)子，分別控制位于其下游的兩種外源基因的表達(dá)；優(yōu)選地，所述PRPL是來(lái)源于λ噬菌體的受控于溫度敏感阻抑物cIts857的熱啟動(dòng)子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙基因表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒還包括抗性基因、 復(fù)制子及多個(gè)酶切位點(diǎn)；優(yōu)選地，所述抗性基因選自氨芐青霉素抗性基因、羧芐青霉素抗性 基因和卡那霉素抗性基因，更優(yōu)選為氨芐青霉素抗性基因；所述復(fù)制子選自PMBl復(fù)制子、 CoEl復(fù)制子、pSClOl復(fù)制子和pl5A復(fù)制子，更優(yōu)選為pMBl復(fù)制子；酶切位點(diǎn)選自EcoR I、 BamH I 和 Pst I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙基因表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，在所述外源基因中，至少 包括一種報(bào)告基因，優(yōu)選選自熒光蛋白類(lèi)基因、半乳糖苷酶基因和熒光素酶基因，更優(yōu) 選選自熒光蛋白類(lèi)基因，最優(yōu)選為紅色熒光蛋白基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的雙基因表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，其中所述外源基 因分別為編碼紅色熒光蛋白的基因和編碼有機(jī)磷水解酶的基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙基因表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，其具有圖IB所示的質(zhì)粒圖譜。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的雙基因表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，其具有如SEQ.ID. NO 1所 示的堿基序列。
7.包含權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述雙基因表達(dá)質(zhì)粒的菌株；優(yōu)選地，所述菌株的保 藏編號(hào)為CGMCC2881。
8.由權(quán)利要求7所述菌株制備的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。
9.由權(quán)利要求7所述菌株制備的全細(xì)胞蛋白液。
10.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的原核雙基因表達(dá)質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化不表達(dá)溫度敏感阻抑 物的菌株中的用途，優(yōu)選地，所述菌株選自大腸埃希氏菌和假單胞桿菌，更優(yōu)選為大腸埃希 氏菌。
全文摘要
本發(fā)明提供一種雙基因表達(dá)質(zhì)粒及其用途。本發(fā)明所提供的質(zhì)粒能夠同時(shí)表達(dá)出兩種外源基因，其包括兩組來(lái)源于λ噬菌體的受控于溫度敏感阻抑物cIts857的熱啟動(dòng)子PRPL啟動(dòng)子，分別控制位于其下游的兩種外源基因的表達(dá)。本發(fā)明所提供的原核雙基因表達(dá)質(zhì)粒，所表達(dá)的外源基因分別為編碼紅色熒光蛋白的基因和編碼有機(jī)磷水解酶的基因。本發(fā)明還利用該質(zhì)粒構(gòu)建出生物工程菌，其能不經(jīng)誘導(dǎo)就表達(dá)出目的基因。本發(fā)明利用來(lái)源于λ噬菌體的熱啟動(dòng)子構(gòu)建了雙基因表達(dá)質(zhì)粒，利用該質(zhì)粒模式可以同時(shí)獨(dú)立表達(dá)兩種外源目的基因，選擇合適的表達(dá)菌株則可以避免誘導(dǎo)劑的使用，開(kāi)闊了以質(zhì)粒為載體用于生物工程菌構(gòu)建的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101993884SQ20091009128
公開(kāi)日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月17日
發(fā)明者伍一軍, 李琴, 李薇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所