專利名稱：甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，特別涉及一種利用胰蛋白酶將甘精胰島素前體酶切使轉(zhuǎn)化成甘精胰島素的方法。
背景技術(shù)：
甘精胰島素(glycine-arginine insulin)是一種通過基因重組技術(shù)獲得并用于治療1、II型糖尿病的長效胰島素類生物制品，其持續(xù)控制血糖的原理為皮下注射后甘精胰島素分子立即聚合，因而溶解度降低，形成甘精胰島素沉淀物，機(jī)體吸收延遲，其降糖作用的時(shí)間也被延長。重組甘精胰島素是當(dāng)前治療1、II型糖尿病十分方便和有效的藥物。國外由Aventis公司生產(chǎn)的重組甘精胰島素商品名為來得時(shí)(Lantus)，國內(nèi)由甘李藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的重組甘精胰島素注射液商品名為長秀霖。 甘精胰島素(glycine-arginineinsulin,簡稱 Glargine)的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)為21A-Gly-30Ba-L-Arg-30Bb-L-Arg-人胰島素，即將人胰島素A鏈的21位Asn替換成Gly,在B鏈的30位氨基酸后加入2個(gè)Arg而成。完整的重組甘精胰島素由A鏈和B鏈共53個(gè)氨基酸組成，其中A鏈含有21個(gè)氨基酸，B鏈含有32個(gè)氨基酸。甘精胰島素在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為融合形式的重組甘精胰島素前體，前體的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為在B鏈和A鏈之間加入C肽(由33個(gè)氨基酸組成)，組成的融合甘精胰島素前體蛋白，線性序列為B (32)-C(33)-A(21)。該C肽保證了 A鏈和B鏈的正確折疊，可通過胰蛋白酶酶切切除。甘精胰島素前體蛋白的氨基酸序列中有4個(gè)精氨酸和2個(gè)賴氨酸(Arg23，Arg 31，Arg 32, Arg 65 ；Lys29, Lys 64)，都是胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)。因此，采用胰蛋白酶將前體蛋白中的Arg 32和Arg 65羧基端切斷，即可去除C肽后得到甘精胰島素。然而，由于其他酶切位點(diǎn)的存在，胰蛋白酶作用于前體蛋白時(shí)不僅僅使Arg 32和Arg 65羧基端斷裂，而且還可能將Arg23, Lys29和Lys 64位點(diǎn)切斷，從而產(chǎn)生酶切副產(chǎn)物，降低了酶切收率，給后續(xù)純化帶來困難。中國專利CN 1052332中公開了制備脫(64，65)胰島素原的方法，即用胰蛋白酶處理人胰島素原，產(chǎn)生的物質(zhì)中包括(65-A1裂開)HPI，用羧肽酶B處理提純的(65-A1裂開)HPI，可得到脫(64，65)胰島素原。然而，在已公開文獻(xiàn)中鮮有關(guān)于重組甘精胰島素酶切工藝及參數(shù)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過優(yōu)化酶切工藝參數(shù)，提供一種甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，即用胰蛋白酶酶切甘精胰島素前體，使之轉(zhuǎn)化生成甘精胰島素的方法。該方法能最大程度地降低副產(chǎn)物的生成，給后續(xù)純化工作帶來了極大方便。本發(fā)明的目的是通過采用下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟將甘精胰島素前體溶解于pH8 11的緩沖液中，控制反應(yīng)體系的溫度為0 37°C，按胰蛋白酶與甘精胰島素前體的質(zhì)量比為1:1000 10000加入胰蛋白酶，反應(yīng)2 40小時(shí)；所述緩沖液選自碳酸氫銨、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸或磷酸鹽的緩沖液。上述甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，其中所述緩沖液優(yōu)選為20 IOOmM碳酸氫銨，pH8 10 ;或 20 100 mM Tris-CL, pH9 11 ;或 20 IOOmM 甘氨酸，pH9 11。上述甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，優(yōu)選將甘精胰島素前體按5 10 g/L的濃度溶解于所述緩沖液中。所述胰蛋白酶為未經(jīng)甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)處理或經(jīng)甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮處理的來自豬或牛的胰蛋白酶。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，其中用于甘精胰島素前體酶切轉(zhuǎn)化的反應(yīng)溫度為4 25°C。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，其中用于甘精胰島素 前體酶切轉(zhuǎn)化的反應(yīng)時(shí)間為5 30小時(shí)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的酶切轉(zhuǎn)化方法用于甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化生成甘精胰島素，能使產(chǎn)生的甘精胰島素量顯著增加，同時(shí)顯著減少副產(chǎn)物，酶切收率高，所得的酶切液后續(xù)純化容易，適合于工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例在酶切過程中用于檢測酶切收率(%)的公式經(jīng)推導(dǎo)如下一摩爾的甘精胰島素前體經(jīng)酶切得到一摩爾的甘精胰島素，因此，M1ZMr1=M2ZMr2M2= M1 XMr2-^-Mr1=6063 M1 +10300其中，M2為酶切后甘精胰島素的量(g)，Mr2為甘精胰島素的分子量(6063道爾頓)；M1為酶切前甘精胰島素前體的量(g), Mr1為甘精胰島素前體的分子量(10300道爾頓)。因此理論上，I克甘精胰島素前體可產(chǎn)生0. 59克甘精胰島素。酶切收率(％)=實(shí)際得到的甘精胰島素的量(g) +理論上應(yīng)得的甘精胰島素的量(g) X 100%由于甘精胰島素前體在胰蛋白酶的酶切過程中，除了生成甘精胰島素，還會產(chǎn)生其它的副產(chǎn)物，甚至生成的甘精胰島素還會被進(jìn)一步酶切成不希望得到的副產(chǎn)物，因此實(shí)際得到的甘精胰島素的量往往小于理論上應(yīng)得的甘精胰島素的量?，F(xiàn)通過以下實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明的有益效果，實(shí)施例僅用于例證的目的，不限制本發(fā)明的范圍，同時(shí)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。實(shí)施例1甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化室溫下，將甘精胰島素前體(由大腸桿菌通過重組DNA技術(shù)制得)I克溶解于100ml 20 mM碳酸氫銨緩沖液，pH為8. 0中，使前體的蛋白濃度約為10 g/L?？刂迫芤簻囟葹?°C，接著加入牛胰蛋白酶，使酶底物=1 :1000，開始酶切反應(yīng)。維持反應(yīng)溫度為4°C不變。5小時(shí)后，加入6 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH為3. 5停止該反應(yīng)。取酶切液10 yl經(jīng)HPLC分析檢測，根據(jù)甘精胰島素的峰面積按峰面積歸一化法計(jì)算酶切后實(shí)際得到的甘精胰島素的量M2,因此甘精胰島素的酶切收率經(jīng)計(jì)算約為86%。實(shí)施例2甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化室溫下，將甘精胰島素前體(由大腸桿菌通過重組DNA技術(shù)制得)I克溶解于200ml 100 mM碳酸氫銨緩沖液，pH為10中，使前體的蛋白濃度約為5 g/L?？刂迫芤簻囟葹?5°C，接著加入TPCK處理的牛胰蛋白酶，使酶底物=1 :10000，開始酶切反應(yīng)，維持反應(yīng)溫度為25°C不變。30小時(shí)后，加入6 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH為3. 5停止該反應(yīng)。取酶切液10 yl經(jīng)HPLC分析檢測，根據(jù)甘精胰島素的峰面積計(jì)算酶切后實(shí)際得到的甘精胰島素的量M2，因此甘精胰島素的酶切收率經(jīng)計(jì)算約為83%。實(shí)施例3甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化室溫下，將甘精胰島素前體(由大腸桿菌通過重組DNA技術(shù)制得)I克溶解于200·ml 20 mM Tris-CL緩沖液，pH為9. 0中，使前體的蛋白濃度約為5 g/L?？刂迫芤簻囟葹?°C，接著加入豬胰蛋白酶，使酶底物=1 :10000，開始酶切反應(yīng)，維持反應(yīng)溫度為4°C不變。30小時(shí)后，加入6 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH為3. 5停止該反應(yīng)。取酶切液10 yl經(jīng)HPLC分析檢測，根據(jù)甘精胰島素的峰面積計(jì)算酶切后實(shí)際得到的甘精胰島素的量M2，因此甘精胰島素的酶切收率經(jīng)計(jì)算約為87%。實(shí)施例4甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化室溫下，將甘精胰島素前體(由大腸桿菌通過重組DNA技術(shù)制得)I克溶解于100ml 100 mM Tris-CL緩沖液，pH為11. 0中，使前體的蛋白濃度約為10 g/L?？刂迫芤簻囟葹?5°C，接著加入TPCK處理的豬胰蛋白酶，使酶底物=1 :1000，開始酶切反應(yīng)，維持反應(yīng)溫度為4°C不變。5小時(shí)后，加入6 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH為3. 5停止該反應(yīng)。取酶切液IOyl經(jīng)HPLC分析檢測，根據(jù)甘精胰島素的峰面積計(jì)算酶切后實(shí)際得到的甘精胰島素的量M2，因此甘精胰島素的酶切收率經(jīng)計(jì)算約為84%。實(shí)施例5甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化室溫下，將甘精胰島素前體(由大腸桿菌通過重組DNA技術(shù)制得)I克溶解于100ml 20mM甘氨酸緩沖液，pH為9. 0中，使前體的蛋白濃度約為10 g/L。控制溶液溫度為4°C，接著加入牛胰蛋白酶，使酶底物=1 :10000，開始酶切反應(yīng)，維持反應(yīng)溫度為4°C不變。30小時(shí)后，加入6 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH為3. 5停止該反應(yīng)。取酶切液IOyl經(jīng)HPLC分析檢測，根據(jù)甘精胰島素的峰面積計(jì)算酶切后實(shí)際得到的甘精胰島素的量M2，因此甘精胰島素的酶切收率經(jīng)計(jì)算約為88%。實(shí)施例6甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化室溫下，將甘精胰島素前體(由大腸桿菌通過重組DNA技術(shù)制得)I克溶解于200ml 20mM甘氨酸緩沖液，pH為11. 0中，使前體的蛋白濃度約為5 g/L。控制溶液溫度為25°C，接著加入TPCK處理的牛胰蛋白酶，使酶底物=1 :1000，開始酶切反應(yīng)，維持反應(yīng)溫度為25°C不變。5小時(shí)后，加入6 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH為3. 5停止該反應(yīng)。取酶切液IOyl經(jīng)HPLC分析檢測，根據(jù)甘精胰島素的峰面積計(jì)算酶切后實(shí)際得到的甘精胰島素的量M2，因此甘精胰島素的酶切收率經(jīng)計(jì)算約為85%。
權(quán)利要求
1.一種甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟將甘精胰島素前體溶解于 pH8 11的緩沖液中，控制反應(yīng)體系的溫度為O 37°C，按胰蛋白酶與甘精胰島素前體的質(zhì)量比為1:1000 10000加入胰蛋白酶，反應(yīng)2 40小時(shí)；所述緩沖液選自碳酸氫銨、 Tris、甘氨酸或磷酸鹽的緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述緩沖液為 20 IOOmM 碳酸氫銨，pH8 10 ;或 20 100 mM Tris-CL, pH9 11 ;或 20 IOOmM 甘氨酸，pH9 11。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，其特征在于將甘精胰島素前體按5 10 g/L的濃度溶解于所述緩沖液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述胰蛋白酶為未經(jīng)甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮處理或經(jīng)甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮處理的來自豬或牛的膜蛋白酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，其特征在于用于甘精胰島素前體酶切轉(zhuǎn)化的反應(yīng)溫度為4 25°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，其特征在于用于甘精胰島素前體酶切轉(zhuǎn)化的反應(yīng)時(shí)間為5 30小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘精胰島素前體的酶切轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟將甘精胰島素前體溶解于pH8～11的緩沖液中，控制反應(yīng)體系的溫度為0～37℃，按胰蛋白酶與甘精胰島素前體的質(zhì)量比為11000～10000加入胰蛋白酶，反應(yīng)2～40小時(shí)。本發(fā)明涉及的酶切轉(zhuǎn)化方法能使產(chǎn)生的甘精胰島素量顯著增加，同時(shí)顯著減少副產(chǎn)物，酶切收率高，所得的酶切液后續(xù)純化容易，適合于工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。
文檔編號C12P21/06GK102994600SQ20121053287
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者趙志全, 熊繼元, 于鋒臣 申請人:魯南新時(shí)代生物技術(shù)有限公司