一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬地層水微生物研究領(lǐng)域，為解決現(xiàn)有對(duì)環(huán)境中微生物多樣性的研究存在較大局限性，對(duì)樣品中豐度較低的物種不能有效檢測(cè)出，難區(qū)分樣品中相似度較高的物種，僅能揭示樣品中很少一部分微生物種類(lèi)等問(wèn)題，提供一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法。包括煤層水樣采集，富集水樣中的微生物菌體及提取其總DNA，用特異性引物擴(kuò)增16SrDNA高變區(qū)，通過(guò)Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析，對(duì)測(cè)序的原始數(shù)據(jù)處理后，獲得水樣中微生物的多樣性及豐度。本發(fā)明有效檢測(cè)出樣品中豐度低的物種，在煤層水中鑒定的菌種在屬水平上多于400個(gè)屬，在研究煤層水中的微生物種類(lèi)及豐度中有明顯的優(yōu)越性。適用于煤層、油氣或頁(yè)巖氣地層等環(huán)境中微生物多樣性和物種豐度分析。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于地層水微生物研究領(lǐng)域，具體為一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]煤層氣(Coalbed gas)，俗稱(chēng)瓦斯，是成煤過(guò)程中生成、并以吸附和游離狀態(tài)賦存于煤層及周巖的自?xún)?chǔ)式天然氣體，其中CH4的體積分?jǐn)?shù)最高在95%以上。據(jù)2006年國(guó)家油氣資源評(píng)價(jià)，我國(guó)埋深小于2000m的煤層氣資源量達(dá)到36.81 X 1012 m3，與我國(guó)天然氣的遠(yuǎn)景資源量基本相當(dāng)。隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的快速增長(zhǎng)，我國(guó)對(duì)能源的需求日益增多。煤層氣作為非常規(guī)天然氣，是我國(guó)天然氣資源的重要補(bǔ)充來(lái)源。開(kāi)發(fā)和利用煤層氣資源，可減少或避免煤礦瓦斯災(zāi)害的發(fā)生，大幅度降低溫室氣體的排放，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 [0003]煤層氣一般分為生物成因煤層氣和熱成因煤層氣兩類(lèi)。生物成因煤層氣是指在微生物作用下，煤中部分有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為以甲烷為主要成分的氣體。因此，研究煤層或煤層水中的微生物及其多樣性，分析參與煤降解和成氣過(guò)程中的微生物種類(lèi)，有助于揭示生物成因煤層氣的生成機(jī)理，也為煤層氣的二次開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。
[0004]傳統(tǒng)上研究環(huán)境中微生物多樣性的方法有很多，一般先對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)，再通過(guò)分子生物學(xué)方法，如:末端限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多樣性(T-RFLP)、熒光原位雜交(FISH)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)等分析微生物群體的種類(lèi)。這些技術(shù)共有的缺點(diǎn)是在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需要樣品的量較大，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，靈敏度低，對(duì)樣品中豐度較低的物種不能有效檢測(cè)出，難區(qū)分樣品中相似度較高的物種，僅能揭示樣品中很少一部分的微生物種類(lèi)。因此，在研究樣品中微生物的多樣性方面有很大的局限。而宏基因組學(xué)，是以特定生境中的整個(gè)微生物群落作為研究的對(duì)象，不需對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)直接對(duì)環(huán)境微生物總DNA進(jìn)行研究，測(cè)序數(shù)據(jù)能很好的滿(mǎn)足分析微生物群體物種多樣性和物種豐度等要求。
[0005]申請(qǐng)?zhí)枮?01110005095.2的專(zhuān)利《一種煤層氣田地下水微生物檢測(cè)方法》通過(guò)樣品采集、DNA提取、16S rDNA文庫(kù)構(gòu)建以及DGGE分析，從而對(duì)地下水微生物群落結(jié)構(gòu)做出分析。該專(zhuān)利并未提供出具體的實(shí)施步驟，通過(guò)該種方法，檢測(cè)出古菌只有產(chǎn)甲烷古菌，且僅有甲烷八疊球菌屬和甲烷葉菌屬兩個(gè)屬的產(chǎn)甲烷菌；細(xì)菌主要為硬壁菌門(mén)，變形桿菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。僅揭示出樣品中很少一部分的微生物種類(lèi)。對(duì)于樣品中豐度較低的物種并沒(méi)有有效的檢測(cè)出來(lái)。因而導(dǎo)致該分析存在較大的誤差，不能全面、精準(zhǔn)的揭示生物成因煤層氣的生成機(jī)理，也不能有效的為煤層氣的二次開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明為了解決現(xiàn)有對(duì)環(huán)境中微生物多樣性的研究存在較大局限性，需要樣品的量較大，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，靈敏度低，對(duì)樣品中豐度較低的物種不能有效檢測(cè)出，難區(qū)分樣品中相似度較高的物種，僅能揭示樣品中很少一部分的微生物種類(lèi)等問(wèn)題，提供了一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法。與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明能更準(zhǔn)確的分析出煤層水中微生物的多樣性和物種豐度。
[0007]本發(fā)明由如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法，步驟如下:
(1)煤層水樣采集:厭氧條件下采集煤層水樣，用于存放水樣的裝置滅菌后置于超凈工作臺(tái)上，將氮?dú)馄炕驓鍤馄可线B接的導(dǎo)管另一端連接過(guò)濾器后置于裝置中，打開(kāi)氣瓶閥門(mén)，通入氣體完全置換其中的空氣；然后加入終濃度為0.05%的半胱氨酸作還原劑，_20°C密閉保存；
(2)微生物菌體的富集和DNA提取:無(wú)菌操作臺(tái)上將采集的水樣通過(guò)真空抽濾裝置過(guò)濾，用0.22Mm的細(xì)菌微孔濾膜收集過(guò)濾后的菌體和其它固體物質(zhì)；用OMEGA0水樣DNA提取試劑盒提取濾膜上的微生物總DNA ；
(3)用特異性引物擴(kuò)增16SrDNA V4高變區(qū):設(shè)計(jì)16S rDNA V4高變區(qū)的特異性引物，擴(kuò)增該高變區(qū)DNA片段；
(4)Illumina平臺(tái)測(cè)序分析:用帶有Illumina通用接頭序列的引物對(duì)擴(kuò)增的高變區(qū)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建DNA文庫(kù)，用Illumina測(cè)序儀對(duì)樣品進(jìn)行雙末端測(cè)序，獲得讀序列；
(5)原始測(cè)序數(shù)據(jù)處理:使用Mothur軟件過(guò)濾原始讀序列，去除接頭污染的序列、去除低復(fù)雜度序列及含N的堿基數(shù)的序列，得到凈序列；根據(jù)序列的重疊關(guān)系，利用Velvet或AbySS等拼接軟 件將凈序列拼接成標(biāo)簽序列，即全長(zhǎng)的V4區(qū)序列；
(6)完成物種分類(lèi):通過(guò)16SrDNA V4高變區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，將非冗余的標(biāo)簽序列進(jìn)行物種注釋并聚類(lèi)成操作分類(lèi)單位，完成物種多樣性和物種豐度分析。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比:本發(fā)明不需要較大量的樣品，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，可以有效的檢測(cè)出樣品中豐度低的物種，應(yīng)用本發(fā)明所述方法在煤層水中鑒定出的菌種種類(lèi)在屬水平上多于400屬，而傳統(tǒng)方法如DGGE等在分析微生物多樣性時(shí),一般僅能分析出幾十種微生物，在研究煤層水中的微生物種類(lèi)及豐度中，具有明顯的優(yōu)越性。
[0009]煤層氣作為一種清潔能源，利用其補(bǔ)充常規(guī)天然氣資源的不足已成為共識(shí)。生物成因作為煤層氣形成的一部分緣由，具有可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用的特點(diǎn)，也是國(guó)內(nèi)外能源領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。研究生物因素導(dǎo)致煤層氣形成的機(jī)理，需要對(duì)煤層中微生物有足夠的認(rèn)識(shí)，盡可能全面分析相關(guān)的微生物種類(lèi)及豐度，以便于進(jìn)一步分析這些微生物的生理特性及代謝特征，為明確煤層氣形成的生物成因的機(jī)理提供理論依據(jù)。本發(fā)明所介紹的分析方法，能較全面的分析煤層水中微生物的種類(lèi)及豐度。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為本發(fā)明實(shí)施例煤層水中微生物多樣性分析流程圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例中煤層水微生物總DNA電泳檢測(cè)圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例中讀序列在屬水平上的分布餅圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011]以下將結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。[0012]實(shí)施例1:一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法，具體步驟如下:
(1)煤層水樣采集:厭氧條件下采集煤層水樣，用于存放水樣的裝置滅菌后置于超凈工作臺(tái)上，將氮?dú)馄炕驓鍤馄可线B接的導(dǎo)管另一端連接過(guò)濾器后置于裝置中，打開(kāi)氣瓶閥門(mén)，通入氣體的體積大于裝置體積5-10倍，置換其中的空氣；然后加入終濃度為0.05%的半胱氨酸作還原劑，_20°C密閉保存；
(2)微生物菌體的富集和DNA提取:為保證提取足量DNA，無(wú)菌操作臺(tái)上將采集的3L水樣通過(guò)真空抽濾裝置過(guò)濾，用0.22Mffl的細(xì)菌微孔濾膜收集過(guò)濾后的菌體和其它固體物質(zhì)；將濾膜剪成寬度Imm的條狀，并按重量比為6:3:1的量分為1、2、3三個(gè)樣品；按照OMEGA0水樣DNA提取試劑盒的說(shuō)明，提取三個(gè)樣品中微生物的總DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，所提取的三個(gè)樣品中I和2的DNA濃度較高，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，其中 M 為 λ -Η?η? III DNA Marker ；
(3)用V4區(qū)特異性引物擴(kuò)增16SrDNA V4高變區(qū):設(shè)計(jì)16S rDNA V4高變區(qū)的通用引物，F(xiàn):5' -GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' ,R:5/ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'，用 TaKaRa 公司的Ex TaqO擴(kuò)增該高變區(qū)DNA片段；
(4)Illumina平臺(tái)測(cè)序分析:用對(duì)高變區(qū)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建DNA文庫(kù)，用Illumina測(cè)序儀對(duì)樣品進(jìn)行雙末端測(cè)序，獲得讀序列，即測(cè)序后獲得的DNA序列片段。
[0013](5)原始測(cè)序數(shù)據(jù)處理:使用Mothur軟件過(guò)濾原始讀序列，去除接頭污染的序列、去除低復(fù)雜度序列及含N的堿基數(shù)的序列，得到凈序列。根據(jù)序列的重疊關(guān)系，利用Velvet或AbySS等拼接軟件將凈序列拼接成標(biāo)簽序列，即全長(zhǎng)的V4區(qū)序列；
(6)完成物種分類(lèi):通 過(guò)16S rDNA V4高變區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，將非冗余的標(biāo)簽序列進(jìn)行物種注釋并聚類(lèi)成操作分類(lèi)單位，完成物種多樣性和物種豐度分析。物種分類(lèi)可從界、門(mén)、綱、目、科、屬、種7個(gè)層次上進(jìn)行分析，物種豐度可根據(jù)測(cè)序結(jié)果中物種標(biāo)簽序列的數(shù)量計(jì)算出。
[0014]物種分類(lèi)結(jié)果表明，所檢測(cè)的煤層水中微生物在屬水平上有400多屬，其中7個(gè)屬的豐度占全部物種的81.34%，如圖3所示，甲基桿菌屬比例最大，占全部微生物種類(lèi)的24.59%，該類(lèi)微生物具有甲基營(yíng)養(yǎng)或甲烷營(yíng)養(yǎng)特性，因此，部分種群可能與甲烷菌競(jìng)爭(zhēng)甲基類(lèi)底物，部分種群可能會(huì)利用甲烷做為其生長(zhǎng)的碳源或能源；假單胞菌屬所占的比例為15.8%，大量的研究證明，假單胞菌屬的很多種對(duì)含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的有機(jī)物有很好的降解作用，因此，這類(lèi)微生物在煤層中可能作用于煤分子的結(jié)構(gòu)或側(cè)鏈基團(tuán)，使煤得到部分降解；嗜氫菌屬所占的比例為12.36%，此類(lèi)微生物常以氫氣作為底物進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，煤層環(huán)境中氫氣含量低有可能是嗜氫菌屬作用的結(jié)果；葡萄球菌屬所占的比例為11.89%，多數(shù)葡萄球菌能分解葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)生氣，有些菌株能分解甘露醇等物質(zhì)；藏紅花黃色線(xiàn)菌屬所占的比例為6.18%，多數(shù)種群具有產(chǎn)酸的能力；嗜甲基菌屬所占的比例為6%，甲醇是此類(lèi)菌株最常見(jiàn)的碳源和能源來(lái)源，甲基胺、甲酸鹽、葡萄糖和果糖可作為一些種的碳源和能源，產(chǎn)生極少的酸或不產(chǎn)酸；嗜酸菌屬占4.52%的比例，在培養(yǎng)過(guò)程中，嗜酸菌屬產(chǎn)生大量的酸，同時(shí)，該類(lèi)微生物對(duì)酸性環(huán)境有較高的耐受性。
[0015]除以上豐度較高的微生物以外，還有很多在生物成氣過(guò)程中起重要作用的微生物被檢測(cè)到，如:能降解芳烴或烷烴類(lèi)物質(zhì)的新鞘胺醇桿菌屬，能產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸的梭狀芽孢桿菌屬，產(chǎn)甲烷過(guò)程關(guān)鍵的甲烷桿菌屬、甲烷短桿菌和甲烷八疊球菌屬等。[0016]因此，采用高通量測(cè)序的方法能較全面的揭示煤層水中微生物的種類(lèi)及豐度，通過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，不但能深入了解降解煤成氣過(guò)程中的微生物種類(lèi)，分析生物成因煤層氣形成的可能機(jī)制，為煤層氣的持續(xù)開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，而且有助于從煤層這種極端環(huán)境中篩選出優(yōu)良的 菌株資源，用于生產(chǎn)高附加值工業(yè)產(chǎn)品。
【權(quán)利要求】
1.一種煤層水中微生物多樣性和物種豐度的分析方法，其特征在于:步驟如下: (1)煤層水樣采集:厭氧條件下采集煤層水樣，用于存放水樣的裝置滅菌后置于超凈工作臺(tái)上，將氮?dú)馄炕驓鍤馄可线B接的導(dǎo)管另一端連接過(guò)濾器后置于裝置中，打開(kāi)氣瓶閥門(mén)，通入氣體完全置換其中的空氣；然后加入終濃度為0.05%的半胱氨酸作還原劑，-20°c密閉保存； (2)微生物菌體的富集和DNA提取:無(wú)菌操作臺(tái)上將采集的水樣通過(guò)真空抽濾裝置過(guò)濾，用0.22Mm的細(xì)菌微孔濾膜收集過(guò)濾后的菌體和其它固體物質(zhì)；用OMEGA0水樣DNA提取試劑盒提取濾膜上的微生物總DNA ； (3)用特異性引物擴(kuò)增16SrDNA V4高變區(qū):設(shè)計(jì)16S rDNA V4高變區(qū)的特異性引物，擴(kuò)增該高變區(qū)DNA片段； (4)Illumina平臺(tái)測(cè)序分析:用帶有Illumina通用接頭序列的引物對(duì)擴(kuò)增的高變區(qū)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建DNA文庫(kù)，用Illumina測(cè)序儀對(duì)樣品進(jìn)行雙末端測(cè)序，獲得讀序列； (5)原始測(cè)序數(shù)據(jù)處理:使用Mothur軟件過(guò)濾原始讀序列，去除接頭污染的序列、去除低復(fù)雜度序列及含N的堿基數(shù)的序列，得到凈序列；根據(jù)序列的重疊關(guān)系，利用Velvet或AbySS拼接軟件將凈序列拼接成標(biāo)簽序列，即全長(zhǎng)的V4區(qū)序列； (6)完成物種分類(lèi):通過(guò)16SrDNA V4高變區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，將非冗余的標(biāo)簽序列進(jìn)行物種注釋并聚類(lèi)成操作分類(lèi)單位，完成物種多樣性和物種豐度分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103981259SQ201410186729
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】王保玉, 劉建民, 白建平, 韓作穎, 劉健, 苗彪, 趙娜 申請(qǐng)人:山西晉城無(wú)煙煤礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司