專利名稱：一種新的基于illumina測序平臺的文庫構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因組測序，特別是高通量基因組測序領(lǐng)域。更特別地本發(fā)明的方法涉及基于illumina測序平臺的文庫構(gòu)建方法，特別是小片段文庫的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
脫氧核糖核酸(DNA)是兩條核苷酸鏈以互補配對原則所構(gòu)成的雙螺旋結(jié)構(gòu)的分子化合物，它是生命遺傳信息的載體。對DNA核苷酸序列的測序分析不僅為基因表達、基因調(diào)控等生物學(xué)基礎(chǔ)研究提供重要數(shù)據(jù)，而且在疾病診斷學(xué)、基因治療等應(yīng)用研究領(lǐng)域起著重要的作用[Gilbert W. DNA sequencing and gene structure. In :Forsen S. NobelLectures in Chemistry 1971-1980. 1980. Singapore :fforld Scientific Publishing Co,1993,408—426. Sanger F, Coulson A R. A rapid method for determining sequences inDNA by primed synthesis with DNA polymerase[J]. J Mol Biol，1975，94 :441-448.]。DNA測序技術(shù)從早期Frederick Sanger的手工測序和基于Sanger法而開發(fā)的第一代自動化測序儀，到目前的廣泛應(yīng)用的第二代高通量測序平臺，這一領(lǐng)域已經(jīng)產(chǎn)生了質(zhì)的飛躍[周曉光，任魯風(fēng)，李云濤等.下一代測序技術(shù)技術(shù)回顧與展望[J].中國科學(xué).2010，40 (1),23_37ο Li RQ, Fan w, Tian g, et al, . The sequence and de novo assembly ofthe giant panda genome [J] · Nature，2010，463，311-317]。以邊合成邊測序技術(shù)和可逆阻斷技術(shù)為基礎(chǔ)的第二代高通量illumina測序平臺避免了像傳統(tǒng)Sanger法測序技術(shù)那樣需要耗費大量的人力和物力，并具有測序通量高、準確度高和成本低的眾多優(yōu)點，該平臺廣泛應(yīng)用于全基因組測序，新物種測序，目標基因組測序，轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳分析等領(lǐng)域。iIlumina測序平臺的測序流程主要分為以下四個步驟[IlluminaJndexedpaired-end sequencing user guide. ] : 1，文庫備；2，用 Cluster Station 對文庫進對于擴增；3，對成簇后的文庫進行測序；4，數(shù)據(jù)處理和拼接。從測序的片段大小來分，illumina測序平臺的文庫分為小片段DNA的文庫和大片段DNA的文庫。本發(fā)明涉及內(nèi)容主要為小片段文庫的構(gòu)建方法。現(xiàn)有技術(shù)中小片段DNA的文庫制備流程主要分為以下幾個步驟I打斷DNA到一定的片段大小，純化；II末端修復(fù)，純化；III在已修復(fù)的DNA片段的3’端加上一個“A”堿基，純化；IV用DNA連接酶將特異性接頭連接至DNA片段的兩端，純化；V加接頭的DNA產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收一定大小的片段，純化；VI采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增DNA文庫，純化；VII Agilent Bioanalyzer 2100 和 Q-PCR 檢測文庫濃度及片段大?。籚III使用illumina測序平臺進行測序。該制備流程圖見圖1。隨著第二代高通量illumina測序平臺的廣泛應(yīng)用，以及多物種基因組測序和全基因組研究的大規(guī)模開展，降低測序成本，減少測序流程，提高勞動效率成為DNA測序技術(shù)的一個重要研究方向。在現(xiàn)有的illumina測序平臺的小片段DNA建庫流程步驟中，各個步驟都是獨立制備，所以分別需要進行純化的過程，以保證各個步驟之間不會互相干擾和污染。但是這也造成了 DNA文庫樣品的在純化過程中的不可避免的損失和浪費，并且存在操作過程繁瑣，增加成本等缺點。因此，本領(lǐng)域需要新的小片段DNA建庫流程以改進上述缺點ο

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有illumina測序平臺的小片段DNA建庫的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新的illumina測序平臺的文庫構(gòu)建方法和相關(guān)的試劑組合溶液，能夠減少純化步驟，降低文庫的損失和浪費，減低成本，提高勞動效率。本發(fā)明提供的illumina測序平臺的文庫構(gòu)建新方法，見圖3，包括以下步驟(1)將DNA打斷至建庫所需的DNA片段QOObp 800bp)，純化，得到DNA片段。(2)將(1)所得到的DNA片段與末端修復(fù)試劑混合，形成平末端的DNA片段，純化，得到平末端DNA片段。(3)將⑵所得到的平末端DNA片段與試劑I混合，得到3，端加“A”的DNA片段。(4)將(3)所得到的3’端加“A”的DNA片段與試劑II以及接頭混合，純化，從而得到加接頭的DNA片段。(5)將(4)所得到的加接頭的DNA產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收一定大小的片段；(6)將(5)回收的到的片段采用PCR方法以擴增DNA文庫，回收；(7)將(6)所得到的PCR擴增產(chǎn)物采用Agilent Bioanalyzer 2100和Q-PCR檢測文庫濃度及片段大??；(8)使用illumina測序平臺進行測序。所述步驟(1)中打斷方式可以是超聲波或者酶切的方式。所述步驟(3)中試劑I的pH為7. 6 7. 9，溶劑是水，溶質(zhì)為如下終濃度物質(zhì)IOmM IOOmM可溶性鹽溶液，IOOmM 500mM緩沖鹽溶液，IOmM 50mM 二硫蘇糖醇，50 200mM MgCl2, 5mM dATP, Klenow (3 ‘ -5' exo)酶。所述步驟(3)中試劑I中緩沖鹽溶液可以為Tris-HCl、磷酸鹽等緩沖鹽溶液。所述步驟⑶中試劑I中可溶性鹽溶液可以為氯化鈉、氯化鉀等溶液。DNA在一定濃度的氯化鈉溶液中溶解度很高，Na+與帶負電的DNA結(jié)合成DNA鈉鹽，這樣能夠使DNA溶解并且更加穩(wěn)定。樣品與試劑I混合必須在一定的溫度下進行孵育，建議最適溫度為12°C 40 "C。所述步驟中試劑II的pH為7. 6 7. 9，溶劑是水，溶質(zhì)為IOOmM 500mM緩沖鹽溶液，MgCl2, IOmM 50mM 二硫蘇糖醇，5 IOmM ATP, T4DNA連接酶。所述步驟(4)中試劑II中緩沖鹽溶液可以為Tris-HCl、磷酸鹽等緩沖鹽溶液。在步驟⑷中，ATP水解時可提供能量以催化DNA鏈的5' -PO4與另一 DNA鏈的3' -OH生成磷酸二酯鍵。樣品與試劑II混合必須在一定的溫度下進行孵育，建議最適溫度為4°C 22°C。
除上述具體描述的各個步驟內(nèi)容外，未提及的其他步驟內(nèi)容同現(xiàn)有技術(shù)中illumina測序平臺的文庫分為小片段DNA的文庫的制備過程。本發(fā)明的方法所制備的小片段DNA文庫中，DNA片段大小和濃度與現(xiàn)有技術(shù)i 1 Iumina測序平臺的方法相當，參見實施例1。本發(fā)明的小片段DNA的文庫構(gòu)建方法與現(xiàn)有技術(shù)illumina測序平臺的方法相比較，在步驟4中減少了純化過程，從而縮短實驗時間，提高了勞動效率，并且降低成本；操作更加簡便，提高了建庫的成功率。


圖1.為基于illumina測序平臺的小片段DNA建庫流程。圖 2.為 Agilent Bioanalyzer 2100 檢測結(jié)果。圖3.為本發(fā)明的新illumina測序平臺的文庫構(gòu)建方法的流程圖。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明一方面提供了一種基于illumina測序平臺的文庫構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)將 DNA 打斷；(2)將步驟(1)所得到的DNA片段進行末端修復(fù)，得到平末端DNA片段；(3)將步驟⑵所得到的平末端DNA片段與試劑I混合，得到3，端加“A”的DNA片段；(4)將步驟(3)所得到的3’端加“A”的DNA片段與試劑II以及接頭混合，純化，從而得到加接頭的DNA片段；(5)將步驟(4)所得到的加接頭的DNA產(chǎn)物回收；(6)將步驟(5)回收的到的片段采用PCR方法以擴增DNA文庫，回收；其中所述步驟(3)中試劑I的pH為7. 6 7. 9優(yōu)選的7. 9，溶劑是水，溶質(zhì)為如下終濃度物質(zhì)IOmM IOOmM,優(yōu)選25mM 75mM，更優(yōu)選50mM的可溶性鹽溶液；10 300mM，優(yōu)選 50 200mM，更優(yōu)選 IOOmM 的 MgCl2 ； IOmM IOOOmM,優(yōu)選 50mM 500mM，更優(yōu)選 IOOmM的緩沖鹽溶液；ImM 50mM，優(yōu)選5mM 15mM，更優(yōu)選IOmM的二硫蘇糖醇；ImM 10mM，優(yōu)選2. 5mM 7. 5mM,更優(yōu)選 5mM 的 dATP，lU/ml 40U/ml，優(yōu)選 10U/ml 30U/ml，更優(yōu)選 20U/ml 的 Klenow (3 ‘ -5' exo)酶；其中所述步驟(4)中試劑II的pH為7. 6 7. 9優(yōu)選的7. 6，溶劑是水，溶質(zhì)為10 200mM，優(yōu)選50 150mM，更優(yōu)選IOOmM的緩沖鹽溶液；1 IOOmM,優(yōu)選10 90mM，更優(yōu)選50mM的二硫蘇糖醇；1 40mM，優(yōu)選5 20mM，更優(yōu)選IOmM的ATP ； 10 400mM，優(yōu)選 50 200mM，更優(yōu)選 IOOmM 的 MgCl2 ； lU/ml 200U/ml，優(yōu)選 50U/ml 150U/ml，更優(yōu)選72U/ml的DNA連接酶。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，本發(fā)明的方法進一步包括步驟(7)對步驟(6)所得到的PCR擴增產(chǎn)物檢測文庫濃度及片段大??；優(yōu)選地采用Agilent Bioanalyzer 2100和Q-PCR檢測文庫濃度及片段大小。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，本發(fā)明的方法進一步還包括步驟(8)對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，優(yōu)選地使用illumina測序平臺進行測序。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，所述步驟(1)中打斷方式可以是超聲波或者酶切的方式。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，所述步驟(1)中將DNA打斷至建庫所需的DNA片段，優(yōu)選地打斷至200bp SOObp的DNA片段。任選地，進一步包括純化步驟，得到DNA片段。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，在步驟( 通過如下方法進行末端修復(fù)將步驟(1)所得到的DNA片段與末端修復(fù)試劑混合，形成平末端的DNA片段。任選地，進一步包括純化步驟，得到平末端DNA片段。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，所述步驟(3)中試劑I中緩沖鹽溶液可以為Tris-HCl、磷酸鹽等緩沖鹽溶液，優(yōu)選是Tris-HCl。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，所述步驟(3)中試劑I中可溶性鹽溶液可以為氯化鈉、氯化鉀等溶液，優(yōu)選是氯化鈉溶液。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，樣品與試劑I混合在12°C 40°C的溫度下進行孵育，優(yōu)選的溫度為37°C。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，所述步驟中的接頭包括為帶有T堿基末端的任意接頭，優(yōu)選地是由如下正反兩個序列組成的DNA Index adapter DNA Index adapter F 5-Phos/TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCAA ；DNA Index adapter R 5-Phos/TTGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，所述步驟中試劑II中緩沖鹽溶液可以為Tris-HCl、磷酸鹽等緩沖鹽溶液，優(yōu)選是Tris-HCl。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，樣品與試劑II混合在4°C 22°C的溫度下進行孵育，優(yōu)選的溫度為16°C。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，在步驟(5)中通過如下方法回收所得到的加接頭的DNA產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收一定大小的片段。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，步驟(5)中通過進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收一定大小的片段；切膠回收的片段大小是lOO-lOOObp，例如200、400bp和800bp。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，步驟(6)中PCR方法所使用的引物是Index Primer X 5 ‘ CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCAATGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ；Primer 1. 0 5 ‘ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。在本發(fā)明另一方面中，本發(fā)明所述方法用于小片段DNA文庫構(gòu)建。在本發(fā)明另一方面中提供了本發(fā)明所述方法構(gòu)建的小片段DNA文庫。
在本發(fā)明進一步的方面中，提供了一種試劑，其特征在于pH為7. 6 7. 9優(yōu)選的7. 9，溶劑是水，溶質(zhì)為如下終濃度物質(zhì)IOmM IOOmM,優(yōu)選25mM 75mM的，更優(yōu)選50mM的可溶性鹽溶液；10 300mM，優(yōu)選50 200mM，更優(yōu)選IOOmM的MgCl2 ； IOmM IOOOmM,優(yōu)選50mM 500mM的，更優(yōu)選IOOmM的緩沖鹽溶液；ImM 50mM，優(yōu)選5mM 15mM，更優(yōu)選IOmM的二硫蘇糖醇；ImM 10mM，優(yōu)選2. 5mM 7. 5mM,更優(yōu)選5mM的dATP，lU/ml 40U/ml，優(yōu)選10U/ml 30U/ml，更優(yōu)選20U/ml Klenow (3 ‘ -5' exo)酶；所述試劑用作本發(fā)明所述方法中步驟C3)中的試劑I。其中所述緩沖鹽溶液可以為Tris-HCl、磷酸鹽等緩沖鹽溶液，優(yōu)選是Tris-HCl ；其中所述可溶性鹽溶液可以為氯化鈉、氯化鉀等溶液，優(yōu)選是氯化鈉溶液。在本發(fā)明進一步的方面中，提供了一種試劑，其特征在于pH為7. 6 7. 9優(yōu)選的7. 6，溶劑是水，溶質(zhì)為10 200mM，優(yōu)選50 150mM，更優(yōu)選IOOmM緩沖鹽溶液；1 IOOmM,優(yōu)選10 90mM，更優(yōu)選50mM的二硫蘇糖醇；1 40mM，優(yōu)選5 20mM，更優(yōu)選IOmM的ATP ；10 400mM，優(yōu)選 50 200mM，更優(yōu)選 IOOmM 的 MgCl2 ； lU/ml 200U/ml，優(yōu)選 50U/ml 150U/ml，更優(yōu)選72U/ml DNA連接酶；所述試劑用作本發(fā)明所述方法中步驟中的試劑II。其中所述緩沖鹽溶液可以為Tris-HCl、磷酸鹽等緩沖鹽溶液，優(yōu)選是Tris-HCl。實施例實施例一1. 1 試劑10 X T4PNK bu f f er (En ζ yma t i c s) , dNTP (En ζ yma t i c s) , Τ4 DNApolymerase (Enzymatics), Τ4ΡΝΚ(Enzymatics) , Klenow Fragment(3' to 5，exo)(Enzymatics),Klenow Fragment (Enzymatics),IOXblue buffer (Enzymatics),DNA LigaseBuffer 10X (Enzymatics), Phusion DNA polymerase(NEB)。試劑I pH為7. 9，溶劑是水，溶質(zhì)為如下終濃度物質(zhì)50mM氯化鈉溶液(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，IOOmM Tris-HCl溶液(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，IOOmMMgCl2 (國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，IOmM 二硫蘇糖醇(Sigma)，5mM dATP (Enzymatics)，20U/ml Klenow Fragment(3‘ -5' exo)。試劑II pH為7. 6，溶劑是水，溶質(zhì)為如下終濃度物質(zhì)72U/ml T4DNA polymerase,IOmM ATP,500mM Tris-HCl 溶液，IOOmMMgCl2, 50mM 二硫蘇糖醇；1. 2實驗步驟1.2. 1吸取兩份50ng/y 1 R)Smid樣品(深圳華大基因研究院)各40 μ 1置于Covaris樣品管(Covaris公司)中，分別命名為X和Y，采用Covaris公司生產(chǎn)Ε210型號
打斷儀對樣品進行打斷，打斷參數(shù)如下
負栽比強度循環(huán)/脈沖時間(秒)20%52001601. 2. 2打斷后，用Agencourt公司的Ampure磁珠根據(jù)生產(chǎn)商的說明書回收純化，最后每個樣品分別溶于45ul超純水中，取42ul進行后面的反應(yīng)，將樣品分別置于PCR管中。1. 2. 3末端修復(fù)，將兩份樣品分別按照下面的表格配置反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種基于illumina測序平臺的文庫構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)將DNA打斷；(2)將步驟(1)所得到的DNA片段進行末端修復(fù)，得到平末端DNA片段；(3)將步驟(2)所得到的平末端DNA片段與試劑I混合，得到3’端加“A”的DNA片段；(4)將步驟(3)所得到的3’端加“A”的DNA片段與試劑II以及接頭混合，純化，從而得到加接頭的DNA片段；(5)將步驟⑷所得到的加接頭的DNA產(chǎn)物回收；(6)將步驟(5)回收的到的片段采用PCR方法以擴增DNA文庫，回收；其中所述步驟(3)中試劑I的pH為7. 6 7. 9優(yōu)選的7. 9，溶劑是水，溶質(zhì)為如下終濃度物質(zhì)IOmM IOOmM,優(yōu)選25mM 75mM，更優(yōu)選50mM的可溶性鹽溶液；10 300mM，優(yōu)選50 200mM，更優(yōu)選 IOOmM 的 MgCl2 ； IOmM IOOOmM,優(yōu)選 50mM 500mM，更優(yōu)選 IOOmM 的緩沖鹽溶液；ImM 50mM，優(yōu)選5mM 15mM，更優(yōu)選IOmM的二硫蘇糖醇；ImM 10mM，優(yōu)選2. 5mM 7. 5mM,更優(yōu)選 5mM 的 dATP，lU/ml 40U/ml，優(yōu)選 10U/ml 30U/ml，更優(yōu)選 20U/ml 的 Kl enow (3 ‘ -5' exo)酶；其中所述步驟⑷中試劑II的pH為7. 6 7. 9優(yōu)選的7. 6，溶劑是水，溶質(zhì)為10 200mM,優(yōu)選50 150mM，更優(yōu)選IOOmM的緩沖鹽溶液；1 IOOmM,優(yōu)選10 90mM，更優(yōu)選50mM的二硫蘇糖醇；1 40mM，優(yōu)選5 20mM，更優(yōu)選IOmM的ATP ； 10 400mM，優(yōu)選50 200mM,更優(yōu)選 IOOmM 的 MgCl2 ； lU/ml 200U/ml，優(yōu)選 50U/ml 150U/ml，更優(yōu)選 72U/ml 的DNA連接酶。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括步驟(7)對步驟(6)所得到的PCR擴增產(chǎn)物檢測文庫濃度及片段大小，優(yōu)選地采用Agilent Bioanalyzer 2100和Q-PCR檢測文庫濃度及片段大小。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其進一步還包括步驟(8)對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，優(yōu)選地使用illumina測序平臺進行測序。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟(1)中打斷方式可以是超聲波或者酶切的方式。
5.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述步驟(1)中將DNA打斷至建庫所需的DNA片段，優(yōu)選地打斷至建庫所需的200bp 800bp DNA片段。
6.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述步驟(3)中試劑I中緩沖鹽溶液可以為Tris-HCl、磷酸鹽等緩沖鹽溶液，優(yōu)選是Tris-HCl。
7.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述步驟(3)中試劑I中可溶性鹽溶液可以為氯化鈉、氯化鉀等溶液，優(yōu)選是氯化鈉溶液。
8.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中樣品與試劑I混合在12°C 40°C的溫度下進行孵育，優(yōu)選的溫度為37°C。
9.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述步驟中的接頭包括為帶有T堿基末端的任意接頭，優(yōu)選地是由如下正反兩個序列組成的DNA Index adapter DNA Index adapter F 5-Phos/TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCAA ；DNA Index adapter R 5-Phos/TTGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC。
10.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述步驟中試劑II中緩沖鹽溶液可以為Tris-HCl、磷酸鹽等緩沖鹽溶液，優(yōu)選是Tris-HCl。
11.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中樣品與試劑II混合在4°C 22°C的溫度下進行孵育，優(yōu)選的溫度為16°C。
12.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中步驟(5)中通過進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收一定大小的片段；切膠回收的片段大小是lOO-lOOObp，例如200、400bp和800bp。
13.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中步驟(6)中PCR方法所使用的引物是Index Primer X 5 ‘ CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCAATGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ；Primer 1. 0 5 ‘ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
14.權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其用于小片段DNA文庫構(gòu)建。
15.通過權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法構(gòu)建的小片段DNA文庫。
16.一種試劑，其特征在于pH為7. 6 7. 9優(yōu)選的7. 9，溶劑是水，溶質(zhì)為如下終濃度物質(zhì)10mM IOOmM,優(yōu)選25mM 75mM，更優(yōu)選50mM的可溶性鹽溶液；10 300mM，優(yōu)選50 200mM，更優(yōu)選 IOOmM 的 MgCl2 ； IOmM IOOOmM,優(yōu)選 50mM 500mM，更優(yōu)選 IOOmM 的緩沖鹽溶液；ImM 50mM，優(yōu)選5mM 15mM，更優(yōu)選IOmM的二硫蘇糖醇；ImM 10mM，優(yōu)選2. 5mM 7. 5mM,更優(yōu)選 5mM 的 dATP，lU/ml 40U/ml，優(yōu)選 10U/ml 30U/ml，更優(yōu)選 20U/ml的Klenow (3' -5' exo)酶；所述試劑用作權(quán)利要求1所述方法中步驟(3)中的試劑I。
17.權(quán)利要求16所述的試劑，其中所述緩沖鹽溶液可以為Tris-HCl、磷酸鹽等緩沖鹽溶液，優(yōu)選是Tris-HCl。
18.權(quán)利要求16所述的試劑，其中所述可溶性鹽溶液可以為氯化鈉、氯化鉀等溶液，優(yōu)選是氯化鈉溶液。
19.一種試劑，其特征在于pH為7. 6 7. 9優(yōu)選的7. 6，溶劑是水，溶質(zhì)為10 200mM，優(yōu)選50 150mM，更優(yōu)選IOOmM的緩沖鹽溶液；1 IOOmM,優(yōu)選10 90mM，更優(yōu)選50mM的二硫蘇糖醇；1 40mM，優(yōu)選5 20mM，更優(yōu)選IOmM的ATP ； 10 400mM，優(yōu)選50 200mM，更優(yōu)選 IOOmM 的 MgCl2 ； lU/ml 200U/ml，優(yōu)選 50U/ml 150U/ml，更優(yōu)選 72U/ml 的 DNA 連接酶；所述試劑用作權(quán)利要求1所述方法中所述步驟(4)中的試劑II。
20.權(quán)利要求19所述的試劑，其中所述緩沖鹽溶液可以為Tris-HCl、磷酸鹽等緩沖鹽溶液，優(yōu)選是Tris-HCl。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的基于illumina測序平臺的文庫構(gòu)建方法，特別是小片段DNA文庫構(gòu)建方法，針對現(xiàn)有illumina測序平臺的小片段DNA建庫的上述缺陷，能夠減少純化步驟，降低文庫的損失和浪費，減低成本，提高勞動效率。
文檔編號C12Q1/68GK102560688SQ20101058893
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者孔淑娟, 張俊青, 張秀清, 楊煥明, 欒合密, 程玲 申請人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司