專利名稱：一種雙酶偶聯(lián)法輔助提取茄尼醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以干馬鈴薯葉為原料，采用雙酶偶聯(lián)法輔助提取茄尼醇的方法。
背景技術(shù)：
茄尼醇(Solanesol)是長鏈半萜烯醇化合物，是一種不飽和的九聚異戊二烯伯醇，屬四倍半萜醇，具有獨特的鏈狀隔離多烯結(jié)構(gòu)，可以做為很多藥物合成的重要原料，在生物化學(xué)中有著非常重要的作用。主要存在于茄科植物中，如煙葉、茄子葉、馬鈴薯葉、桑葉等。茄尼醇具有抗菌、消炎、抗?jié)兒椭委熜难芗膊〉茸饔?。在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用廣泛，可作為泛醌類藥物、抗過敏藥、抗?jié)兯?、降血脂藥和抗癌藥物的合成原料中間體。茄尼醇以游離態(tài)和化合態(tài)形式廣泛存在于高等植物體內(nèi)，化合態(tài)的茄尼醇主要為茄尼醇的脂肪酸酯。中國專利CN 101298410A于2008年11月5日報道了一種“采用皂化、 萃取與低溫結(jié)晶離心結(jié)合提取茄尼醇的方法及其設(shè)備”，該方法用30%的茄尼醇粗品制得的茄尼醇含量為70.02% ；中國專利CN101497557A于2009年8月5日公開了“從馬鈴薯葉(隴薯6號)中提取純化茄尼醇的方法”，通過微波輔助萃取、皂化、柱層析、結(jié)晶和重結(jié)晶等工藝，能得到純度95%以上的茄尼醇。中國專利CN17M492A于2006年1月25日公開了“一種從煙草中提取茄尼醇的方法”，經(jīng)過常規(guī)的溶劑提取、皂化、洗劑和濃縮后得到純度23%以上的茄尼醇粗品；專利ZL200610048708. X于2007年3月21日報道了“一種有效提高茄尼醇粗品含量的方法”，該發(fā)明是將含量為7 12%的茄尼醇粗品用C1-C8的烷烴溶解，再用堿的醇溶液混合石油醚等進行洗劑，制得含量大于25%的茄尼醇粗品；中國專利CN1762940A于2006年4月沈日公開了“一種從馬鈴薯葉(隴薯6號)和廢棄煙葉中提取純化茄尼醇的方法”，該方法是用油做提取劑，通過提取、皂化、結(jié)晶最終可得到純度為 90%的茄尼醇產(chǎn)品；中國專利ZL20071018M66. 3于2008年5月21日申請了一種“從馬鈴薯葉(隴薯6號)、煙葉和/或煙桿中提取純化茄尼醇的方法”，采用浸提法提取原料中的茄尼醇后，經(jīng)皂化、除蠟和結(jié)晶及重結(jié)晶等工藝，能獲得純度98%以上的茄尼醇；中國專利 CN1712392A于2005年12月觀日公開了 “一種從馬鈴薯葉(隴薯6號)中提取茄尼醇的方法”，經(jīng)過常規(guī)的溶劑提取、皂化、結(jié)晶和硅膠柱層析等流程后得到純度90%以上的茄尼醇。以上工藝的不足之處是在提取前對材料未進行預(yù)處理，所以提取后需要皂化，堿液易造成環(huán)境污染，而本發(fā)明的纖維素酶和脂肪酶輔助提取茄尼醇的方法對材料在提取茄尼醇前進行了破壁處理，并將結(jié)合態(tài)的茄尼醇釋放出來，省去了皂化環(huán)節(jié)，該工藝是一種綠色的生產(chǎn)工藝。迄今國內(nèi)外文獻、專利均未涉及以馬鈴薯葉為原料，以纖維素酶和脂肪酶法輔助提取茄尼醇的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種雙酶偶聯(lián)法輔助提取茄尼醇的方法。該方法利用纖維素酶改變馬鈴薯葉細胞壁的通透性，然后用脂肪酶水解結(jié)合態(tài)的茄尼醇，克服了傳統(tǒng)工藝直接提取后接著純化或試劑提取后用堿皂化導(dǎo)致茄尼醇降解或異構(gòu)化，從而得率較低的缺點。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種雙酶偶聯(lián)法輔助提取茄尼醇的方法，該方法包括如下步驟1)將干馬鈴薯葉粉碎后過40目 60目篩，加入蒸餾水，干馬鈴薯葉原料與蒸餾水的質(zhì)量與體積比為20g IOOml 400ml，在超聲波功率150 250W、頻率40KHz、溫度 30°C 60°C條件下超聲水洗20 60min，然后過濾得固體物質(zhì)A ；2)向物質(zhì)A中加入用pH4.0 5.6的檸檬酸緩沖液配制的濃度為0. OOlg/ ml 0. 004g/ml的纖維素酶液，干馬鈴薯葉原料與所述纖維素酶液的質(zhì)量體積比為 20g IOOml 300ml，在溫度30°C 60°C、攪拌速度100 120r/min條件下酶解1 5 小時，并在3600 4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10 15min，然后棄除上清液得物質(zhì)B ；3)向物質(zhì)B中加入用pH7 9的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液配制的質(zhì)量濃度為0. 001g/ml 0. 006g/ml的脂肪酶液，干馬鈴薯葉原料與脂肪酶液的質(zhì)量體積比為 20g IOOml 500ml，在溫度30°C 60°C、攪拌速度100 120r/min條件下酶解1 5 小時，再在3600 4000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10 15min，然后棄除上清液得物質(zhì)C ；4)向物質(zhì)C中加入95%乙醇，干馬鈴薯葉原料與95%乙醇的質(zhì)量體積比為 20g 300ml 600ml，在微波頻率M50MHz、功率為200 400W、溫度30°C 60°C、攪拌速度60 lOOr/min條件下微波輔助回流提取1小時，將收集的提取液在0. OSMPa條件下抽濾，再將收集的濾液在0. OSMpa真空度，50°C條件下減壓濃縮至粘稠狀得茄尼醇粗制品D， 粗制品D中，所述茄尼醇的含量為15 19%，茄尼醇的收率為87% 92%。上述方法中，所述的馬鈴薯葉優(yōu)選為隴薯6號馬鈴薯葉。利用高效液相色譜法測定本發(fā)明中涉及的各種茄尼醇制品的茄尼醇含量，測定條件如下高效液相色譜參數(shù)色譜柱Cw洗脫劑甲醇乙醇的體積比=40% 60%洗脫速率lml/min，檢測波長211nm。本發(fā)明的特點和產(chǎn)生的有益效果是本發(fā)明是以干馬鈴薯葉為原料，用纖維素酶法和脂肪酶輔助提取茄尼醇粗制品的方法；利用纖維素酶改變馬鈴薯葉細胞壁的通透性，然后用脂肪酶水解結(jié)合態(tài)的茄尼醇，克服了傳統(tǒng)工藝直接提取后接著純化或試劑提取后用堿皂化導(dǎo)致茄尼醇降解或異構(gòu)化，從而得率較低的缺點。此法比現(xiàn)有技術(shù)高效、廢液排放量少，是一種環(huán)境友好的綠色生產(chǎn)技術(shù)。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細的說明圖1為茄尼醇標品和本發(fā)明制備的茄尼醇粗制品的高效液相色譜圖。
具體實施例方式實施例1
本發(fā)明一種纖維素酶法和脂肪酶輔助提取茄尼醇的方法，包括如下步驟1)將干馬鈴薯葉(隴薯6號)粉碎后過60目篩，準確稱取馬鈴薯葉40克，加入 800ml蒸餾水，在超聲波功率150W、頻率40KHz、溫度50°C條件下超聲水洗40min，然后過濾得固體物質(zhì)A ；2)向物質(zhì)A中加入用pH5. 6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制的濃度為0. 002g/ ml纖維素酶液600ml，在溫度50°C、攪拌速度120r/min條件下酶解5小時，并在4000轉(zhuǎn)/ 分鐘條件下離心13min，然后棄除上清液得物質(zhì)B ；3)向物質(zhì)B中加入用pH8的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液配制的濃度為 0. 006g/ml的脂肪酶液200ml，置于磁力攪拌器設(shè)備中，在溫度40°C、攪拌速度lOOr/min條件下酶解5小時，再在3800轉(zhuǎn)/分鐘下離心15min，然后棄除上清液得物質(zhì)C ；4)向物質(zhì)C中加入95%乙醇1200ml，在微波頻率2450MHz、功率為400W、溫度 50°C、攪拌速度60r/min條件下微波輔助回流提取1小時，將收集的提取液在0. OSMPa條件下抽濾，再將收集的濾液在0. OSMpa真空度、50°C下減壓濃縮至粘稠狀得茄尼醇粗制品D， 茄尼醇的含量為19%，茄尼醇的收率為92%。實施例2本發(fā)明一種纖維素酶和脂肪酶輔助提取茄尼醇的方法，包括如下步驟1)將干馬鈴薯葉(隴薯6號)粉碎后過50目篩，準確稱取馬鈴薯葉40克，加入 200ml蒸餾水，在超聲波功率200W、頻率40KHz、溫度30°C條件下超聲水洗60min，然后過濾得固體物質(zhì)A ；2)向物質(zhì)A中加入用pH4. O的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制的濃度為0. 004g/ ml纖維素酶液400ml，在溫度30°C、攪拌速度llOr/min條件下酶解3小時，并在3800轉(zhuǎn)/ 分鐘條件下離心lOmin，然后棄除上清液得物質(zhì)B ；3)向物質(zhì)B中加入用pH9的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液配制的濃度為 0. 003g/ml的脂肪酶液600ml，置于磁力攪拌器設(shè)備中，在溫度30°C、攪拌速度llOr/min條件下酶解1小時，再在3600轉(zhuǎn)/分鐘下離心lOmin，然后棄除上清液得物質(zhì)C ；4)向物質(zhì)C中加入95%乙醇900ml，在微波頻率M50MHz、功率為300W、溫度30°C、 攪拌速度80r/min條件下微波輔助回流提取1小時，將收集的提取液在0. OSMPa條件下抽濾，再將收集的濾液在0. OSMpa真空度、50°C下減壓濃縮至粘稠狀得茄尼醇粗制品D，茄尼醇的含量為17%，茄尼醇收率為87%。實施例3本發(fā)明一種纖維素酶和脂肪酶輔助提取茄尼醇的方法，包括如下步驟1)將干馬鈴薯葉(隴薯6號)粉碎后過40目篩，準確稱取馬鈴薯葉40克，加入 500ml蒸餾水，在超聲波功率250W、頻率40KHz、溫度60°C條件下超聲水洗20min，然后過濾得固體物質(zhì)A ；2)向物質(zhì)A中加入用pH4. 8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制的濃度為0. OOlg/ ml纖維素酶液200ml，在溫度60°C、攪拌速度lOOr/min條件下酶解1小時，并在3600轉(zhuǎn)/ 分鐘條件下離心15min，然后棄除上清液得物質(zhì)B ；3)向物質(zhì)B中加入用pH7的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液配制的濃度為 0. 001g/ml脂肪酶液1000ml，置于磁力攪拌器設(shè)備中，在溫度60°C、攪拌速度120r/min條件下酶解3小時，再在4000轉(zhuǎn)/分鐘下離心12min，然后棄除上清液得物質(zhì)C ；4)向物質(zhì)C中加入適量95%乙醇600ml，在微波頻率M50MHz、功率為200W、溫度 60°C、攪拌速度lOOr/min條件下微波輔助回流提取1小時，將收集的提取液在0. OSMPa條件下抽濾，再將收集的濾液在0. OSMpa真空度、50°C下減壓濃縮至粘稠狀得茄尼醇粗制品 D，茄尼醇含量為15%，茄尼醇收率為87%。比較例本發(fā)明提供一種以馬鈴薯葉(隴薯6號)為原料，常規(guī)提取茄尼醇粗產(chǎn)品的方法， 包括如下步驟1)將干馬鈴薯葉(隴薯6號)粉碎后過60目篩，準確稱取馬鈴薯葉40克，加入 800ml蒸餾水，在超聲波功率150W、頻率40KHz、溫度50°C條件下超聲水洗40min，然后過濾得固體物質(zhì)A ；2)向物質(zhì)A中加入用PH8的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液配制的濃度為 0. 006g/ml的脂肪酶液200ml，置于磁力攪拌器設(shè)備中，在溫度40°C、攪拌速度lOOr/min條件下酶解5小時，再在3800轉(zhuǎn)/分鐘下離心15min，然后棄除上清液得物質(zhì)B ；3)向物質(zhì)B中加入95%乙醇1200ml，在微波頻率2450MHz、功率為400W、溫度 50°C、攪拌速度60r/min條件下微波輔助回流提取1小時，將收集的提取液在0. OSMPa條件下抽濾，再將收集的濾液在0. OSMpa真空度、50°C下減壓濃縮至粘稠狀得茄尼醇粗制品D， 茄尼醇的含量為9. 5 %，茄尼醇的收率為60%。顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。
權(quán)利要求
1.一種雙酶偶聯(lián)法輔助提取茄尼醇的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1)將干馬鈴薯葉粉碎后過40目 60目篩，加入蒸餾水，干馬鈴薯葉原料與蒸餾水的質(zhì)量與體積比為20g IOOml 400ml，在超聲波功率150 250W、頻率40KHz、溫度30°C 60°C條件下超聲水洗20 60min，然后過濾得固體物質(zhì)A ；2)向物質(zhì)A中加入用pH4.0 5. 6的檸檬酸緩沖液配制的濃度為0. OOlg/ ml 0. 004g/ml的纖維素酶液，干馬鈴薯葉原料與所述纖維素酶液的質(zhì)量體積比為 20g 100ml 300ml，在溫度30°C 60°C、攪拌速度100 120r/min條件下酶解1 5 小時，并在3600 4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10 15min，然后棄除上清液得物質(zhì)B ；3)向物質(zhì)B中加入用pH7 9的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液配制的質(zhì)量濃度為0. 001g/ml 0.006g/ml的脂肪酶液，干馬鈴薯葉原料與脂肪酶液的質(zhì)量體積比為 20g 100ml 500ml，在溫度30°C 60°C、攪拌速度100 120r/min條件下酶解1 5 小時，再在3600 4000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10 15min，然后棄除上清液得物質(zhì)C ；4)向物質(zhì)C中加入95%乙醇，干馬鈴薯葉原料與95%乙醇的質(zhì)量體積比為 20g 300ml 600ml，在微波頻率2450MHz、功率為200 400W、溫度30°C 60°C、攪拌速度60 lOOr/min條件下微波輔助回流提取1小時，將收集的提取液在0. OSMPa條件下抽濾，再將收集的濾液在0. OSMpa真空度，50°C條件下減壓濃縮至粘稠狀得茄尼醇粗制品D， 粗制品D中，所述茄尼醇的含量為15 19%，茄尼醇的收率為87% 92%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙酶偶聯(lián)法輔助提取茄尼醇的方法，其特征在于，所述馬鈴薯葉為隴薯6號馬鈴薯葉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙酶偶聯(lián)法輔助提取茄尼醇的方法。該方法利用纖維素酶改變馬鈴薯葉細胞壁的通透性，然后用脂肪酶水解結(jié)合態(tài)的茄尼醇，克服了傳統(tǒng)工藝直接提取后接著純化或試劑提取后用堿皂化導(dǎo)致茄尼醇降解或異構(gòu)化，從而得率較低的缺點。
文檔編號C12P7/02GK102154376SQ20101058921
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者張繼, 楊玲娟, 王鳳霞, 王自社, 袁毅君, 謝天助, 馬君義 申請人:天水師范學(xué)院