本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種通過基因工程的調(diào)控手段提高裂殖壺菌中多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)：

多不飽和脂肪酸特別是二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸，是人體成長和健康不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)，對維持大腦的正常生理功能、促進(jìn)胎兒及嬰幼兒大腦的生長發(fā)育、維持正常視力、預(yù)防心血管疾病、抑制腫瘤形成等多方面具有顯著功效。由于其具有上述多種重要功能，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

裂殖壺菌是一種單細(xì)胞海洋微藻，因積累大量的對人體有用的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFA)而著稱。裂殖壺菌積累的總油脂含量達(dá)細(xì)胞干重的70％以上，其中，二十二碳六烯酸(DHA，C22:6)占總油脂含量的35％以上，與來源于魚油的傳統(tǒng)DHA資源相比，具有生長速度快、培養(yǎng)周期短、生物積累量高、占地面積少、營養(yǎng)價值高、油質(zhì)品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，因此，裂殖壺菌是一種工業(yè)化生產(chǎn)DHA的最佳微生物之一。

目前，工業(yè)上主要通過發(fā)酵工程的手段提高裂殖壺菌的DHA產(chǎn)量，專利CN 104031843 B是已有專利報道中生物量和DHA產(chǎn)量最高的，發(fā)酵后最終生物量達(dá)到200g/L左右，總脂產(chǎn)量高于100g/L，DHA在總脂肪酸中的含量為56％，DHA產(chǎn)量為50-65g/L，已逐步逼近野生菌株合成DHA的上限，很難再通過工藝優(yōu)化等手段提高藻油的產(chǎn)量及品質(zhì)。因此，需要遺傳工程的手段，從遺傳角度對野生藻株進(jìn)行改造，獲得更高產(chǎn)的DHA工程藻株。

Metz等人(2001)證實裂殖壺菌通過脂肪酸合酶途徑(FAS途徑)和聚酮合酶途徑(PKS途徑)兩種不同的途徑合成脂肪酸。而Wallis等人(2002)也證實了在裂殖壺菌中FAS途徑負(fù)責(zé)合成飽和脂肪酸(主要包括C16:0)，PKS途徑負(fù)責(zé)合成多不飽和脂肪酸(主要包括C22:6)。并且無論是飽和脂肪酸還是多不飽和脂肪酸，其合成均需要前體乙酰輔酶A和還原力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種提高裂殖壺菌多不飽和脂肪酸含量或產(chǎn)量的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種提高裂殖壺菌多不飽和脂肪酸含量或產(chǎn)量的方法，利用基因工程的手段，調(diào)控裂殖壺菌胞內(nèi)轉(zhuǎn)氫酶循環(huán)途徑和/或磷酸戊糖途徑中為脂肪酸合成所需的還原力NADPH的供給，進(jìn)而從裂殖壺菌胞內(nèi)獲得多不飽和脂肪酸及其副產(chǎn)品。

進(jìn)一步，利用基因工程的手段，通過靜態(tài)和/或動態(tài)的方式調(diào)控裂殖壺 菌胞內(nèi)轉(zhuǎn)氫酶循環(huán)途徑和/或磷酸戊糖途徑中為脂肪酸合成所需的還原力NADPH的供給。

所述通過靜態(tài)的方式是以組成型表達(dá)調(diào)節(jié)。

所述組成型表達(dá)調(diào)節(jié)是通過整合手段同源重組18s RNA基因。

利用基因工程的手段，通過調(diào)控轉(zhuǎn)氫酶循環(huán)途徑中蘋果酸酶基因(ME)表達(dá)盒和/或磷酸戊糖途徑中葡萄糖6-磷酸脫氫酶基因(G6PDH)表達(dá)盒，進(jìn)而調(diào)控脂肪酸合成所需的還原力NADPH的供給。

所述蘋果酸酶基因(ME)表達(dá)盒為，由肌動蛋白基因啟動子，蘋果酸酶基因和肌動蛋白基因終止子組成；所述葡萄糖6-磷酸脫氫酶基因(G6PDH)表達(dá)盒為，由肌動蛋白基因啟動子，G6PDH基因和機(jī)動蛋白基因終止子組成。

所述通過動態(tài)的方式是硝酸根誘導(dǎo)系統(tǒng)表達(dá)調(diào)節(jié)。

利用基因工程的手段，通過硝酸根誘導(dǎo)系統(tǒng)(NO3-誘導(dǎo)表達(dá)盒)調(diào)控轉(zhuǎn)氫酶循環(huán)途徑中蘋果酸酶(ME)基因和/或磷酸戊糖途徑中葡萄糖6-磷酸脫氫酶基因(G6PDH)的表達(dá)，從而調(diào)控脂肪酸合成所需的還原力NADPH的供給。

具體為：

1)表達(dá)盒構(gòu)建

所述抗性基因表達(dá)盒為，利用博來霉素抗性基因(zeocin)SEQ ID NO：1及延長因子啟動子(PEF1a)SEQ ID NO：2和細(xì)胞色素c終止子(cycTT)SEQ ID NO：3構(gòu)建。

所述硝酸根誘導(dǎo)表達(dá)盒(NO^3-誘導(dǎo)表達(dá)盒)為，以葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)SEQ ID NO：4或蘋果酸酶(ME)SEQ ID NO：5做為報告基因，選擇細(xì)柱藻硝酸還原酶基因啟動子SEQ ID NO：6和終止子SEQ ID NO：7作為調(diào)控序列構(gòu)建。

所述蘋果酸酶基因表達(dá)盒為，由肌動蛋白基因啟動子SEQ ID NO：8，蘋果酸酶基因和肌動蛋白基因終止子SEQ ID NO：9組成。

所述G6PDH表達(dá)盒為，由肌動蛋白基因啟動子，G6PDH基因和機(jī)動蛋白基因終止子組成。

2)組成型調(diào)控質(zhì)粒或誘導(dǎo)型調(diào)控質(zhì)粒構(gòu)建

利用已構(gòu)建的各種表達(dá)盒元件進(jìn)一步構(gòu)建各種組成型調(diào)控質(zhì)?；蛘T導(dǎo)型調(diào)控質(zhì)粒。

構(gòu)建組成型蘋果酸酶基因過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1521SEQ ID NO：10，該質(zhì)粒包含18S rRNA上游同源臂SEQ ID NO：11、18S rRNA下游同源臂SEQ ID NO：12，蘋果酸酶基因表達(dá)盒與博來霉素抗性基因表達(dá)盒。

構(gòu)建組成型葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)基因過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1420SEQ ID NO：13。該質(zhì)粒包含18S rRNA同源臂SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12，G6PDH基因表達(dá)盒與博來霉素抗性基因表達(dá)盒。

構(gòu)建誘導(dǎo)型蘋果酸酶基因過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1622SEQ ID NO：14，該質(zhì) 粒包含18S rRNA上游同源臂SEQ ID NO：11、18S rRNA下游同源臂SEQ ID NO：12，蘋果酸酶基因硝酸根誘導(dǎo)表達(dá)盒與博來霉素抗性基因表達(dá)盒。

構(gòu)建誘導(dǎo)型葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)基因過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1723SEQ ID NO：15。該質(zhì)粒包含18S rRNA同源臂SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12，G6PDH基因硝酸根誘導(dǎo)表達(dá)盒與博來霉素抗性基因表達(dá)盒。

同源重組位點(diǎn)為18S rRNA基因SEQ ID NO：16。

3)感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化

(1)挑單菌落接種到5mL復(fù)合培養(yǎng)于25℃孵育12h，取2mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到50ml復(fù)合培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm＝6-8。

(2)轉(zhuǎn)入50mL離心管，置冰上冷卻10min，4℃，2000g離心5min收集菌體。

(3)用20mL 1M冰冷的山梨醇洗滌一次，然后用buffer A(0.6M山梨醇，0.1M醋酸鋰，10mM DTT)重懸，置于冰上30min。

(4)4℃，2000g離心5min收集菌體，3mL buffer B(10Mm磷酸氫二鉀，5mM氯化鎂，1M山梨醇)重懸。

(5)取100uL上述細(xì)胞加入2-5ug DNA混勻后，置于0.2cm電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad)，冰上放置10min后置于電脈沖儀轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)參數(shù)包括：電壓(0.8-1.6KV)、占空比(5％-50％)、頻率(500-2000HZ)、脈沖數(shù)(10-60次)。

(6)轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)接至復(fù)合或合成培養(yǎng)基中，于25℃復(fù)蘇6-12h，然后涂布含有30ug/mL博來霉素的瓊脂平板，25℃培養(yǎng)3-5天。

所述復(fù)合培養(yǎng)基為葡萄糖60g/L，酵母浸出物20g/L，海水晶15g/L，pH＝6.5。

所述合成培養(yǎng)基為葡萄糖60g/L，硫酸銨6g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂1g/L，氯化鈉10g/L，硫酸鈉2g/L，維生素B₁ 30mg/L，維生素B₆ 30mg/L，泛酸鈣10mg/L，生物素3mg/L，維生素B₁₂ 30mg/L。

所述多不飽和脂肪酸包含但不限于二十二碳六烯酸，二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、十八碳三烯酸等。

本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有以下顯著特點(diǎn)和積極效果：

本發(fā)明利用基因工程的手段，改變裂殖壺菌胞內(nèi)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶或蘋果酸酶的表達(dá)活性，改變還原力NADPH的供給，可以改變裂殖壺菌的脂肪酸組成，提高多不飽和脂肪酸的含量及產(chǎn)量。此方法也可用于其他微生物脂肪酸產(chǎn)品的遺傳工程和性能改良。

本發(fā)明的有益之處在于通過調(diào)控還原力的供給方式，顯著提高了多不飽和脂肪酸的產(chǎn)量，獲得高產(chǎn)多不飽和脂肪酸的工程菌株，為多不飽和脂肪酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的技術(shù)與方法。

附圖說明

圖1為裂殖壺菌合成脂肪酸所需還原力NADPH的可能供應(yīng)途徑。 (G6PDH：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；Gnd：6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶；ME：蘋果酸酶)。磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的NADPH可能主要為PKS途徑提供還原力；轉(zhuǎn)氫酶循環(huán)途徑可能主要為FAS途徑提供還原力。

圖2為本發(fā)明實施例提的ME過表達(dá)工程菌株SD006::ME構(gòu)建示意圖及PCR驗證瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1-2：質(zhì)粒pGZ1521對照；泳道3-4：野生菌株對照；泳道5-6：工程菌株SD006::ME。

圖3為本發(fā)明實施例提的G6PDH過表達(dá)工程菌株SD006::G6PDH構(gòu)建示意圖及PCR驗證瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1：野生型對照，泳道2-4：工程菌株SD006::G6PDH。

具體實施方式

實施例1：來源于轉(zhuǎn)氫酶循環(huán)途徑的還原力對裂殖壺菌脂肪酸合成的影響。

通過在裂殖壺菌細(xì)胞內(nèi)組成型過表達(dá)蘋果酸酶基因增強(qiáng)轉(zhuǎn)氫酶循環(huán)途徑。

首先，通過現(xiàn)有技術(shù)方式利用同源重組方法在商業(yè)化質(zhì)粒PMD-18T的基礎(chǔ)上構(gòu)建蘋果酸酶基因過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1521。該質(zhì)粒包含18S rRNA上游同源臂、18S rRNA下游同源臂，蘋果酸酶基因表達(dá)盒與博來霉素抗性基因表達(dá)盒。

然后，轉(zhuǎn)化裂殖壺菌。(1)挑野生型單菌落接種到5mL復(fù)合培養(yǎng)于25℃孵育12h，取2mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到50ml復(fù)合培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm＝6。(2)轉(zhuǎn)入50mL離心管，置冰上冷卻10min，4℃，2000g離心5min收集菌體。(3)用20mL 1M預(yù)冷的山梨醇洗滌一次，然后用buffer A(0.6M山梨醇，0.1M醋酸鋰，10mM DTT)重懸，置于冰上30min。(4)4℃，2000g離心5min收集菌體，3mL buffer B(10mM磷酸氫二鉀，5mM氯化鎂，1M山梨醇)重懸。(5)取100uL上述細(xì)胞加入2ug過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1521混勻后，置于0.2cm電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad)，冰上放置10min后置于電脈沖儀轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)參數(shù)包括：電壓0.8KV、占空比5％、頻率2000Hz、脈沖數(shù)60次。

轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)接至復(fù)合培養(yǎng)基中，于25℃復(fù)蘇6h，然后涂布含有30ug/mL博來霉素的瓊脂平板，25℃培養(yǎng)5天。獲得過表達(dá)工程藻株SD006::ME。

最后，對工程菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，于發(fā)酵終點(diǎn)收集細(xì)胞，檢測蘋果酸酶酶活變化，提取總油脂，利用氣相色譜分析脂肪酸組成及含量(Song xj等，2013)。具體為稱取一定量的菌體，按6mL/g的比例加入4mol/L鹽酸，振蕩混勻，室溫放置30min后，沸水浴煮3min，-20℃速冷后加入2倍體積的氯仿－甲醇混合溶劑，充分振蕩后5000r/min離心5min，取氯仿層，加等體積的0.1％氯化鈉溶液，混勻5000r/min離心5min，取氯仿層移至干燥的試管中，揮發(fā)除去氯仿，得到油脂，然后50℃真空干燥至恒重，稱量適量油脂溶解于1mL氯仿中，加入2％H2SO4－甲醇溶液2.5mL和100ul十九酸，85℃水浴加熱2.5h。冷卻至室溫，加入1mL正己烷和1mL飽和氯化鈉 溶液，混勻，靜置分層后取上層，經(jīng)0.22um尼龍膜過濾后，進(jìn)行氣相色譜檢測色譜條件：Agilent C-6890型氣相色譜儀，色譜柱：HP-INNOWax(30m×250um×0.25um，安捷倫公司)。采用程序升溫，初始溫度100℃，按15℃/min升到240℃，保持10min；進(jìn)樣口溫度250℃；FID檢測器，檢測器溫度260℃。

復(fù)合培養(yǎng)基為葡萄糖60g/L，酵母浸出物20g/L，海水晶15g/L，pH＝6.5。

結(jié)果表明，蘋果酸酶基因整合到裂殖壺菌基因組(圖2)，成功獲得蘋果酸酶基因過表達(dá)工程藻株SD006::ME。與野生型菌株比較，工程菌株的蘋果酸酶比活提高2-6倍，生物量提高13.4％，總脂肪含量提高18.7％，總不飽和脂肪酸產(chǎn)量提高14.8％。

實施例2：來源于磷酸戊糖途徑的還原力對裂殖壺菌脂肪酸合成的影響。

通過在裂殖壺菌細(xì)胞內(nèi)組成型過表達(dá)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因增強(qiáng)磷酸戊糖途徑。

首先，通過現(xiàn)有技術(shù)方式利用同源重組方法在商業(yè)化質(zhì)粒PMD-18T的基礎(chǔ)上構(gòu)建葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1420。該質(zhì)粒包含18SrRNA上下游同源臂，G6PDH基因表達(dá)盒與博來霉素抗性基因表達(dá)盒。

然后，轉(zhuǎn)化裂殖壺菌。(1)挑野生型單菌落接種到5mL復(fù)合培養(yǎng)于25℃孵育12h，取2mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到50ml復(fù)合培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm＝8。(2)轉(zhuǎn)入50mL離心管，置冰上冷卻10min，4℃，2000g離心5min收集菌體。(3)用20mL 1M預(yù)冷的山梨醇洗滌一次，然后用buffer A(0.6M山梨醇，0.1M醋酸鋰，10mM DTT)重懸，置于冰上30min。(4)4℃，2000g離心5min收集菌體，3mL buffer B(10mM磷酸氫二鉀，5mM氯化鎂，1M山梨醇)重懸。(5)取100uL上述細(xì)胞加入5ug過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1420混勻后，置于0.2cm電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad)，冰上放置10min后置于電脈沖儀轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)參數(shù)包括：電壓1.6KV、占空比50％、頻率500Hz、脈沖數(shù)10次。

轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)接至復(fù)合培養(yǎng)基中，于25℃復(fù)蘇12h，然后涂布含有30ug/mL博來霉素的瓊脂平板，25℃培養(yǎng)3天。獲得過表達(dá)工程藻株SD006::G6PDH。

最后，對工程菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，于發(fā)酵終點(diǎn)收集細(xì)胞，檢測酶活變化，提取總油脂，利用氣相色譜分析脂肪酸組成及含量。

復(fù)合培養(yǎng)基為葡萄糖60g/L，酵母浸出物20g/L，海水晶15g/L，pH＝6.5。

結(jié)果表明，G6PDH基因成功整合到裂殖壺菌基因組(圖3)，獲得G6PDH過表達(dá)工程菌株SD006::G6PDH。與野生型菌株比較，工程菌株的G6PDH比活提高3-9倍，生物量提高6.4％，總脂肪含量提高8.7％。表1給出了野生菌株和工程菌株的脂肪酸組成變化。

表1野生菌株和工程菌株的脂肪酸組成變化

實施例3：來源于條件誘導(dǎo)過表達(dá)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶對裂殖壺菌脂肪酸合成的影響。

通過在裂殖壺菌細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型過表達(dá)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因增強(qiáng)磷酸戊糖途徑。

首先，通過現(xiàn)有技術(shù)方式利用同源重組方法在商業(yè)化質(zhì)粒PMD-18T的基礎(chǔ)上構(gòu)建誘導(dǎo)型葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)基因過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1723SEQ ID NO：15。該質(zhì)粒包含18S rRNA上下游同源臂，G6PDH基因硝酸根誘導(dǎo)表達(dá)盒與博來霉素抗性基因表達(dá)盒。

然后，轉(zhuǎn)化裂殖壺菌。(1)挑野生型單菌落接種到5mL復(fù)合培養(yǎng)于25℃孵育12h，取2mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到50ml復(fù)合培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm＝7。(2)轉(zhuǎn)入50mL離心管，置冰上冷卻10min，4℃，2000g離心5min收集菌體。(3)用20mL 1M預(yù)冷的山梨醇洗滌一次，然后用buffer A(0.6M山梨醇，0.1M醋酸鋰，10mM DTT)重懸，置于冰上30min。(4)4℃，2000g離心5min收集菌體，3mL buffer B(10mM磷酸氫二鉀，5mM氯化鎂，1M山梨醇)重懸。(5)取100uL上述細(xì)胞加入4ug過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1723混勻后，置于0.2cm電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad)，冰上放置10min后置于電脈沖儀轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)參數(shù)包括：電壓1.4KV、占空比30％、頻率1000Hz、脈沖數(shù)30次。

轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)接至合成培養(yǎng)基中，于25℃復(fù)蘇12h，然后涂布含有30ug/mL博來霉素的瓊脂平板，25℃培養(yǎng)3天。獲得過表達(dá)工程藻株SD006::G6PDH2。

最后，對工程菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，于40h后加入3g/L KNO₃進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)酵終點(diǎn)收集細(xì)胞，提取總油脂，利用氣相色譜分析脂肪酸組成及含量。

合成培養(yǎng)基為葡萄糖60g/L，硫酸銨6g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂1g/L，氯化鈉10g/L，硫酸鈉2g/L，維生素B₁ 30mg/L，維生素B₆ 30mg/L，泛酸鈣10mg/L，生物素3mg/L，維生素B₁₂ 30mg/L，pH＝6.5。

獲得G6PDH過表達(dá)工程菌株SD006::G6PDH2。與野生型菌株比較，生物量提高9.6％，總脂肪含量提高10.7％。表2給出了野生菌株和工程菌株的脂肪酸組成變化。

表2野生菌株和工程菌株的脂肪酸組成變化

實施例4：來源于誘導(dǎo)型蘋果酸酶對裂殖壺菌脂肪酸合成的影響。

通過在裂殖壺菌細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型過表達(dá)蘋果酸酶基因增強(qiáng)轉(zhuǎn)氫酶循環(huán)途徑。

首先，通過現(xiàn)有技術(shù)方式利用同源重組方法在商業(yè)化質(zhì)粒PMD-18T的基礎(chǔ)上構(gòu)建誘導(dǎo)型蘋果酸酶基因過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1622SEQ ID NO：14，該質(zhì)粒包含18S rRNA上游同源臂、18S rRNA下游同源臂，蘋果酸酶基因硝酸根誘導(dǎo)表達(dá)盒與博來霉素抗性基因表達(dá)盒。

然后，轉(zhuǎn)化裂殖壺菌。(1)挑野生型單菌落接種到5mL復(fù)合培養(yǎng)于25℃孵育12h，取2mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到50ml復(fù)合培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm＝7。(2)轉(zhuǎn)入50mL離心管，置冰上冷卻10min，4℃，2000g離心5min收集菌體。(3)用20mL 1M預(yù)冷的山梨醇洗滌一次，然后用buffer A(0.6M山梨醇，0.1M醋酸鋰，10mM DTT)重懸，置于冰上30min。(4)4℃，2000g離心5min收集菌體，3mL buffer B(10mM磷酸氫二鉀，5mM氯化鎂，1M山梨醇)重懸。(5)取100uL上述細(xì)胞加入3ug過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1622混勻后，置于0.2cm電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad)，冰上放置10min后置于電脈沖儀轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)參數(shù)包括：電壓1.2KV、占空比40％、頻率1500Hz、脈沖數(shù)40次。

轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)接至合成培養(yǎng)基中，于25℃復(fù)蘇6h，然后涂布含有30ug/mL博來霉素的瓊脂平板，25℃培養(yǎng)5天。獲得過表達(dá)工程藻株SD006::ME2。

最后，對工程菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，于40h后加入3g/L KNO₃進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)酵終點(diǎn)收集細(xì)胞，提取總油脂，利用氣相色譜分析脂肪酸組成及含量。

合成培養(yǎng)基為葡萄糖60g/L，硫酸銨6g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂1g/L，氯化鈉10g/L，硫酸鈉2g/L，維生素B₁ 30mg/L，維生素B₆ 30mg/L，泛酸鈣10mg/L，生物素3mg/L，維生素B₁₂ 30mg/L，pH＝6.5。

結(jié)果表明，成功獲得蘋果酸酶基因過表達(dá)工程藻株SD006::ME2。與野生型菌株比較，工程菌株的蘋果酸酶比活提高5倍，生物量提高11.2％，總脂肪含量提高12.6％，總不飽和脂肪酸產(chǎn)量提高11.9％。

序列為：

SEQ ID NO：1Zoecin抗性基因(zeo^R)：

Atggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactga

SEQ ID NO：2延長因子啟動子(PEF1a)：

Aagttttataacctacacccctggtggggtaggggcgaattctatgtacacagcacctcagaacttgcgcgcgttccgtgacaaatgaggggtgtggcggc gcattcggccgcatcgccacattcagatatctaacatacccccccttcgcgatgagtggcaggcgaggcggattcgctcgcgagaggcgaggtgccacagcagaccagtaacgaggagccaaggtaggtgaccaccgacgactacgaccacgaccacagccacggcggctgcagccacgggacgcctcgcatggcagcgcagcagcaccagcaacgacagctacaaggagtgcagggccgatctagacgcgccggagccgcacgaccaatgccgacgcaacgctgattcttctggattccctctatacattcatatatatgaagagaagcggatgagacggcctgcgaataaatgaatggcttggagtttgcttgcttgccgtatgctcgaaagtgcgtgtgcagacacaggcacgaccgagaggacaacagtctgtgcttacctcaccagcacattcttgcaacgccattcgaagcacgcgaaatcttgtggctcagagcaaaaggcatccgtggtacgggaacgtggggaacgctatcaatttggaattcaaaatgagtgaaccagacaactaactgtgacttgaactgttgctccacgcatcaaaaccaaacccttaacagaagtagaccagttcgaagctactagcaccaaacaaa

SEQ ID NO：3細(xì)胞色素C終止子(CYCTT)：

Cacgtccgacgcggcccgacgggtccgaggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaa

SEQ ID NO：4G6PDH:

atgctcaaaagctttatctccgaggaggagtaccatgtggcagactttcttgacctgaagcaggagccatggctcgaggaaaagctctctgtggtcgttttcggcgcatctggtgatcttgccaagaaaaagacttacccttcaatctttgatttgcaccgcgttggtgcattgccccgtgagaccatcgtcatgggctacgctcggtccaagatgagtgacgaggactttcgccagcgcatccgcgactaccttaaggatcgtggcaccgaggaggatgttgagcgcttcttggacatctgtatctaccgtaacggacagtacgacggcgtggaggagttccaagcgatctcagatgagcttcgtgaacttcacgaatgtgaaaaggaggacgtcgagaaccgcatgttctaccttgccattcctcctgctcagttcctcaactccgtacaaaccactcgtgaggctggcatggctaaaaatggctggacccgcgtcgttgtggagaagccctttggtcatgacaccgagtccgccaagaaactcggcattgacatggccgagttctttgatgagtctcacctctaccgcatcgaccactaccttggcaaggagatggttcagaaccttgtcacccttcgcttcggcaacgccttcctcgaacctctatttaatcgtgaccacattgcatccgtaatcatctctttcaaggagcccttcggcacagaaggtcgcggtggctactttgactccaacggaattatccgtgacgtcatgcagaaccacctcatgcaacttctcagtatcatcgcaatggagccccccgtcaaggttgcaggacacaccaacgacggcactgattactctcgctacgttcgcgacgaaaaggtcaaggtcctttctgccatcgcgccctggaggctcgaagatgttgtccttggccaatatgtttccaacggtaccgaccccggttacctcgacgacgacaccgtgcctcctgactcaaacatccccacttacgcagctgtacgtatgttcattgataacaaacgctgggatggcgtgcccttcatcatgaaggcaggaaaggctctcgatgagaagaaatgcgaggtccgtatccagtttaaagatcctgcaggagctgctgccatgtttggccagagcgagatccctcgcaacgaactcgtgcttgttcttcagccccaggagagcatctacatgaagcttaacgtgaagaagcccggtctcgccacaagcattcttcagagcgagcttgacctaaactaccacgaccgctacgacaagcacgccattcctgaggcctacactcgcctcttgcttgatgtccttcgtggaaagcaggccacctttgtgcgcgatgatgaacttgtcgcagcatgggagattgtcacccctctgcttgaggctatcgagagcggtggagtcaagcccatcccgtacacttacggttcgcgtggacctgctgaggccgatgagctcgtgcgcgaatctggataccgtcgcaacgccaagtacgctgatcattacaatgactggaagaccaaaaaatcgaagcagcatggcaagagtaagtaa

SEQ ID NO：5ME:

atgggtctcttcaaccgcaagagcgtctcccacaagcccgccaccgagagctcaatcgctcttaaggcatccagccgtggcaccgaggccaccagcattgagcgtgtcaggaatccccacttcaacaagggcacctccttcaccgctgaagagcgcaagcagtatggtcttgagggtctcgttcccagcgtcgtggagtccatcgatctccaggccaagcgtgagctccagcaccttcgtcgcaagcccagccccatcgagaagtacgtcttccttatgggcctcctcgaccgcaacgttgagctcttctacaaaatcgtaactgagaacgtctccgaatgcatgcccctcgtgtacacgcctaccgtaggccaagcctgccaagagttccacctcatctaccagcagcccaagggtctctatgtctctctcgaggaccttggcaacgtggagactctcgtgaacaactggcctgaggacaatgttacctgcattgtcatgaccgacggaggccgtatcctcggactcggagatctcggtgccaacggtctcggaatcccccaaggtaagctccagctctactctgcctgcgccggaatcccccaccaccagtgcctgccggtcattttggacgtcggcaccaacaacaagaccctgcttgaagatgagctgtacatgggtctccgccgtgaacgtgaacgtggcgagacttacgaccacctcgtcaaggagttcatggccgccgcccagaagcgctggggaaggtctctcttgatccagttcgaggactttgacaacaccaacgcattcagactcctcgaggagacccgcaactcatacacaaccttcaacgacgatatccagggtaccgcggcagtctcgcttgctggagttctggcttcgcttagggtcacaagcaaggttgaaggcggcaagaagaagctccgcgaccacacctttgtgtttatgggcgctggagaagctggtacaggtattgccaacctcattgcacatgccatccaggaggaggctgttgacgacggcattacccccatctctgaggacgatgcaagacgccagatctggctcgttgacagcaagggacttgtcaccaagacccgcggagacaacggagaactccagcaccacaagcttgactttgcccatgagctgtctgaggacctcatcgagaaggtcgcaggcaccgaatgggaagtcaaggatggcaaggtcacctcgcttgagcaggctgtgcgtatcatgaacccgactgccatcattggtgtctgcgccatgcctaataccttcaccgagagcattattgagtacatggctgagattaatgaggcaccccttgtctttgccctgagtaaccctacttccaaggccgagtgcactgctgagcaggcatacaagtggtctgatggacgtgccatctttgtcagcggatctcccttcgaccccgtcgacatcaccctcagctctggagaggaggtcaccaagtaccctggccagggtaacaacgcatacatcttccccggtcttggccttggagtgcttgctgccaaggccacgactatccccaacgagctcctttacgtgtctgcccaggcgcttgctgagcaggtcgttgaagacgatcttaacaacggacgcatgtaccctcaccttgacaacatccgcgaggtttcggccaacattgcataccgtgttgctgagcgtgcctttcagctctccatcgcatcggcgaagaagcctgctgacctcgaggcatatgtccgctcctgcatggctaaccctggatggtga

SEQ ID NO：6硝酸還原酶基因啟動子

Gcagttgcctaccgaaaagctcacggagatgaagaatggacgccctttcattttgaagcggaggatatggaagaagtgacggggagtaacggagctcattatgctgctcatacgggaaatgttgagactttgatgcatatcatccagaatgagagaattgatatggtgcatgaaacggatgggaatggatggctgcctatt catgaggctgcacgaagtggtcatgtggagatcgtgcagattctgattgagcatggggcggatgtggatagtaggacggaatggggggagggacattcggtgttgaacattgcgacgcagtaccacgaggaggatagttcaatcattcagtacttgttgagtttgggggcgatgaatatcattccttggcctgaggaggaggagctttagatgcgacaacatgagatgttttaggagtgtgtggggtaggaaggagaagtatctagtattgcaagggtcgatgtttggaagtcagacggatcaattacgatctatactggagttgcagtggacaagaacatgtgggacctcgataaaggatatggtgcttgggcgggtgtcatcagatacactgcctagagggcaattgattgcggtatatgaaacgtgcttcttgttgctgtaaaaataactcgtcgaacaagtcatccgactagcgcctctggtgatcaaaccacgcacgtacggattggtttgatggttatcctcggattggtatccttagaacatcttcgaaggttctaggagactacccgcaaaacggatggtatttccccccaacatccaaaattggaatgccacgtcatctgcacttccggactctggcagcagcaaaatggcgcgctcgaccacatcacggttctccaccctcttccgacagcaccaacatctctttccggaagaaccaagctggaggatgaagatgacgatgagaagaggtgtggacggggtgaaaagaggctcgggaaggcttttcggcaagcacagagcttttgcacataacaacctctcacaattcaccaacccatccaattgacagcctccatcttttaacatttcaacacaaaggaaccaacaactatcataatc

SEQ ID NO：7硝酸還原酶基因終止子

Actagttgaggatgctcatcgttttgactttgttggatgacgcctcttgtacatactgattagacatgggagtgttggttgaattgtagatagtttacaccggctgttaactgaagagatactattacactattcatcatcattccaattgatacgtcgccgccacgcactgctcatccatagaaccctcagacacacttcacctcaaaggttcgtatctccatcggctccaaagaaaccacactgttgccttgctccagcttacgactatcctccttgaaatcatcatcgttccaccactgaaactgtctctgttcccactcatctcttctctgattaccagagagtgtcgtttccgtgatggagactactttgcgagaaggaaacaagacgccaagatccacctcaaccggaagggagtattgatgactttctcccactccgtactgatgcccaagcctgacaagataggtgtcgtcttgctctagtgatgcaaacgttaccagcatgatattatcaggca

SEQ ID NO：8機(jī)動蛋白啟動子(Pactin)：

Tgtaagtttaatttattattagtagcaatcatatctcatatatggaatctttttctaaagataaagcaaaaacaaacattattttggaaataaaaagagttgttaatcaaagcgtaagacgtcctatacagctgcctgtatgatgggacattaggtataaattggtcctaagaaggttcacccaagtcattggccattcaagttgagtaaagctaagtgattcaagttgttttgaccttgagttttttaccgcaagttaaaagatctcaactcagtacctctgactacctcgtgagagtggccattggcttttgatatttacttgtgtaagaagagttcctcccgacggcaggtgggcagtagtacctaccaataggagaagcgctgcgtgctattcctgaagtacacaccacgtaggtgagtgagttttattattctttttattttaaacatagtgtgtatgaagcttactatagttagttaattttagaaataccataccataatatatcatctttatatagtcgggatacaacagaaaagggcaatgaaaatcgactttgggcgggcgagtgaaggcgagagtccgcagctgctctggccttcgggtcgtgtccgcactcacattggtagtctgtagacatgatttggaccttctgtaggcagagagtacctactaggagcgtcttccaataatcgcctcgatttccccaacctggatgatgctggtggctcaacttgaactaaaacctgaggatgaaggagccactcgattccacgcacacccttcaggtggtcatttgcaggttagcgatagaggtatctctcacaaacactgtaaatagttttgtgagtaaatacacacacgagcactcctataaagggtgtgtaagctaaggaaaatcccctcgcaacacactgagtatcaaaagaggaacctacgactaagaaggttatcataaatggatgtaatcagaggaggtaacactgtaaatttatggagacagtggagggtctttgggcacgaagatctgcaagcgcgccatcagcagatccgcaaccttcgagctcaagaagcaactcaacagtagaagaacaagcacccaactagcaaaatggctgacgacgaagttcaagcc

SEQ ID NO：9肌動蛋白終止子(actinTT)：

Attggagtgatggaatgccctctccgtgtggtgtatccgattgacaaatcttaaactcctccaagtagtaggcttcagtgcttccttggaattgagacatgaaatcatgcaacatcccaccgacaggatttatgtagtatcgcatcctctcttgttttacactctttgcccataaattcatgaacactttcttctcttttctctcaaaaaactagcttaatttcatttaagtcatgaagactaccaatgacaatcttgtcaacaaccaaacaacagcttaagtttcatctaacttaagagactaccatgacaatcttttcacttagacaaacattatagtgaatgcattgcatcataatatatttattaggctttgacttcaactatgtccaggcttttgggcaccaaggaccacagttacaaaagcagaagatagttatgttgctatgaatcaaatgaaaatgaacaaaaaagatttcaggctgatatgtttcgatttgattttttgctcaaatgcaattaaaagaagacagacctcaaggtcaaatgtgattattagaatcttggaacgaatccgcacatatccagttaccaaattgttctcgcgccattgtgtaaattcgctttatgatgtagcaatcacgtcccaacccctaatcttgtaaagagaagcagctatagctcagtggcagagcgtccgcctgacacgcggaaggtcacgagttcgatcctcgttagctg

SEQ ID NO：10ME過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1521：

tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattagaactcggtacgcgcggatcttccagagatccatggtaattctggaaataatacatgctgtaagagccctgtatggggctgcacttattagattgaagccgattttattggtgaatcatgataattgagcagattgacatttttgtcgatgaatcgtttgagtttctgccccatcagttgtcgacggtagtgtattggactacggtgactataacgggtgacggagagttagggctcgactccggagagggagcctgagagacggctaccatatccaaggatagcagcaggcgcgtaaattacccactgtggactccacgaggtagtgacgagaaatatcgatgcgaagcgtgtatgcgttttgctatcggaatgagagcaatgtaaaaccctcatcgaggatcaactggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccagaagcatatgctaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaatttctggcatgggcgaccggtgctttccctgaatggggattgattgtctgtgttgccttggccatctttttcttttctttataggggagaaatctttcactgtaatcaaagcagagt gttccaagcaggtcgtatgaccggtatgtttattatgggatgataagataggacttgggtgctattttgttggtttgcacgcctgagtaatggttaataggaacagttgggggtattcgtatttaggagctagaggtgaaattcttggatttccgaaagacgaactagagcgaaggcatttaccaagcatgttttcattaatcaagaacgaaagtctggggatcgaagatgattagataccatcgtagctgtaagtttaatttattattagtagcaatcatatctcatatatggaatctttttctaaagataaagcaaaaacaaacattattttggaaataaaaagagttgttaatcaaagcgtaagacgtcctatacagctgcctgtatgatgggacattaggtataaattggtcctaagaaggttcacccaagtcattggccattcaagttgagtaaagctaagtgattcaagttgttttgaccttgagttttttaccgcaagttaaaagatctcaactcagtacctctgactacctcgtgagagtggccattggcttttgatatttacttgtgtaagaagagttcctcccgacggcaggtgggcagtagtacctaccaataggagaagcgctgcgtgctattcctgaagtacacaccacgtaggtgagtgagttttattattctttttattttaaacatagtgtgtatgaagcttactatagttagttaattttagaaataccataccataatatatcatctttatatagtcgggatacaacagaaaagggcaatgaaaatcgactttgggcgggcgagtgaaggcgagagtccgcagctgctctggccttcgggtcgtgtccgcactcacattggtagtctgtagacatgatttggaccttctgtaggcagagagtacctactaggagcgtcttccaataatcgcctcgatttccccaacctggatgatgctggtggctcaacttgaactaaaacctgaggatgaaggagccactcgattccacgcacacccttcaggtggtcatttgcaggttagcgatagaggtatctctcacaaacactgtaaatagttttgtgagtaaatacacacacgagcactcctataaagggtgtgtaagctaaggaaaatcccctcgcaacacactgagtatcaaaagaggaacctacgactaagaaggttatcataaatggatgtaatcagaggaggtaacactgtaaatttatggagacagtggagggtctttgggcacgaagatctgcaagcgcgccatcagcagatccgcaaccttcgagctcaagaagcaactcaacagtagaagaacaagcacccaactagcaaaatggctgacgacgaagttcaagccgctagcatgggtctcttcaaccgcaagagcgtctcccacaagcccgccaccgagagctcaatcgctcttaaggcatccagccgtggcaccgaggccaccagcattgagcgtgtcaggaatccccacttcaacaagggcacctccttcaccgctgaagagcgcaagcagtatggtcttgagggtctcgttcccagcgtcgtggagtccatcgatctccaggccaagcgtgagctccagcaccttcgtcgcaagcccagccccatcgagaagtacgtcttccttatgggcctcctcgaccgcaacgttgagctcttctacaaaatcgtaactgagaacgtctccgaatgcatgcccctcgtgtacacgcctaccgtaggccaagcctgccaagagttccacctcatctaccagcagcccaagggtctctatgtctctctcgaggaccttggcaacgtggagactctcgtgaacaactggcctgaggacaatgttacctgcattgtcatgaccgacggaggccgtatcctcggactcggagatctcggtgccaacggtctcggaatcccccaaggtaagctccagctctactctgcctgcgccggaatcccccaccaccagtgcctgccggtcattttggacgtcggcaccaacaacaagaccctgcttgaagatgagctgtacatgggtctccgccgtgaacgtgaacgtggcgagacttacgaccacctcgtcaaggagttcatggccgccgcccagaagcgctggggaaggtctctcttgatccagttcgaggactttgacaacaccaacgcattcagactcctcgaggagacccgcaactcatacacaaccttcaacgacgatatccagggtaccgcggcagtctcgcttgctggagttctggcttcgcttagggtcacaagcaaggttgaaggcggcaagaagaagctccgcgaccacacctttgtgtttatgggcgctggagaagctggtacaggtattgccaacctcattgcacatgccatccaggaggaggctgttgacgacggcattacccccatctctgaggacgatgcaagacgccagatctggctcgttgacagcaagggacttgtcaccaagacccgcggagacaacggagaactccagcaccacaagcttgactttgcccatgagctgtctgaggacctcatcgagaaggtcgcaggcaccgaatgggaagtcaaggatggcaaggtcacctcgcttgagcaggctgtgcgtatcatgaacccgactgccatcattggtgtctgcgccatgcctaataccttcaccgagagcattattgagtacatggctgagattaatgaggcaccccttgtctttgccctgagtaaccctacttccaaggccgagtgcactgctgagcaggcatacaagtggtctgatggacgtgccatctttgtcagcggatctcccttcgaccccgtcgacatcaccctcagctctggagaggaggtcaccaagtaccctggccagggtaacaacgcatacatcttccccggtcttggccttggagtgcttgctgccaaggccacgactatccccaacgagctcctttacgtgtctgcccaggcgcttgctgagcaggtcgttgaagacgatcttaacaacggacgcatgtaccctcaccttgacaacatccgcgaggtttcggccaacattgcataccgtgttgctgagcgtgcctttcagctctccatcgcatcggcgaagaagcctgctgacctcgaggcatatgtccgctcctgcatggctaaccctggatggtgagcggccgcattggagtgatggaatgccctctccgtgtggtgtatccgattgacaaatcttaaactcctccaagtagtaggcttcagtgcttccttggaattgagacatgaaatcatgcaacatcccaccgacaggatttatgtagtatcgcatcctctcttgttttacactctttgcccataaattcatgaacactttcttctcttttctctcaaaaaactagcttaatttcatttaagtcatgaagactaccaatgacaatcttgtcaacaaccaaacaacagcttaagtttcatctaacttaagagactaccatgacaatcttttcacttagacaaacattatagtgaatgcattgcatcataatatatttattaggctttgacttcaactatgtccaggcttttgggcaccaaggaccacagttacaaaagcagaagatagttatgttgctatgaatcaaatgaaaatgaacaaaaaagatttcaggctgatatgtttcgatttgattttttgctcaaatgcaattaaaagaagacagacctcaaggtcaaatgtgattattagaatcttggaacgaatccgcacatatccagttaccaaattgttctcgcgccattgtgtaaattcgctttatgatgtagcaatcacgtcccaacccctaatcttgtaaagagaagcagctatagctcagtggcagagcgtccgcctgacacgcggaaggtcacgagttcgatcctcgttagctggttgcaaattaaagccttcgagcgtcccaaaaccttctcaagcaaggttttcagtataatgttacatgcgtacacgcgtctgtacagaaaaaaaagaaaaatttgaaatataaataacgttcttaatactaacataactataaaaaaataaatagggacctagacttcaggttgtctaactccttccttttcggttagagcggatgtggggggagggcgtgaatgtaagcgtgacataactaattacatgatatcgacaaaggaaaagggggacggatctccgaggcctcggacccgtcgggccgcgtcggacgtgtcagtcctgctcctcggccacgaagtgcacgcagttgccggccgggtcgcgcagggcgaactcccgcccccacggctgctcgccgatctcggtcatggccggcccggaggcgtcccggaagttcgtggacacgacctccgaccactcggcgtacagctcgtccaggccgcgcacccacacccaggccagggtgttgtccggcaccacctggtcctggaccgcgctgatgaacagggtcacgtcgtcccggaccacaccggcgaagtcgtcctccacgaagtcccgggagaacccgagccggtcggtccagaactcgaccgctccggcgacgtcgcgcgcggtgagcaccggaacggcactggtcaacttggccattttgtttggtgctagtagcttcgaactggtctacttctgttaagggtttggttttgatgcgtggagcaacagttcaagtcacagttagttgtctggttcactcattttgaattccaaattgatagcgttccccacgttcccgtaccacggatgccttttgctctgagccacaagatttcgcgtgcttcgaatggcgttgcaagaatgtgctggtgaggtaagcacagactgttgtcctctcggtcgtgcctgtgtctgcacacgcactttcgagcatacggcaagcaagcaaactccaagccattcatttattcgcaggccgtctcatccgcttctcttcatatatatgaatgtatagagggaatccagaagaatcagcgttgcgtcggcattggtcgtgcggctccggcgcgtctagatcggccctgcactccttgtagctgtcgttgctggtgctgctgcgctgccatgcgaggcgtcccgtggctgcagccgccgtggctgtggtcgtggtcgtagtcgtcggtggtcacctaccttggctcctcgttactggtctgctgtggcacctcgcctctcgcgagcgaatccgcctcgcctgccactcatcgcgaagggggggtatgttagatatctgaatgtggcgatgcggccgaatgcgccgccacacccctcatttgtcacggaacgcgcgcaagttctgaggtgctgtgtacatagaattcgcccctaccccaccaggggtgtaggttataaaacttggtaccatcgacctcgagccgtaaacgatgccgacttacgattgttgggtgcttattaatgggcctcagcagcagcacatgagaaatca aagtctttgggttccggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacgggaaaacttaccaggtccagacataggtaggattgacagattgagagctctttcatgattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctggttaattccgttaacgaacgagacctcggcctactaaatagtgcgtggtatggcaacatagtgcgttttaacttcttagagggacatgtccggtttacgggcaggaagttcgaggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggccgcacgcgcgctacactgatgggttcatcgggttttaattctgatttttggaattgagtgcttggtcggaaggcctggctaatccttggaacgctcatcgtgctggggctagatttttgcaattattaatctccaacgaggaattcctagtaaacgcaagtcatcagcttgcattgaatacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgcacctaccgattgaacggtccgatgaaaggatccatcgtcgaacggcaggcgtgcaaacttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaatgggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc

SEQ ID NO：11 18S上游同源臂：(18S1)

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SEQ ID NO：12 18S下游同源臂(18S2):

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SEQ ID NO：13G6PDH過表達(dá)質(zhì)粒pGZ1420：

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SEQ ID NO：14質(zhì)粒pGZ1622：

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SEQ ID NO：15質(zhì)粒pGZ1723

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SEQ ID NO：16 18S rDNA基因序列：

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