本發(fā)明涉及一種高密度發(fā)酵制備γ-聚谷氨酸的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
γ-聚谷氨酸是微生物產(chǎn)生的一種胞外氨基酸聚合物，具有優(yōu)良的水溶性、超強(qiáng)的吸附性和生物可降解性，降解產(chǎn)物為無公害的谷氨酸，是一種優(yōu)良的環(huán)保型高分子材料，可作為保水劑、重金屬離子吸附劑、絮凝劑、緩釋劑以及藥物載體等，在化妝品、環(huán)境保護(hù)、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、沙漠治理等產(chǎn)業(yè)均有很大的商業(yè)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。
高密度發(fā)酵就是要在單位時(shí)間、單位反應(yīng)器體積內(nèi)，在不影響胞內(nèi)產(chǎn)物得率的基礎(chǔ)上，盡可能多的積累細(xì)胞量。高細(xì)胞密度發(fā)酵中的培養(yǎng)基應(yīng)充分滿足微生物的營養(yǎng)要求，并為細(xì)胞的生長繁殖提供適宜的環(huán)境條件。
枯草芽孢桿菌Z115是由山東建筑大學(xué)生物技術(shù)研究中心分離并保存的一株菌株(張超，欒興社，朱明晟，孫娜，楊統(tǒng)見，王書燕.各種氨基酸對(duì)枯草芽孢桿菌生產(chǎn)聚谷氨酸的促進(jìn)作用.食品工業(yè)[J]，2013，1（34）：119-122.)，該菌株屬于芽孢桿菌屬。在上述文章中，作者通過實(shí)驗(yàn)研究了各種氨基酸對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的影響。但是該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在著產(chǎn)品濃度低、生產(chǎn)效率低、操作繁瑣、氨基酸培養(yǎng)基成本高等不足，限制了廣泛推廣與應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種產(chǎn)品濃度高、效率高、易于操作、成本低的實(shí)用產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。
具體技術(shù)方案如下：
（1）斜面菌種培養(yǎng)：將枯草芽孢桿菌Z-115接種于斜面培養(yǎng)基，并于37℃下保溫培養(yǎng)48h；
（2）搖瓶菌種培養(yǎng)：菌種在斜面培養(yǎng)基上活化好后，每株菌取一滿環(huán)接入到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中（250 mL三角瓶），200r/min，37℃搖床培養(yǎng)24 h；
（3）種子培養(yǎng)基的制備：按10%的接種量轉(zhuǎn)入到500 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中（1000 mL三角瓶），200r/min， 37℃搖床培養(yǎng)48 h；
（4）發(fā)酵：5L發(fā)酵罐中按75%的裝液量裝入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，然后按體積比5-10％接入生產(chǎn)菌種進(jìn)行攪拌通氣培養(yǎng)48-50h；所述發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件為：攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min，溫度為37℃，罐壓為0.01-0.03MPa；
（5）產(chǎn)品提?。喊l(fā)酵液于10000r/min離心10min除去菌體，上清液加入2.5倍體積無水乙醇，搖勻，10000r/min、5min離心得沉淀，沉淀用蒸餾水溶解，透析過夜，透析液加2倍體積無水乙醇，得到的沉淀物在105 ℃烘箱中干燥。
上述方法中，步驟（1）中的斜面培養(yǎng)基配方為：蔗糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，谷氨酸鈉20g/L，瓊脂18 g/L，pH7.0，121℃滅菌15 min待用。
上述方法中，步驟（2）中的搖瓶培養(yǎng)基配方為：蔗糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，谷氨酸鈉20g/L，pH7.0，121℃滅菌15 min待用。
上述方法中，步驟（3）中的種子培養(yǎng)基配方同搖瓶培養(yǎng)基。
上述方法中，步驟（4）中的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖30-50g/L，蛋白胨20-30g/L，氯化鈉10-16g/L，谷氨酸鈉30-40g/L，pH7.0，121℃滅菌15 min；補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基A：蔗糖80-100g/L；蛋白胨30-40g/L，pH7.0，121℃滅菌15 min；補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基B：蔗糖80-100g/L；谷氨酸鈉40-60g/L；蛋白胨30-40g/L，pH7.0，121℃滅菌15 min。
上述方法中，步驟（4）中，發(fā)酵開始15 h后，開始補(bǔ)加補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基A，當(dāng)發(fā)酵液在600nm波長下的吸光值不再增加時(shí)，終止補(bǔ)加補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基A，此時(shí)，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)達(dá)1010cfu/ml。此后，發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液中的還原糖濃度在40 g/L，當(dāng)還原糖濃度低于設(shè)定值時(shí)，開始補(bǔ)加補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基B。
本發(fā)明制備聚谷氨酸的方法具有工藝簡單，降低了生產(chǎn)成本、提高了生產(chǎn)效率，可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
（1） 本發(fā)明提供了適于γ-聚谷氨酸高密度發(fā)酵的培養(yǎng)基，提高了菌體密度。
（2） 本發(fā)明建立了適于γ-聚谷氨酸高密度發(fā)酵的培養(yǎng)方法，降低了生產(chǎn)成本、提高了生產(chǎn)效率。
（3） 在發(fā)酵過程中，不是簡單的進(jìn)行補(bǔ)料，而是創(chuàng)新性的采用兩種不同的補(bǔ)料培養(yǎng)基，一種補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基A適用于菌體的生長，一種補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基B適用于產(chǎn)物的積累。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該明白的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其進(jìn)行限定。如無特別說明，下述實(shí)施例中出現(xiàn)的百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)。
實(shí)施例1
1、斜面菌種培養(yǎng)：將枯草芽孢桿菌Z-115接種于斜面培養(yǎng)基，并于37℃下保溫培養(yǎng)48h；斜面培養(yǎng)基配方為：蔗糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，谷氨酸鈉20g/L，瓊脂18 g/L，pH7.0。
2、搖瓶菌種培養(yǎng)：菌種在斜面培養(yǎng)基上活化好后，每株菌取一滿環(huán)接入到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中（250 mL三角瓶），200r/min，37℃搖床培養(yǎng)24 h；搖瓶培養(yǎng)基配方為：蔗糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，谷氨酸鈉20g/L，pH7.0。
3、種子培養(yǎng)基的制備：按10%的接種量轉(zhuǎn)入到500 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中（1000 mL三角瓶），200r/min， 37℃搖床培養(yǎng)48 h；種子培養(yǎng)基配方同搖瓶培養(yǎng)基。
4、發(fā)酵：5L發(fā)酵罐中按75%的裝液量裝入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，然后按體積比5-10％接入生產(chǎn)菌種進(jìn)行攪拌通氣培養(yǎng)48-50h。所述基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50g/L，蛋白胨30g/L，氯化鈉16g/L，谷氨酸鈉40g/L，pH7.0；補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基A：蔗糖100g/L；蛋白胨40g/L，pH7.0；補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基B：蔗糖100g/L；谷氨酸鈉60g/L；蛋白胨40g/L，pH7.0。所述發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件為：攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min，溫度為37℃，罐壓為0.01-0.03MPa。培養(yǎng)方式為：發(fā)酵開始15 h后，開始補(bǔ)加補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基A，當(dāng)發(fā)酵液在600nm波長下的吸光值不再增加時(shí)，終止補(bǔ)加補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基A，此時(shí)，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)達(dá)1010cfu/ml。此后，發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液中的還原糖濃度在40 g/L，當(dāng)還原糖濃度低于設(shè)定值時(shí)，開始補(bǔ)加補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基B。
5、產(chǎn)品提?。喊l(fā)酵液于10000r/min離心10min除去菌體，上清液加入2.5倍體積無水乙醇，搖勻，10000r/min、5min離心得沉淀，沉淀用蒸餾水溶解，透析過夜，透析液加2倍體積無水乙醇，得到的沉淀物在105 ℃烘箱中干燥，得到γ-聚谷氨酸粗品，產(chǎn)量為37.6g/L。
實(shí)施例2
采用實(shí)施例1的方法制備γ-聚谷氨酸，不同的是，步驟4采用的過程是：5L發(fā)酵罐中按75%的裝液量裝入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，然后按體積比5％接入生產(chǎn)菌種進(jìn)行攪拌通氣培養(yǎng)48-50h。所述基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖30g/L，蛋白胨20g/L，氯化鈉10g/L，谷氨酸鈉30g/L，pH7.0；補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基A：蔗糖80g/L；蛋白胨30g/L，pH7.0；補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基B：蔗糖80g/L；谷氨酸鈉40g/L；蛋白胨30g/L，pH7.0。γ-聚谷氨酸的最終產(chǎn)量為33.5g/L。
實(shí)施例3
采用實(shí)施例1的方法制備γ-聚谷氨酸，不同的是，步驟4采用的過程是：5L發(fā)酵罐中按75%的裝液量裝入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，然后按體積比7％接入生產(chǎn)菌種進(jìn)行攪拌通氣培養(yǎng)48-50h。所述基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖40g/L，蛋白胨25g/L，氯化鈉14g/L，谷氨酸鈉35g/L，pH7.0；補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基A：蔗糖90g/L；蛋白胨35g/L，pH7.0；補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基B：蔗糖90g/L；谷氨酸鈉50g/L；蛋白胨35g/L，pH7.0。γ-聚谷氨酸的最終產(chǎn)量為36.5g/L。