技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及ATP結(jié)合盒(ATP-Binding Cassette)(“ABC”)轉(zhuǎn)運蛋白或其片段的調(diào)控劑，包括囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑(“CFTR”)、其組合物及其使用方法。本發(fā)明也涉及使用這類調(diào)控劑治療ABC轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的疾病的方法。
背景技術(shù)：
ABC轉(zhuǎn)運蛋白是膜轉(zhuǎn)運蛋白家族，調(diào)節(jié)廣泛多種藥理學(xué)物質(zhì)、潛在毒性藥物和外源物以及陰離子的轉(zhuǎn)運。ABC轉(zhuǎn)運蛋白是同源性膜蛋白，它們結(jié)合和利用細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)供它們的特異性活性。這些轉(zhuǎn)運蛋白中有些被發(fā)現(xiàn)是多藥耐受性蛋白(如MDR1-P糖蛋白或多藥耐受性蛋白MRP1)，為惡性癌細(xì)胞防御抵抗化學(xué)治療劑。迄今，已經(jīng)鑒別了48種ABC轉(zhuǎn)運蛋白，并基于它們的序列同一性和功能將它們分為7個家族。
ABC轉(zhuǎn)運蛋白在體內(nèi)調(diào)節(jié)多種重要的生理角色，并且提供對有害環(huán)境化合物的防御。因為如此，它們代表重要的潛在藥物靶，用于治療與該轉(zhuǎn)運蛋白缺陷有關(guān)的疾病、防止藥物從靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)運出去并干預(yù)其它其中ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性的調(diào)控可能是有益的疾病。
普遍與疾病有關(guān)的一個ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員是cAMP/ATP-介導(dǎo)的陰離子通道CFTR。CFTR在多種細(xì)胞類型(包括吸收性和分泌性上皮細(xì)胞)中被表達(dá)，在其中它調(diào)節(jié)陰離子的跨膜流動以及其它離子通道和蛋白質(zhì)的活性。在上皮細(xì)胞中，CFTR的正常功能發(fā)揮是維持電解質(zhì)在體內(nèi)各處(包括呼吸和消化組織)轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵。CFTR由大約1480個氨基酸組成，它們編碼由跨膜結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)重復(fù)所構(gòu)成的蛋白質(zhì)，其各自含有六個跨膜螺旋和一個核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。兩個跨膜結(jié)構(gòu)域通過大型極性調(diào)節(jié)性(R)-結(jié)構(gòu)域連接，具有多個調(diào)節(jié)通道活性和細(xì)胞運輸?shù)牧姿峄稽c。
編碼CFTR的基因已被鑒別和測序(參見Gregory，R.J.等人(1990)Nature 347:382-386；Rich，D.P.等人(1990)Nature 347:358-362)；(Riordan，J.R.等人(1989)Science 245:1066-1073)。這種基因的缺陷引起CFTR突變，導(dǎo)致囊性纖維化(“CF”)，這是人類最常見的致命性遺傳疾病。在美國，囊性纖維化影響大約兩千五百分之一的新生兒。在全部美國人口中，多達(dá)一千萬人攜帶有一個拷貝的缺陷基因，沒有明顯的疾病效應(yīng)。相反，帶有兩個拷貝的CF相關(guān)基因的個體患有CF的衰弱與致命性效應(yīng)，包括慢性肺疾病。
在囊性纖維化患者中，在呼吸道上皮中被內(nèi)源性表達(dá)的CFTR的突變引起頂端陰離子分泌減少，導(dǎo)致離子和流體轉(zhuǎn)運的失衡。所致陰離子轉(zhuǎn)運的減少對肺中粘液蓄積增強(qiáng)和伴隨的微生物感染有貢獻(xiàn)，所述感染最終導(dǎo)致CF患者死亡。除了呼吸疾病以外，CF患者通?；加形改c問題和胰腺機(jī)能不全，如果不加治療，胰腺機(jī)能不全則導(dǎo)致死亡。另外，大多數(shù)囊性纖維化男性是不育的，并且囊性纖維化女性的生育力降低。與兩個拷貝的CF相關(guān)基因的嚴(yán)重效應(yīng)相反，帶有一個拷貝的CF相關(guān)基因的個體表現(xiàn)出對霍亂和腹瀉所致脫水的抗性增加—這也許解釋了人群中CF基因的相對高頻率的原因。
CF染色體的CFTR基因的序列分析已經(jīng)揭示了多種致病性突變(Cutting，G.R.等人(1990)Nature 346:366-369；Dean，M.等人(1990)Cell 61:863：870；以及Kerem，B-S.等人(1989)Science 245:1073-1080；Kerem，B-S等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8447-8451)。迄今，已經(jīng)鑒別了1000種以上致病性CF基因突變(http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/)。最常見的突變是CFTR氨基酸序列508位苯丙氨酸的缺失，并且普遍將其稱為ΔF508-CFTR。這種突變發(fā)生在大約70％的囊性纖維化病例中，與嚴(yán)重的疾病有關(guān)。
ΔF508-CFTR中508殘基的缺失阻止初新生蛋白正確地折疊。這導(dǎo)致該突變蛋白不能退出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(“ER”)和運輸至質(zhì)膜。其結(jié)果是，膜中存在的通道數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于表達(dá)野生型CFTR的細(xì)胞中所觀察到的數(shù)量。除了運輸受損以外，該突變還導(dǎo)致缺陷性通道門控。總之，膜中通道數(shù)量減少和缺陷性門控引起陰離子穿過上皮的轉(zhuǎn)運減少，導(dǎo)致缺陷性離子和流體轉(zhuǎn)運(Quinton，P.M.(1990)，F(xiàn)ASEB J.4:2709-2727)。不過，研究已經(jīng)顯示，膜中ΔF508-CFTR的數(shù)量減少是功能性的，盡管少于野生型CFTR(Dalemans等人(1991)，Nature Lond.354:526-528；Denning等人，上文；Pasyk和Foskett(1995)，J.Cell.Biochem.270:12347-50)。除了ΔF508-CFTR以外，其它導(dǎo)致缺陷性運輸、合成和/或通道門控的致病性CFTR突變可能被上調(diào)或下調(diào)，以改變陰離子分泌和改變疾病進(jìn)展和/或嚴(yán)重性。
盡管CFTR除了陰離子以外還轉(zhuǎn)運多種分子，不過顯然這種角色(陰離子的轉(zhuǎn)運)代表了穿過上皮轉(zhuǎn)運離子和水的重要機(jī)理中的一種要素。其它要素包括上皮Na+通道、ENaC、Na+/2Cl-/K+協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白、Na+-K+-ATP酶泵和基底外側(cè)膜K+通道，它們負(fù)責(zé)攝取氯化物進(jìn)入細(xì)胞。
這些要素一起發(fā)揮作用，以經(jīng)由它們在細(xì)胞內(nèi)的選擇性表達(dá)和定位實現(xiàn)穿過上皮的定向轉(zhuǎn)運。借助存在于頂端膜上的ENaC與CFTR和在細(xì)胞基底外側(cè)表面上表達(dá)的Na+-K+-ATP酶泵與Cl-通道的協(xié)調(diào)活性，發(fā)生氯化物吸收。氯化物從腔側(cè)的次級主動轉(zhuǎn)運引起細(xì)胞內(nèi)氯化物的蓄積，然后可以被動地經(jīng)由Cl-通道離開細(xì)胞，導(dǎo)致向量轉(zhuǎn)運。Na+/2Cl-/K+協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白、Na+-K+-ATP酶泵和基底外側(cè)膜K+通道在基底外側(cè)表面上的排列以及腔側(cè)上的CFTR協(xié)調(diào)氯化物經(jīng)由腔側(cè)上CFTR的分泌。因為水可能從不主動轉(zhuǎn)運自己，所以它穿過上皮的流動依賴于由鈉和氯化物的大量流動所生成的微小跨上皮滲透梯度。
除了囊性纖維化以外，CFTR活性的調(diào)控也可以有益于其它不直接由CFTR突變所導(dǎo)致的疾病，例如分泌性疾病和其它由CFTR介導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊疾病。這些疾病包括但不限于慢性阻塞性肺疾病(COPD)、干眼病和斯耶格倫氏綜合征。
COPD的特征在于氣流受限，它是進(jìn)行性的，不是完全可逆的。氣流受限是因為粘液分泌過多、肺氣腫和細(xì)支氣管炎。突變CFTR或野生型CFTR的活化劑提供COPD中常見的粘液分泌過多和粘液纖毛清除減少的潛在治療。具體而言，增加穿過CFTR的陰離子分泌可以有利于流體轉(zhuǎn)運進(jìn)入氣道表面液體，以水化粘液，優(yōu)化纖毛周圍的流體粘度。這將引起粘液纖毛清除增強(qiáng)以及與COPD有關(guān)的癥狀減少。干眼病的特征在于淚水產(chǎn)生減少和異常淚膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與粘蛋白特征。干眼有很多原因，其中一些包括年齡、Lasik眼手術(shù)、關(guān)節(jié)炎、藥物治療、化學(xué)/熱灼傷、變態(tài)反應(yīng)和疾病，例如囊性纖維化和斯耶格倫氏綜合征。增加經(jīng)由CFTR的陰離子分泌將增強(qiáng)流體從角膜內(nèi)皮細(xì)胞和眼周圍分泌腺體的轉(zhuǎn)運，以增加角膜的水化作用。這將有助于緩解與干眼病有關(guān)的癥狀。斯耶格倫氏綜合征是一種自身免疫疾病，其中免疫系統(tǒng)攻擊體內(nèi)各處產(chǎn)生水分的腺體，包括眼、口、皮膚、呼吸組織、肝、陰道和腸。癥狀包括眼、口和陰道干燥以及肺疾病。該疾病也與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性狼瘡、系統(tǒng)性硬化和多肌炎/皮膚肌炎有關(guān)。缺陷性蛋白質(zhì)運輸據(jù)信會導(dǎo)致該疾病，用于它的治療選擇是有限的。CFTR活性的調(diào)控劑可以水化各種受該疾病影響的器官，幫助改善有關(guān)癥狀。
正如上文所討論的，據(jù)信ΔF508-CFTR中508殘基的缺失阻止新生蛋白正確地折疊，導(dǎo)致這種突變蛋白不能退出ER并運輸至質(zhì)膜。其結(jié)果是，存在于質(zhì)膜的成熟蛋白數(shù)量不足，上皮組織內(nèi)氯化物的轉(zhuǎn)運顯著減少。事實上，這種ABC轉(zhuǎn)運蛋白被ER機(jī)構(gòu)缺陷性ER加工的細(xì)胞現(xiàn)象已被顯示不僅是CF疾病的潛在礎(chǔ)，而且是廣泛的其它孤立性與遺傳性疾病的潛在礎(chǔ)。ER機(jī)構(gòu)可能發(fā)生故障的兩種方式要么是與蛋白質(zhì)的ER輸出的偶聯(lián)喪失，引起降解，要么是這些有缺陷/誤折疊的蛋白質(zhì)的ER蓄積[Aridor M，等人，Nature Med.，5(7)，pp 745-751(1999)；Shastry，B.S.，等人，Neurochem.International，43，pp 1-7(2003)；Rutishauser，J.,等人，Swiss Med Wkly，132，pp 211-222(2002)；Morello，JP等人，TIPS，21，pp.466-469(2000)；Bross P.，等人，Human Mut.，14，pp.186-198(1999)]。與第一類ER功能障礙有關(guān)的疾病有囊性纖維化(正如上文所討論的，其由誤折疊的ΔF508-CFTR引起)、遺傳性肺氣腫(由a1-抗胰蛋白酶；非Piz變體引起)、遺傳性血色素沉著、凝血-纖維蛋白溶解缺陷(例如C蛋白缺陷)、1型遺傳性血管水腫、脂質(zhì)加工缺陷(例如家族性高膽固醇血)、1型乳糜微粒血、無β脂蛋白血癥、溶酶體貯積病(例如I-細(xì)胞疾病/假性Hurler)、粘多糖病(由溶酶體加工酶引起)、Sandhof/Tay-Sachs(由β-己糖胺酶引起)、II型Crigler-Najjar(由UDP-葡糖醛基-唾液?；?轉(zhuǎn)移酶引起)、多內(nèi)分泌腺病/高胰島素血、糖尿病(由胰島素受體引起)、拉倫(Laron)侏儒癥(由生長激素受體引起)、髓過氧化物酶缺陷、原發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能減退(由前促甲狀旁腺激素引起)、黑素瘤(由酪氨酸酶引起)。與后一類ER功能障礙有關(guān)的疾病有1型聚糖病CDG、遺傳性肺氣腫(由α1-抗胰蛋白酶(PiZ變體)引起)、先天性甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、成骨不全(由I、II、IV型前膠原引起)、遺傳性低纖維蛋白原血(由纖維蛋白原引起)、ACT缺陷(由α1-抗凝乳蛋白酶引起)、尿崩癥(DI)、神經(jīng)生長性(neurophyseal)DI(由加壓素/V2-受體引起)、腎原性DI(由水通道蛋白II引起)、夏-馬-圖三氏(Charcot-Marie-Tooth)綜合征(由外周髓磷脂蛋白22引起)、佩-梅二氏(Perlizaeus-Merzbacher)病、神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默氏病(由βAPP和早老蛋白引起)、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、進(jìn)行性核上性麻痹、皮克氏病)、若干聚谷氨酰胺神經(jīng)病學(xué)障礙(例如亨廷頓氏病、I型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、脊髓與延髓肌肉萎縮、齒狀核蒼白球丘腦下核萎縮和肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良)以及海綿狀腦病(例如遺傳性克-雅二氏(Creutzfeldt-Jakob)病(由朊病毒蛋白加工缺陷引起)、法布里氏(Fabry)病(由溶酶體α-半乳糖苷酶A引起)和斯-施二氏(Straussler-Scheinker)綜合征、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、干眼病和斯耶格倫氏綜合征。
除了CFTR活性的上調(diào)以外，通過CFTR調(diào)控劑來減少陰離子分泌也可以有益于分泌性腹瀉的治療，其中作為促分泌素活化的氯化物轉(zhuǎn)運的結(jié)果，上皮水轉(zhuǎn)運顯著地增加。該機(jī)理牽涉cAMP的升高和CFTR的刺激。
盡管腹瀉有許多原因，不過由過量氯化物轉(zhuǎn)運所致腹瀉性疾病的主要后果是所有原因所共有的，包括脫水、酸中毒、生長減退和死亡。
急性腹瀉與慢性腹瀉在世界很多地區(qū)代表了主要的醫(yī)學(xué)問題。在小于五歲的兒童中，腹瀉既是營養(yǎng)不良的顯著因素，又是死亡的主要原因(5,000,000例死亡/年)。
在獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)和慢性炎性腸疾病(IBD)患者中，分泌性腹瀉也是危險的病況。每年從工業(yè)化國家到發(fā)展中國家旅行的人中有一千六百萬人患上腹瀉，腹瀉病例的嚴(yán)重性和數(shù)量因旅行的國家和地區(qū)而異。
圈養(yǎng)動物和寵物，例如牛、豬、馬、綿羊、山羊、貓和狗的腹瀉也稱為家畜腹瀉病，是這些動物死亡的主要原因。腹瀉可以由任何重大轉(zhuǎn)變所致，例如斷奶或身體運動，以及響應(yīng)于多種細(xì)菌或病毒感染，一般發(fā)生在動物壽命的前幾個小時內(nèi)。
最常見的致腹瀉性細(xì)菌是腸毒原性大腸桿菌(ETEC)，其具有K99菌毛抗原。腹瀉的常見病毒原因包括輪狀病毒和冠狀病毒。其它感染性因子包括隱孢子蟲、蘭伯氏賈第蟲和沙門氏菌等等。
輪狀病毒感染的癥狀包括水樣便的排泄、脫水和虛弱。在新生動物中，冠狀病毒導(dǎo)致更嚴(yán)重的疾病，具有比輪狀病毒感染更高的死亡率。不過經(jīng)常，年幼動物可能同時感染有一種以上病毒或者病毒與細(xì)菌微生物的組合。這顯著地增加疾病的嚴(yán)重性。
因此，需要ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性的調(diào)控劑及其組合物，它們能夠用于調(diào)控哺乳動物細(xì)胞膜中ABC轉(zhuǎn)運蛋白的活性。
需要用ABC轉(zhuǎn)運蛋白的這類調(diào)控劑來治療ABC轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的疾病的方法。
需要在離體的哺乳動物細(xì)胞膜中調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性的方法。
需要CFTR活性調(diào)控劑，其可以用于調(diào)控哺乳動物細(xì)胞膜中CFTR的活性。
需要用這類CFTR活性調(diào)控劑治療CFTR介導(dǎo)疾病的方法。
需要在離體的哺乳動物細(xì)胞膜中調(diào)控CFTR活性的方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的化合物及其藥學(xué)上可接受的組合物可用作ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性(特別是CFTR活性)的調(diào)控劑。這些化合物具有通式I：
或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中Ar1、RN、A環(huán)、B環(huán)和J如下所述。
這些化合物及其藥學(xué)上可接受的組合物可用于治療多種疾病、障礙或病況或者減輕其嚴(yán)重性，所述疾病、障礙或病況包括但不限于囊性纖維化、遺傳性肺氣腫、遺傳性血色素沉著、凝血-纖維蛋白溶解缺陷(例如C蛋白缺陷)、1型遺傳性血管水腫、脂質(zhì)加工缺陷(例如家族性高膽固醇血癥)、1型乳糜微粒血癥、無β脂蛋白血癥、溶酶體貯積病(例如I-細(xì)胞疾病/假性Hurler)、粘多糖病、Sandhof/Tay-Sachs、Crigler-Najjar II型、多內(nèi)分泌腺病/高胰島素血、糖尿病、拉倫侏儒、髓過氧化物酶缺陷、原發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能減退、黑素瘤、聚糖病CDG 1型、遺傳性肺氣腫、先天性甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、成骨不全、遺傳性低纖維蛋白原血、ACT缺陷、尿崩癥(di)、神經(jīng)生長性di、腎原性DI、夏-馬-圖三氏綜合征、佩-梅二氏病、神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、進(jìn)行性核上性麻痹、皮克氏病)、若干聚谷氨酰胺神經(jīng)病學(xué)障礙例如亨廷頓氏病、I型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、脊髓與延髓肌肉萎縮、齒狀核紅核蒼白球丘腦下核萎縮和肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良，以及海綿狀腦病例如遺傳性克-雅二氏病、法布里氏病和斯-施二氏綜合征、COPD、干眼病和斯耶格倫氏病。
本發(fā)明的詳細(xì)說明
本發(fā)明化合物的一般性描述：
本發(fā)明涉及式I的化合物：
或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中：
Ar1是：
Ar1任選被w個-W-RW取代；其中
W獨立地是鍵或任選被取代的(C1-C6)亞烷基鏈，其中W的至多兩個亞甲基單元獨立地被-CO-、-O-、-S-、-SO2-或-NR'-替代；
R'獨立地是H、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；以及
RW獨立地是H、鹵素、CN、NO2，NH2、CF3、OCF3、OH、烷氧基或任選被取代的脂肪族基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基，其中，當(dāng)被取代時，Rw被至多兩個R2取代；
R2是鹵素、CN、NO2、CF3、OCF3、OR、-(C1-C6)亞烷基-OH、-(C1-C6)亞烷基-N(R)2、OC(O)R、OC(O)N(R)2、SR、S(O)R、SO2R、SO2N(R)2、SO3R、C(O)R、CO2R、C(O)N(R)2、N(R)2、NRC(O)R、NRCO2R、NRC(O)N(R)2、NRSO2R、B(OR)2或NRSO2N(R)2；
R獨立地是H、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基；
RN是H、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
A是任選被取代的3-7元單環(huán)；
B任選與5-7元環(huán)稠合，所述環(huán)選自脂環(huán)族基、芳基、雜環(huán)基和雜芳基；
J選自CH2、CF2、C(CH3)2、C(O)、C(苯基)2、B(OH)和CH(OEt)；以及
w是包括端值在內(nèi)的0至4的整數(shù)；
條件是，當(dāng)Ar1是時，W獨立地是任選被取代的(C1-C6)亞烷基鏈，其中W的至多兩個亞甲基單元獨立地被-CO-、-O-、-S-、-SO2-或-NR'-替代。
組合物和定義：
本發(fā)明化合物包括上文一般性描述的那些，并通過本文公開的類型、小類和品種進(jìn)一步闡述。在本文中使用下列定義時，除非另有說明，否則應(yīng)當(dāng)適用。
本文所用的術(shù)語“ABC-轉(zhuǎn)運蛋白”意指包含至少一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域的ABC-轉(zhuǎn)運蛋白或其片段，其中所述蛋白質(zhì)或其片段是體內(nèi)或體外存在的。本文所用的術(shù)語“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”意指ABC-轉(zhuǎn)運蛋白上能夠與調(diào)控劑結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。例如參見Hwang，T.C.等人，J.Gen.Physiol.(1998):111(3)，477-90。
本文所用的術(shù)語“CFTR”意指囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑或其有調(diào)節(jié)劑活性的突變體，包括但不限于ΔF508CFTR和G551D CFTR(關(guān)于CFTR突變，例如參見http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/)。
本文所用的術(shù)語“調(diào)控”意指增加或降低可測量的量。
出于本發(fā)明的目的，根據(jù)元素周期表CAS版Handbook of Chemistry and Physics，第75版鑒定化學(xué)元素。另外，有機(jī)化學(xué)的一般原理描述在“Organic Chemistry”，Thomas Sorrell，University Science Books，Sausalito:1999和“March's Advanced Organic Chemistry”，第5版，Ed.:Smith，M.B.和March，J.，John Wiley&Sons，New York:2001中，通過引用將其全部內(nèi)容并入本說明書。
正如本文所述，本發(fā)明的化合物可以任選地被一個或多個取代基取代，例如上文一般性闡述的，或者如通過本發(fā)明的特定類型、小類和品種所例證的。將被領(lǐng)會到，短語“任選被取代的”與短語“被取代或未被取代的”是可互換使用的。一般而言，術(shù)語“被取代的”無論其前面有無術(shù)語“任選”，都表示給定結(jié)構(gòu)中的氫原子團(tuán)被指定取代基的原子團(tuán)所代替。除非另有說明，任選被取代的基團(tuán)可以在該基團(tuán)每個可取代的位置上具有取代基，若任意給定結(jié)構(gòu)中一個以上位置可以被一個以上選自指定組的取代基所取代，則取代基可以在每個位置上是相同或不同的。本發(fā)明所關(guān)注的取代基組合優(yōu)選地是能形成穩(wěn)定的或化學(xué)上可行的化合物的那些。本文所用的短語“穩(wěn)定”表示在受到用于它們制備、檢測，優(yōu)選回收、純化的條件和用于一種或多種本文所公開的目的時基本上不變的化合物。在有些實施方案中，穩(wěn)定的化合物或化學(xué)上可行的化合物是在沒有水分或其它化學(xué)反應(yīng)性條件的存在下、在40℃或以下的溫度下保持至少一周而基本上不發(fā)生變化的化合物。
本文所用的術(shù)語“脂肪族基”或“脂肪族基團(tuán)”意指直鏈(即未分支)或支鏈的取代或未取代的烴鏈，其是完全飽和的或者含有一個或多個不飽和單元，或者意指單環(huán)烴或二環(huán)烴，其是完全飽和的或者含有一個或多個不飽和單元，但不是芳族的(本文也稱之為“碳環(huán)”、“脂環(huán)族基”或“環(huán)烷基”)，其具有單一的與分子其余部分連接的點。除非另有指定，脂肪族基團(tuán)含有1－20個脂肪族碳原子。在有些實施方案中，脂肪族基團(tuán)含有1－10個脂肪族碳原子。在其它實施方案中，脂肪族基團(tuán)含有1－8個脂肪族碳原子。在其它實施方案中，脂肪族基團(tuán)含有1－6個脂肪族碳原子，在其它實施方案中，脂肪族基團(tuán)含有1－4個脂肪族碳原子。在有些實施方案中，“脂環(huán)族基”(或者“碳環(huán)”或“環(huán)烷基”)表示單環(huán)C3-C8烴或二環(huán)C8-C12烴，其是完全飽和的或者含有一個或多個不飽和單元，但不是芳族的，其具有單一的與分子其余部分連接的點，其中所述二環(huán)環(huán)系中任意單一的環(huán)是3-7元環(huán)。適合的脂肪族基團(tuán)包括但不限于直鏈或支鏈的取代或未取代的烷基、烯基、炔基及其雜合基，例如(環(huán)烷基)烷基、(環(huán)烯基)烷基或(環(huán)烷基)烯基。
本文所用的術(shù)語“雜脂肪族基”意指脂肪族基團(tuán)，其中一個或兩個碳原子獨立地被一個或多個氧、硫、氮、磷或硅代替。雜脂肪族基團(tuán)可以是取代或未取代的，分支或未分支的，環(huán)狀或無環(huán)的，包括“雜環(huán)烷基”、“雜環(huán)基”、“雜脂環(huán)族”或“雜環(huán)的”基團(tuán)。
本文所用的術(shù)語“雜環(huán)烷基”、“雜環(huán)基”、“雜脂環(huán)族”或“雜環(huán)的”等意指非芳族的單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)環(huán)系，其中一個或多個環(huán)成員是獨立選擇的雜原子。在有些實施方案中，所述“雜環(huán)烷基”、“雜環(huán)基”、“雜脂環(huán)族”或“雜環(huán)的”基團(tuán)具有三至十四個環(huán)成員，其中一個或多個環(huán)成員是獨立選自氧、硫、氮和磷的雜原子，該系統(tǒng)中每個環(huán)含有3至7個環(huán)成員。
術(shù)語“雜原子”意指一個或多個硼、氧、硫、氮、磷或硅(包括氮、硫、磷或硅的任意氧化形式；任意堿性氮或雜環(huán)可取代氮的季銨化形式，例如N(如在3,4-二氫-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或NR+(如在N-取代的吡咯烷基中))。
本文所用的術(shù)語“不飽和的”意指該部分具有一個或多個不飽和單元。
本文所用的術(shù)語“烷氧基”或“硫代烷基”表示如前文所定義的烷基，其通過氧(“烷氧基”)或硫(“硫代烷基”)原子與主碳鏈連接。
術(shù)語“鹵代脂肪族基”和“鹵代烷氧基”意指被一個或多個鹵原子取代的脂肪族基或烷氧基，視情況而定。術(shù)語“鹵素”表示F、Cl、Br或I。鹵代脂肪族基的實例包括-CHF2、-CH2F、-CF3、-CF2-或全鹵代烷基，比如，-CF2CF3。
單獨使用或者作為更大部分“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”的一部分使用的術(shù)語“芳基”表示具有總計五至十四個環(huán)成員的單環(huán)、二環(huán)和三環(huán)環(huán)系，其中該系統(tǒng)中至少一個環(huán)是芳族的，并且其中該系統(tǒng)中每一環(huán)含有3至7個環(huán)成員。術(shù)語“芳基”可以與術(shù)語“芳基環(huán)”互換使用。術(shù)語“芳基”也表示如下定義的雜芳基環(huán)系。
單獨使用或者作為更大部分“雜芳烷基”或“雜芳基烷氧基”的一部分使用的術(shù)語“雜芳基”表示具有總計五至十四個環(huán)成員的單環(huán)、二環(huán)和三環(huán)環(huán)系，其中該系統(tǒng)中至少一個環(huán)是芳族的，該系統(tǒng)中至少一個環(huán)含有一個或多個雜原子，并且其中該系統(tǒng)中每一環(huán)含有3至7個環(huán)成員。術(shù)語“雜芳基”可以與術(shù)語“雜芳基環(huán)”或術(shù)語“雜芳族基”互換使用。
芳基(包括芳烷基、芳烷氧基、芳氧基烷基等)或雜芳基(包括雜芳烷基和雜芳烷氧基等)可以含有一個或多個取代基。芳基或雜芳基基團(tuán)的不飽和碳原子上的適宜取代基選自鹵素、-Rο、-ORο、-SRο、1,2-亞甲二氧基、1,2-亞乙二氧基、任選被Rο取代的苯基(Ph)、任選被Rο取代的-O(Ph)、任選被Rο取代的-(CH2)1-2(Ph)、任選被Rο取代的-CH＝CH(Ph)、-NO2、-CN、-N(Rο)2、-NRοC(O)Rο、-NRοC(O)N(Rο)2、-NRοCO2Rο、-NRοNRοC(O)Rο、-NRοNRοC(O)N(Rο)2、-NRοNRοCO2Rο、-C(O)C(O)Rο、-C(O)CH2C(O)Rο、-CO2Rο、-C(O)Rο、-C(O)N(Rο)2、-OC(O)N(Rο)2、-S(O)2Rο、-SO2N(Rο)2、-S(O)Rο、-NRοSO2N(Rο)2、-NRοSO2Rο、-C(＝S)N(Rο)2、-C(＝NH)-N(Rο)2和-(CH2)0-2NHC(O)Rο，其中每次獨立出現(xiàn)的Rο選自氫、任選被取代的C1-6脂肪族基、未取代的5-6元雜芳基環(huán)或雜環(huán)、苯基、-O(Ph)或-CH2(Ph)，或者盡管有如上定義，在相同取代基或不同取代基上的兩次獨立出現(xiàn)的Rο與每個Rο基團(tuán)所鍵合的原子一起構(gòu)成3-8元環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基環(huán)，其具有0-3個獨立選自氮、氧和硫的雜原子。Rο的脂肪族基團(tuán)上任選的取代基選自NH2、NH(C1-4脂肪族基)、N(C1-4脂肪族基)2、鹵素、C1-4脂肪族基、OH、O(C1-4脂肪族基)、NO2、CN、CO2H、CO2(C1-4脂肪族基)、O(鹵代C1-4脂肪族基)和鹵代C1-4脂肪族基，其中Rο的每個上述C1-4脂肪族基團(tuán)是未取代的。
脂肪族或雜脂肪族基團(tuán)或者非芳族雜環(huán)可以含有一個或多個取代基。脂肪族或雜脂肪族基團(tuán)或者非芳族雜環(huán)的飽和碳原子上的適合取代基選自上面關(guān)于芳基或雜芳基不飽和碳所列舉的那些，并且另外包括下列基團(tuán)：＝O、＝S、＝NNHR*、＝NN(R*)2、＝NNHC(O)R*、＝NNHCO2(烷基)、＝NNHSO2(烷基)和＝NR*，其中每個R*獨立地選自氫和任選被取代的C1-6脂肪族基。R*的脂肪族基團(tuán)上的任選取代基選自NH2、NH(C1-4脂肪族基)、N(C1-4脂肪族基)2、鹵素、C1-4脂肪族基、OH、O(C1-4脂肪族基)、NO2、CN、CO2H、CO2(C1-4脂肪族基)、O(鹵代C1-4脂肪族基)和鹵代C1-4脂肪族基，其中R*的每個上述C1-4脂肪族基團(tuán)是未取代的。
非芳族雜環(huán)的氮上的任選取代基選自-R+、-N(R+)2、-C(O)R+、-CO2R+、-C(O)C(O)R+、-C(O)CH2C(O)R+、-SO2R+、-SO2N(R+)2、-C(＝S)N(R+)2、-C(＝NH)-N(R+)2和-NR+SO2R+；其中R+是氫、任選被取代的C1-6脂肪族基、任選被取代的苯基、任選被取代的-O(Ph)、任選被取代的-CH2(Ph)、任選被取代的-(CH2)1-2(Ph)、任選被取代的-CH＝CH(Ph)、或者具有一至四個獨立選自氧、氮和硫的雜原子的未取代的5-6元雜芳基環(huán)或雜環(huán)，或者盡管有如上定義，在相同取代基或不同取代基上的兩次獨立出現(xiàn)的R+與每個R+基團(tuán)所鍵合的原子一起構(gòu)成3-8元環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基環(huán)，其具有0-3個獨立選自氮、氧和硫的雜原子。R+的脂肪族基團(tuán)或苯基環(huán)上的任選取代基選自NH2、NH(C1-4脂肪族基)、N(C1-4脂肪族基)2、鹵素、C1-4脂肪族基、OH、O(C1-4脂肪族基)、NO2、CN、CO2H、CO2(C1-4脂肪族基)、O(鹵代C1-4脂肪族基)和鹵代(C1-4脂肪族基團(tuán))，其中R+的每個上述C1-4脂肪族基團(tuán)是未取代的。
術(shù)語“亞烷基鏈”表示直鏈或支鏈碳鏈，它可以是完全飽和的或者具有一個或多個不飽和單元，并且具有兩個與分子其余部分連接的點。術(shù)語“亞螺環(huán)烷基”表示這樣一種碳環(huán)，它可以是完全飽和的或者具有一個或多個不飽和單元，并且同一環(huán)碳原子具有兩個與分子其余部分連接的點。
如上所述，在有些實施方案中，兩次獨立出現(xiàn)的Rο(或者R+或本文相似定義的任意其它變量)與每個變量所鍵合的原子一起構(gòu)成3－8元環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基環(huán)，其具有0－3個獨立選自氮、氧和硫的雜原子。兩次獨立出現(xiàn)的Rο(或者R+或本文相似定義的任意其它變量)與每個變量所鍵合的原子結(jié)合在一起時所構(gòu)成的示范性環(huán)包括但不限于下列：a)兩個獨立出現(xiàn)的Rο(或者R+或本文相似定義的任意其它變量)鍵合于同一原子，并且與該原子一起構(gòu)成一個環(huán)，例如N(Rο)2，其中出現(xiàn)的兩個Rο與氮原子一起構(gòu)成哌啶-1-基、哌嗪-1-基或嗎啉-4-基；以及b)兩個獨立出現(xiàn)的Rο(或者R+或本文相似定義的任意其它變量)鍵合于不同原子，并且與這兩個原子一起構(gòu)成一個環(huán)，例如其中苯基被兩次出現(xiàn)的ORο取代這兩次出現(xiàn)的Rο與它們所鍵合的氧原子一起構(gòu)成稠合的6-元含氧環(huán)：將被領(lǐng)會到，兩次獨立出現(xiàn)的Rο(或者R+或本文相似定義的任意其它變量)與每個變量所鍵合的原子結(jié)合在一起時可以構(gòu)成多種其它環(huán)，上述詳細(xì)實例不打算是限制性的。
除非另有規(guī)定，本文所描繪的結(jié)構(gòu)也意味著包括該結(jié)構(gòu)的所有異構(gòu)(例如對映異構(gòu)、非對映異構(gòu)和幾何異構(gòu)(或構(gòu)象異構(gòu)))形式；例如每一不對稱中心的R與S構(gòu)型，(Z)與(E)雙鍵異構(gòu)體，和(Z)與(E)構(gòu)象異構(gòu)體。因此，這些化合物的單一立體化學(xué)異構(gòu)體以及對映異構(gòu)、非對映異構(gòu)和幾何異構(gòu)(或構(gòu)象異構(gòu))混合物都屬于本發(fā)明的范圍。除非另有規(guī)定，本發(fā)明化合物的所有互變異構(gòu)形式都屬于本發(fā)明的范圍。另外，除非另有規(guī)定，本文所描繪的結(jié)構(gòu)也意味著包括僅在一個或多個同位素富集原子的存在上有所不同的化合物。例如，除了氫被氘或氚代替或者碳被13C-或14C-富集的碳代替以外具有本發(fā)明結(jié)構(gòu)的化合物都屬于本發(fā)明的范圍。這類化合物例如可用作生物學(xué)測定法中的分析工具或探針。
舉例性化合物的描述：
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物：
或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中：
Ar1是：
Ar1任選被w個-W-RW取代；其中
W獨立地是鍵或任選被取代的(C1-C6)亞烷基鏈，其中W的至多兩個亞甲基單元獨立地被-CO-、-O-、-S-、-SO2-或-NR'-替代；
R'獨立地是H、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；以及
RW獨立地是H、鹵素、CN、NO2，NH2、CF3、OCF3、OH、烷氧基或任選被取代的脂肪族基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基，其中，當(dāng)被取代時，Rw被至多兩個R2取代；
R2是鹵素、CN、NO2、CF3、OCF3、OR、-(C1-C6)亞烷基-OH、-(C1-C6)亞烷基-N(R)2、OC(O)R、OC(O)N(R)2、SR、S(O)R、SO2R、SO2N(R)2、SO3R、C(O)R、CO2R、C(O)N(R)2、N(R)2、NRC(O)R、NRCO2R、NRC(O)N(R)2、NRSO2R，B(OH)2或NRSO2N(R)2；
R獨立地是H、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基；
RN是H、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基；
A是任選被取代的3-7元單環(huán)；
B任選與5-7元環(huán)稠合，所述環(huán)選自脂環(huán)族基、芳基、雜環(huán)基和雜芳基；
J選自CH2、CF2、C(CH3)2、C(O)、C(苯基)2、B(OH)和CH(OEt)；以及
w是包括端值在內(nèi)的0至4的整數(shù)；
條件是，當(dāng)Ar1是時，W獨立地是任選被取代的(C1-C6)亞烷基鏈，其中W的至多兩個亞甲基單元獨立地被-CO-、-O-、-S-、-SO2-或-NR'-替代。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物和伴隨的定義，其中A選自：
其中
R3是烷基、烷芳基、芳基或雜芳基；以及q是包括端值在內(nèi)的0至4的整數(shù)。在另一個實施方案中，A是在另一個實施方案中，A是
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物和伴隨的定義，其中J是CH2。在另一個實施方案中，J是CF2。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物和伴隨的定義，其中RN是H、芳基或雜芳基。在另一個實施方案中，RN是H或雜芳基。在另一個實施方案中，RN是雜芳基。在另一個實施方案中，RN是H。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物和伴隨的定義，其中Ar1與5-7元單環(huán)或9-11雙環(huán)稠合，所述環(huán)選自脂環(huán)族基、芳基、雜環(huán)基和雜芳基。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物和伴隨的定義，其中任選被取代的Ar1是在另一個實施方案中，任選被取代的Ar1是在另一個實施方案中，任選被取代的Ar1是在另一個實施方案中，任選被取代的Ar1是在另一個實施方案中，任選被取代的Ar1是在另一個實施方案中，任選被取代的Ar1是
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物和伴隨的定義，其中w是0。在另一個實施方案中，w是1。在另一個實施方案中，w是2。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物和伴隨的定義，其中W是鍵。在另一個實施方案中，W是任選被取代的(C1-C6)亞烷基鏈。在另一個實施方案中，W是-CH2-。在另一個實施方案中，W是-NH-。在另一個實施方案中，W是-O-。在另一個實施方案中，W是-SO2-。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物和伴隨的定義，其中Rw是H。在另一個實施方案中，Rw是OH。在另一個實施方案中，Rw是芳基。在另一個實施方案中，Rw是苯基。在另一個實施方案中，Rw是雜芳基。在另一個實施方案中，Rw是吡啶基。在另一個實施方案中，Rw是烷氧基。在另一個實施方案中，Rw是甲氧基。在另一個實施方案中，Rw是三氟甲氧基。在另一個實施方案中，Rw是環(huán)烷基。在另一個實施方案中，Rw是環(huán)己基。在另一個實施方案中，Rw是雜環(huán)烷基。在另一個實施方案中，Rw是未飽和的雜環(huán)烷基。在另一個實施方案中，Rw是吡啶酮。在另一個實施方案中，Rw是-(C1-C6)亞烷基-N(R)2。在另一個實施方案中，Rw是-(C1-C6)亞烷基-OH。在另一個實施方案中，Rw是-CH2OH。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物和伴隨的定義，其中Ar1被無環(huán)-W-Rw取代。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物和伴隨的定義，其中Ar1被-W-Rw取代，所述-W-Rw是芳基、雜芳基或環(huán)烷基。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物和伴隨的定義，其中Ar1被至少一個-W-Rw取代，所述-W-Rw具有下式
其中，
W是直鏈或支鏈(C1-C6)亞烷基，其中亞甲基可以被-O-、-SO2-或-NR’-替代；
R’是H或烷基；
C是芳基或雜芳基；
R4是鹵素、-(C1-C6)烷基、CN、NO2、CF3、OCF3、OR、-(C1-C6)亞烷基-OH、SO2N(R)2、NRSO2R、C(O)R、CO2R、C(O)N(R)2、N(R)2或NRC(O)R；以及
q是包括端值在內(nèi)的0至5的整數(shù)。
在另一個實施方案中，Ar1被至少一個-W-Rw取代，所述-W-Rw選自下列基團(tuán)：
-OH，-CH3，-OMe，-CN，-CF3，
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物和伴隨的定義，其中Ar1被至少一個-W-Rw取代，所述-W-Rw選自下列基團(tuán)：
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有式Ia的化合物：
其中：
J是CH2或CF2；
RN是H、烷基、芳基或雜芳基；
Ar1是
Ar1任選被w個-W-RW取代；其中
W獨立地是鍵或任選被取代的(C1-C6)亞烷基鏈，其中W的至多兩個亞甲基單元獨立地被-O-、-SO2-或-NR'-替代；
R'獨立地是H、烷基或芳基；以及
RW獨立地是H、鹵素、CN、CF3、OH、烷氧基或任選被取代的脂肪族基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基，其中，當(dāng)被取代時，Rw被至多兩個R2取代；
R2是鹵素、CF3、OR、-(C1-C6)亞烷基-OH、SO2N(R)2、CO2R、C(O)N(R)2、B(OH)2或N(R)2；
R獨立地是H、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基；以及
w是包括端值在內(nèi)的0至4的整數(shù)；
條件是，當(dāng)Ar1是時，W獨立地是任選被取代的(C1-C6)亞烷基鏈，其中W的至多兩個亞甲基單元獨立地被-CO-、-O-、-S-、-SO2-或-NR'-替代。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式Ia的化合物和伴隨的定義，其中J是CH2。在另一個實施方案中，J是CF2。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式Ia的化合物和伴隨的定義，其中RN是H或雜芳基。在另一個實施方案中，RN是雜芳基。在另一個實施方案中，RN是H。
在另一個實施方案中，Ar1選自下列基團(tuán)：
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式Ia的化合物和伴隨的定義，其中Ar1被無環(huán)-W-Rw取代。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式Ia的化合物和伴隨的定義，其中Ar1被-W-Rw取代，所述-W-Rw是芳基、雜芳基或環(huán)烷基環(huán)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式Ia的化合物和伴隨的定義，其中Ar1被-W-Rw取代，所述-W-Rw是未被取代的雜環(huán)烷基。在還一個實施方案中，-W-Rw是吡啶酮。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式Ia的化合物和伴隨的定義，其中Ar1被至少一個-W-Rw取代，所述-W-Rw選自下列基團(tuán)：
–OH，-CH3，-OMe，-CN，-CF3，
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式Ia的化合物和伴隨的定義，其中Ar1被至少一個-W-Rw取代，所述-W-Rw選自下列基團(tuán)：
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式Ia的化合物和伴隨的定義，其中Ar1選自下列基團(tuán)：
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有式Ib的化合物：
或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中：
Ar1選自下列基團(tuán)：
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有式Ic的化合物：
或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中：
Ar1選自下列基團(tuán)：
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及舉例性化合物，其選自表1。
表1.
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含(i)本發(fā)明的化合物；以及(ii)藥學(xué)上可接受的載體。在另一個實施方案中，藥物組合物還包含另外的藥劑，該另外的藥劑選自黏液溶解藥、支氣管擴(kuò)張藥、抗生素、抗感染藥、抗炎藥、CFTR矯正劑和營養(yǎng)劑。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種調(diào)控細(xì)胞膜中ABC轉(zhuǎn)運蛋白的方法，該方法包括使所述的細(xì)胞與本發(fā)明化合物接觸的步驟。在另一個實施方案中，所述ABC轉(zhuǎn)運蛋白是CFTR。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種治療患者中涉及ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性的病況、疾病或障礙的方法，其包括將本發(fā)明的化合物給予所述患者的步驟。在另一個實施方案中，所述ABC轉(zhuǎn)運蛋白是CFTR。在另一個實施方案中，所述的病況、疾病或障礙選自囊性纖維化、遺傳性肺氣腫、遺傳性血色素沉著、凝血-纖維蛋白溶解缺陷例如C蛋白缺陷、1型遺傳性血管水腫、脂質(zhì)加工缺陷例如家族性高膽固醇血癥、1型乳糜微粒血癥、無β脂蛋白血癥、溶酶體貯積病例如I-細(xì)胞疾病/假性Hurler、粘多糖病、Sandhof/Tay-Sachs、Crigler-Najjar II型、多內(nèi)分泌腺病/高胰島素血、糖尿病、拉倫侏儒、髓過氧化物酶缺陷、原發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能減退、黑素瘤、聚糖病CDG 1型、遺傳性肺氣腫、先天性甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、成骨不全、遺傳性低纖維蛋白原血、ACT缺陷、尿崩癥(DI)、神經(jīng)生長性DI、腎原性DI、夏-馬-圖三氏綜合征、佩-梅二氏病、神經(jīng)變性疾病例如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、進(jìn)行性核上性麻痹、皮克氏病、若干聚谷氨酰胺神經(jīng)病學(xué)障礙例如亨廷頓氏病、I型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、脊髓與延髓肌肉萎縮、齒狀核紅核蒼白球丘腦下核萎縮和肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良，以及海綿狀腦病例如遺傳性克-雅二氏病、法布里氏病、斯-施二氏綜合征、COPD、干眼病和斯耶格倫氏病。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于在體外或體內(nèi)測量生物樣品中ABC轉(zhuǎn)運蛋白或其片段的活性的試劑盒，該試劑盒包含：(i)包含本發(fā)明的化合物的第一組合物；以及(ii)關(guān)于如下內(nèi)容的說明書：a)使所述組合物與生物樣品接觸；以及b)測定所述ABC轉(zhuǎn)運蛋白或其片段的活性。
一般性合成方案
可以通過本領(lǐng)域中眾所周知的方法，制備式I的化合物。下面舉例說明的是用于制備式I化合物的典型方法。下面的方案I舉例說明了用于式I化合物的典型合成方法。
合成方案
可以通過已知的方法和方案I-III中舉例說明的方法，制備本發(fā)明的化合物。
方案I–環(huán)烷基酸的制備。
a)X＝Br，I；Pd(PPh3)4，CO，MeOH；b)LiAlH4；c)SOCl2；d)NaCN；e)ClCH2CH2Br，NaOH，ΔT；f)ClCH2CH2Br，NaOH；g)NaOH，ΔT。
方案II–Amid偶聯(lián)。
a)SOCl2，DMF；b)Ar1NRNH，Et3N，CH2Cl2；或
a)HATU，DMF，Et3N，X-Ar1NRNH(X＝鹵化物)。
方案III–雜芳基鹵的衍生化
a)Rw-W-B(OR’)2(R’＝H，Me)，Pd(0)，堿，DMF，H2O；b)Rw-CH2ZnX，(dppf)2PdCl2，CH2Cl2，THF(X＝Cl，Br)；c)(dppf)2PdCl2，Xantphos，KtOBu，二氧雜環(huán)己烷，Et3N，Rw-NH2。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員輕易地理解，適合于本發(fā)明各種取代基的合成途徑適合于上述反應(yīng)條件和步驟。
應(yīng)用、制劑和給藥
藥學(xué)上可接受的組合物
如前文所討論，本發(fā)明提供可用作ABC轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)控劑并因此可用于治療疾病、障礙或病況的化合物，比如囊性纖維化、遺傳性肺氣腫、遺傳性血色素沉著、凝血-纖維蛋白溶解缺陷例如C蛋白缺陷、1型遺傳性血管水腫、脂質(zhì)加工缺陷例如家族性高膽固醇血癥、1型乳糜微粒血癥、無β脂蛋白血癥、溶酶體貯積病例如I-細(xì)胞疾病/假性Hurler、粘多糖病、Sandhof/Tay-Sachs、Crigler-Najjar II型、多內(nèi)分泌腺病/高胰島素血、糖尿病、拉倫侏儒、髓過氧化物酶缺陷、原發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能減退、黑素瘤、聚糖病CDG 1型、遺傳性肺氣腫、先天性甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、成骨不全、遺傳性低纖維蛋白原血、ACT缺陷、尿崩癥(DI)、神經(jīng)生長性DI、腎原性DI、夏-馬-圖三氏綜合征、佩-梅二氏病、神經(jīng)變性疾病例如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、進(jìn)行性核上性麻痹、皮克氏病、若干聚谷氨酰胺神經(jīng)病學(xué)障礙例如亨廷頓氏病、I型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、脊髓與延髓肌肉萎縮、齒狀核紅核蒼白球丘腦下核萎縮和肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良以及海綿狀腦病例如遺傳性克-雅二氏病(由于朊病毒蛋白質(zhì)處理缺陷)、法布里氏病、斯-施二氏綜合征、COPD、干眼病和斯耶格倫氏病。
因此，在本發(fā)明的另一方面，提供藥學(xué)上可接受的組合物，其中這些組合物包含如本文所述的任意化合物，并且任選地包含藥學(xué)上可接受的載體、助劑或賦形劑。在某些實施方案中，這些組合物任選地進(jìn)一步包含一種或多種附加治療劑。
也將被領(lǐng)會到，某些本發(fā)明化合物能夠以游離形式存在，用于治療，或者需要時，以其藥學(xué)上可接受的衍生物形式存在。按照本發(fā)明，藥學(xué)上可接受的衍生物包括但不限于藥學(xué)上可接受的鹽、酯、這類酯的鹽、或者任意其它加合物或衍生物，其一旦對需要的患者給藥即能夠直接或間接提供如本文所述的化合物或者其代謝產(chǎn)物或殘余物。
本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”表示這樣的鹽，在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，它們適合用于與人體和低等動物組織接觸，沒有過度的毒性、刺激性、變態(tài)反應(yīng)等，與合理的利益/風(fēng)險比相稱。“藥學(xué)上可接受的鹽”表示任意無毒性的本發(fā)明化合物的鹽或本發(fā)明化合物的酯的鹽，其一旦對接受者給藥，即能夠直接或間接提供本發(fā)明化合物或者其抑制活性的代謝產(chǎn)物或殘余物。如本文所用，術(shù)語“其抑制活性的代謝產(chǎn)物或殘余物”表示其代謝產(chǎn)物或殘余物也是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白的抑制劑。
藥學(xué)上可接受的鹽是本領(lǐng)域熟知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences，1977，66，1-19中詳細(xì)描述了藥學(xué)上可接受的鹽，通過引用將其并入本說明書。本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的鹽包括從適合的無機(jī)與有機(jī)酸與堿衍生的鹽。藥學(xué)上可接受的無毒性酸加成鹽的實例是與無機(jī)酸或有機(jī)酸生成的氨基的鹽，所述無機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，所述有機(jī)酸例如乙酸、草酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸，或者利用本領(lǐng)域所用的其它方法，例如離子交換形成的鹽。其它藥學(xué)上可接受的鹽包括己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、撲酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對-甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽等。從適當(dāng)?shù)膲A衍生的鹽包括堿金屬、堿土金屬、銨和N+(C1-4烷基)4鹽。本發(fā)明也涵蓋如本文所公開的化合物的任意堿性含氮基團(tuán)的季銨化作用。借助這類季銨化作用可以得到可溶于水或油或可分散在水或油中的產(chǎn)物。代表性堿金屬或堿土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂等。在適當(dāng)時，其它藥學(xué)上可接受的鹽包括無毒的銨鹽、季銨鹽和胺陽離子鹽，其利用抗衡離子生成，例如鹵化物、氫氧化物、羧酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、低級烷基磺酸鹽和芳基磺酸鹽。
如上所述，本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的組合物另外包含藥學(xué)上可接受的載體、助劑或賦形劑，正如本發(fā)明中所述，它們包括適合于所需的特定劑型的任意和所有溶劑、稀釋劑或其它液體介質(zhì)、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑等。Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980)公開了用于配制藥學(xué)上可接受的組合物的各種載體和用于其制備的已知技術(shù)。除了任何常規(guī)載體介質(zhì)與本發(fā)明化合物不相容以外，例如產(chǎn)生任何不需要的生物學(xué)效應(yīng)或者以有害方式其它相互作用于藥學(xué)上可接受的組合物的任何其它組分，它的使用涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。能夠充當(dāng)藥學(xué)上可接受的載體的材料的一些實例包括但不限于離子交換劑；氧化鋁；硬脂酸鋁；卵磷脂；血清蛋白質(zhì)，例如人血清白蛋白；緩沖物質(zhì)，例如磷酸鹽；甘氨酸；山梨酸或山梨酸鉀；飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物；水；鹽或電解質(zhì)，例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽；膠體二氧化硅；三硅酸鎂；聚乙烯吡咯烷酮；聚丙烯酸酯；蠟類；聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物；羊毛脂；糖類，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；粉碎的黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，例如可可脂和栓劑用蠟；油類，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇或聚乙二醇；酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；藻酸；無熱原的水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇；磷酸鹽緩沖溶液；以及其它無毒的可相容的潤滑劑，例如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂；根據(jù)制劑人員的判斷，在組合物中也可以存在著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調(diào)味劑和香料、防腐劑和抗氧化劑。
化合物和藥學(xué)上可接受的組合物的用途
在另一方面，本發(fā)明提供治療牽涉ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性的病況、疾病或障礙的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明提供治療牽涉ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性缺陷的病況、疾病或障礙的方法，該方法包括對有此需要的受治療者，優(yōu)選哺乳動物給予包含式(I)化合物的組合物。
在某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供治療如下疾病的方法：囊性纖維化、遺傳性肺氣腫(由a1-抗胰蛋白酶非Piz變體引起)、遺傳性血色素沉著、凝血-纖維蛋白溶解缺陷例如C蛋白缺陷、1型遺傳性血管水腫、脂質(zhì)加工缺陷例如家族性高膽固醇血癥、1型乳糜微粒血癥、無β脂蛋白血癥、溶酶體貯積病例如I-細(xì)胞疾病/假性Hurler、粘多糖病(由溶酶體加工酶引起)、Sandhof/Tay-Sachs(由β-己糖胺酶引起)、Crigler-Najjar II型(由UDP-葡糖醛基-sialyc-轉(zhuǎn)移酶引起)、多內(nèi)分泌腺病/高胰島素血、糖尿病(由胰島素受體引起)、拉倫侏儒癥(由生長激素受體引起)、髓過氧化物酶缺陷、原發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能減退(由前促甲狀旁腺激素引起)、黑素瘤(由酪氨酸酶引起)。與后一類ER故障有關(guān)的疾病有聚糖病CDG 1型、遺傳性肺氣腫(由α1-抗胰蛋白酶PiZ變體引起)、先天性甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、成骨不全(由I、II、IV型前膠原引起)、遺傳性低纖維蛋白原血(由纖維蛋白原引起)、ACT缺陷(由α1-抗凝乳蛋白酶引起)、尿崩癥(DI)、神經(jīng)生長性DI(由加壓素/V2-受體引起)、腎原性DI(由水通道蛋白II引起)、夏-馬-圖三氏綜合征(由外周髓磷脂蛋白22引起)、佩-梅二氏病、神經(jīng)變性疾病例如阿爾茨海默氏病(由βAPP和早老蛋白引起)、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、進(jìn)行性核上性麻痹、皮克氏病、若干聚谷氨酰胺神經(jīng)病學(xué)障礙例如亨廷頓氏病、I型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、脊髓與延髓肌肉萎縮、齒狀核蒼白球丘腦下核萎縮和肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良以及海綿狀腦病例如遺傳性克-雅二氏病(由朊病毒蛋白加工缺陷引起)、法布里氏病(由溶酶體α-半乳糖苷酶A引起)、斯-施二氏綜合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、干眼病和斯耶格倫氏綜合征，該方法包括對所述哺乳動物給予有效量的包含式(I)化合物的組合物的步驟，或如前文所述的其優(yōu)選實施方案。
按照可替代的優(yōu)選實施方案，本發(fā)明提供治療囊性纖維化的方法，其包括對所述哺乳動物給予有效量的包含式(I)化合物的組合物的步驟，或如前文所述的其優(yōu)選實施方案。
按照本發(fā)明，化合物或藥學(xué)上可接受的組合物的“有效量”是有效治療如下疾病中的一種或多種或者減輕其嚴(yán)重性的量：囊性纖維化、遺傳性肺氣腫(由a1-抗胰蛋白酶非Piz變體引起)、遺傳性血色素沉著、凝血-纖維蛋白溶解缺陷例如C蛋白缺陷、1型遺傳性血管水腫、脂質(zhì)加工缺陷例如家族性高膽固醇血癥、1型乳糜微粒血癥、無β脂蛋白血癥、溶酶體貯積病例如I-細(xì)胞疾病/假性Hurler、粘多糖病(由溶酶體加工酶引起)、Sandhof/Tay-Sachs(由β-己糖胺酶引起)、Crigler-Najjar II型(由UDP-葡糖醛基-sialyc-轉(zhuǎn)移酶引起)、多內(nèi)分泌腺病/高胰島素血、糖尿病(由胰島素受體引起)、拉倫侏儒癥(由生長激素受體引起)、髓過氧化物酶缺陷、原發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能減退(由前促甲狀旁腺激素引起)、黑素瘤(由酪氨酸酶引起)。與后一類ER故障有關(guān)的疾病有聚糖病CDG 1型、遺傳性肺氣腫(由α1-抗胰蛋白酶PiZ變體引起)、先天性甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、成骨不全(由I、II、IV型前膠原引起)、遺傳性低纖維蛋白原血(由纖維蛋白原引起)、ACT缺陷(由α1-抗凝乳蛋白酶引起)、尿崩癥(DI)、神經(jīng)生長性DI(由加壓素/V2-受體引起)、腎原性DI(由水通道蛋白II引起)、夏-馬-圖三氏綜合征(由外周髓磷脂蛋白22引起)、佩-梅二氏病、神經(jīng)變性疾病例如阿爾茨海默氏病(由βAPP和早老蛋白引起)、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、進(jìn)行性核上性麻痹、皮克氏病、若干聚谷氨酰胺神經(jīng)病學(xué)障礙例如亨廷頓氏病、I型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、脊髓與延髓肌肉萎縮、齒狀核蒼白球丘腦下核萎縮和肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良以及海綿狀腦病例如遺傳性克-雅二氏病(由朊病毒蛋白加工缺陷引起)、法布里氏病(由溶酶體α-半乳糖苷酶A引起)、斯-施二氏綜合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、干眼病和斯耶格倫氏綜合征。
根據(jù)本發(fā)明方法的化合物和組合物可以利用有效用于治療如下疾病或者減輕其嚴(yán)重性的任意量和任意給藥途徑進(jìn)行給藥：囊性纖維化、遺傳性肺氣腫(由a1-抗胰蛋白酶非Piz變體引起)、遺傳性血色素沉著、凝血-纖維蛋白溶解缺陷例如C蛋白缺陷、1型遺傳性血管水腫、脂質(zhì)加工缺陷例如家族性高膽固醇血癥、1型乳糜微粒血癥、無β脂蛋白血癥、溶酶體貯積病例如I-細(xì)胞疾病/假性Hurler、粘多糖病(由溶酶體加工酶引起)、Sandhof/Tay-Sachs(由β-己糖胺酶引起)、Crigler-Najjar II型(由UDP-葡糖醛基-sialyc-轉(zhuǎn)移酶引起)、多內(nèi)分泌腺病/高胰島素血、糖尿病(由胰島素受體引起)、拉倫侏儒癥(由生長激素受體引起)、髓過氧化物酶缺陷、原發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能減退(由前促甲狀旁腺激素引起)、黑素瘤(由酪氨酸酶引起)。與后一類ER故障有關(guān)的疾病有聚糖病CDG 1型、遺傳性肺氣腫(由α1-抗胰蛋白酶PiZ變體引起)、先天性甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、成骨不全(由I、II、IV型前膠原引起)、遺傳性低纖維蛋白原血(由纖維蛋白原引起)、ACT缺陷(由α1-抗凝乳蛋白酶引起)、尿崩癥(DI)、神經(jīng)生長性DI(由加壓素/V2-受體引起)、腎原性DI(由水通道蛋白II引起)、夏-馬-圖三氏綜合征(由外周髓磷脂蛋白22引起)、佩-梅二氏病、神經(jīng)變性疾病例如阿爾茨海默氏病(由βAPP和早老蛋白引起)、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、進(jìn)行性核上性麻痹、皮克氏病、若干聚谷氨酰胺神經(jīng)病學(xué)障礙例如亨廷頓氏病、I型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、脊髓與延髓肌肉萎縮、齒狀核蒼白球丘腦下核萎縮和肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良以及海綿狀腦病例如遺傳性克-雅二氏病(由朊病毒蛋白加工缺陷引起)、法布里氏病(由溶酶體α-半乳糖苷酶A引起)、斯-施二氏綜合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、干眼病和斯耶格倫氏綜合征。
所需確切的量將因受治療者而異，取決于受治療者的種類、年齡與一般狀態(tài)、感染的嚴(yán)重性、特定藥物、其給藥的方式等。本發(fā)明化合物優(yōu)選地被配制成劑量單元形式，有易于給藥和劑量的一致性。本文所用的表達(dá)方式“劑量單元形式”表示物理上離散的藥物單元，對所治療的患者而言是適當(dāng)?shù)摹２贿^將被理解到，本發(fā)明化合物和組合物的總每日用量將由主治醫(yī)師在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)決定。任意特定患者或生物體的具體有效劑量水平將依賴于多種因素，包括所治療的病況和病況的嚴(yán)重性；所采用的具體化合物的活性；所采用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；給藥的時間、給藥的途徑和所采用的具體化合物的排泄速率；治療的持續(xù)時間；與所采用的具體化合物聯(lián)合或同時使用的藥物；以及醫(yī)藥領(lǐng)域熟知的其它因素。本文所用的術(shù)語“患者”表示動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人。
本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的組合物可以對人和其它動物口服、直腸、腸胃外、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(以粉劑、軟膏劑或滴劑)、口腔、以口用或鼻用噴霧劑等方式給藥，這依賴于所治療感染的嚴(yán)重性。在某些實施方案中，本發(fā)明化合物可以口服或腸胃外給藥，劑量水平為每天約0.01mg/kg至約50mg/kg，優(yōu)選約1mg/kg至約25mg/kg受治療者體重，一天一次或多次，以獲得所需的治療效果。
口服給藥的液體劑型包括但不限于藥學(xué)上可接受的乳劑、微乳劑、溶液、懸液、糖漿劑和酏劑。除了活性化合物以外，液體劑型可以含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，例如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐基酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特別是棉籽油、花生油、玉米油、麥胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨醇的脂肪酸酯，和它們的混合物。除了惰性稀釋劑以外，口服組合物也可以包括助劑，例如濕潤劑、乳化與懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料。
使用適合的分散或濕潤劑和懸浮劑，可以按照已知技術(shù)配制可注射制備物，例如無菌可注射的水性或油性懸液。無菌可注射制備物也可以是在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液、懸液或乳液，例如在1,3-丁二醇中的溶液?？梢圆捎玫目山邮艿妮d體和溶劑有水、林格氏溶液(U.S.P.)和等滲氯化鈉溶液。另外，常規(guī)采用無菌的固定油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以采用任何溫和的固定油，包括合成的單-或二-甘油酯。另外，在注射劑的制備中也可以使用脂肪酸，例如油酸。
可注射制劑可以這樣進(jìn)行滅菌，例如通過細(xì)菌截留性濾器過濾，或者摻入無菌固體組合物形式的滅菌劑，可以在使用前將其溶解或分散在無菌的水或其它無菌可注射介質(zhì)中。
為了延長本發(fā)明化合物的作用，經(jīng)常需要延緩化合物在皮下或肌內(nèi)注射后的吸收。這可以利用水溶性差的結(jié)晶性或無定形物質(zhì)的液體懸液來實現(xiàn)。化合物的吸收速率取決于它的溶解速率，而后者又可能取決于晶體大小和晶型。作為替代選擇，將化合物溶解或懸浮在油類載體中，實現(xiàn)腸胃外給藥化合物形式的延遲吸收?？勺⑸涞膬煨问绞沁@樣制備的，在生物可降解的聚合物中，例如聚交酯-聚乙醇酸交酯，生成化合物的微囊包封基質(zhì)。根據(jù)化合物與聚合物的比例和所采用特定聚合物的屬性，可以控制化合物的釋放速率。其它生物可降解聚合物的實例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。儲庫型可注射制劑也可以將化合物包埋在與機(jī)體組織相容的脂質(zhì)體或微乳中來制備。
用于直腸或陰道給藥的組合物優(yōu)選地是栓劑，它們可以這樣制備，將本發(fā)明化合物與適合的無刺激性賦形劑或載體混合，例如可可脂、聚乙二醇或栓劑用蠟，它們在環(huán)境溫度下是固體，但是在體溫下是液體，因此在直腸或陰道腔中融化，釋放出活性化合物。
用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。在這類固體劑型中，將活性化合物與至少一種惰性的藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體混合，例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，和/或a)填充劑或增容劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，b)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠，c)潤濕劑，例如甘油，d)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉，e)溶解遲延劑，例如石蠟，f)吸收促進(jìn)劑，例如季銨化合物，g)濕潤劑，例如鯨蠟醇和甘油單硬脂酸酯，h)吸收劑，例如高嶺土和膨潤土，和i)潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，所述劑型也可以包含緩沖劑。
也可以采用相似類型的固體組合物作為軟或硬的填充的明膠膠囊劑中的填充劑，膠囊所用賦形劑例如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等。片劑、錠劑、膠囊劑、丸劑和顆粒劑等固體劑型可以帶有包衣和外殼，例如腸溶衣和藥物配制領(lǐng)域熟知的其它包衣。它們可以任選地含有遮光劑，也可以是僅僅或優(yōu)先在腸道某一部分釋放活性成分的組合物，任選地為延遲的方式?？梢允褂玫陌窠M合物的實例包括聚合物質(zhì)和蠟類。也可以采用相似類型的固體組合物作為軟或硬的填充的明膠膠囊劑中的填充劑，膠囊所用賦形劑例如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等。
活性化合物也可以是微囊包封的形式，其中含有一種或多種上述賦形劑。片劑、錠劑、膠囊劑、丸劑和顆粒劑等固體劑型可以帶有包衣和外殼，例如腸溶衣、釋放控制性包衣和藥物配制領(lǐng)域熟知的其它包衣。在這類固體劑型中，可以將活性化合物與至少一種惰性稀釋劑混合，例如蔗糖、乳糖或淀粉。在正常情況下，這類劑型也可以包含除惰性稀釋劑以外的其它物質(zhì)，例如壓片潤滑劑和其它壓片助劑，例如硬脂酸鎂和微晶纖維素。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，劑型也可以包含緩沖劑。它們可以任選地含有遮光劑，也可以是僅僅或優(yōu)先在腸道某一部分釋放活性成分的組合物，任選地為延遲的方式?？梢允褂玫陌窠M合物的實例包括聚合物質(zhì)和蠟類。
用于局部或透皮給予本發(fā)明化合物的劑型包括軟膏劑、糊劑、霜劑、洗劑、凝膠劑、粉劑、溶液、噴霧劑、吸入劑或貼劑。將活性組分在無菌條件下與藥學(xué)上可接受的載體和任何必需的防腐劑或緩沖劑混合，根據(jù)需要而定。眼科制劑、滴耳劑和滴眼劑也被涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明涵蓋透皮貼劑的使用，它們具有控制化合物向機(jī)體遞送的附加優(yōu)點。這類劑型可以通過將化合物溶解或分散在恰當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中來制備。也可以使用吸收增強(qiáng)劑以增加化合物穿過皮膚的通量。可以通過提供速率控制膜或者將化合物分散在聚合物基質(zhì)或凝膠中來控制速率。
正如上文一般性描述的，本發(fā)明化合物可用作ABC轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)控劑。因而，不希望受任意特定理論所限，化合物和組合物特別可用于治療疾病、病況或障礙或者減輕其嚴(yán)重性，其中ABC轉(zhuǎn)運蛋白的活性過高或無活性在該疾病、病況或障礙中有牽連。當(dāng)在特定的疾病、病況或障礙中涉及ABC轉(zhuǎn)運蛋白的活性過高或無活性時，該疾病、病況或障礙也可以被稱為“ABC轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的疾病、病況或障礙”。因此，在另一方面，本發(fā)明提供治療疾病、病況或障礙或者減輕其嚴(yán)重性的方法，其中在該疾病狀態(tài)中涉及ABC轉(zhuǎn)運蛋白的活性過高或無活性。
在本發(fā)明中用作ABC轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)控劑的化合物的活性可以按照本領(lǐng)域中和本文實施例中一般描述的方法來測定。
也將被領(lǐng)會到，本發(fā)明的化合物和藥學(xué)上可接受的組合物可以用在聯(lián)合療法中，也就是說，化合物和藥學(xué)上可接受的組合物可以在一種或多種其它所需治療劑或醫(yī)藥程序同時、之前或隨后給藥。用在聯(lián)合方案中的特定療法組合(治療劑或程序)將考慮所需治療劑和/或程序與所要達(dá)到的所需治療效果的可相容性。也將被領(lǐng)會的是，所用療法可以對同一病況達(dá)到所需效果(例如，本發(fā)明化合物可以與另一種用于治療同一病況的藥物同時給藥)，或者它們可以達(dá)到不同的效果(例如控制任何副作用)。正如本文所用的，在正常情況下給藥以治療或預(yù)防特定疾病或病況的附加治療劑被稱為“就所治療的疾病或病況而言是適當(dāng)?shù)摹薄?/p>
附加治療劑在本發(fā)明組合物中的含量將不超過在包含該治療劑作為唯一活性成分的組合物中通常的給藥量。優(yōu)選地，附加治療劑在目前所公開的組合物中的量將是通常的包含該藥物作為唯一治療活性成分的組合物中的含量的約50％至100％。
本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的組合物也可以引入到用于涂覆可植入醫(yī)療器械(例如假肢、人工瓣膜、脈管移植物、支架和導(dǎo)管)的組合物中。因此，在另一方面，本發(fā)明包括用于涂覆可植入器械的組合物，其包含如上一般性描述和在本文類型與小類中所述的本發(fā)明化合物，以及適合于涂覆所述可植入器械的載體。在另一方面，本發(fā)明包括涂有組合物的可植入器械，所述組合物包含如上一般性描述和在本文類型與小類中所述的本發(fā)明化合物，以及適合于涂覆所述可植入器械的載體。適合的涂料和被涂覆可植入的器械的一般制備方法描述在美國專利6,099,562、5,886,026和5,304,121中。涂料通常是生物可相容的聚合材料，例如水凝膠聚合物、聚甲基二硅氧烷、聚己內(nèi)酯、聚乙二醇、聚乳酸、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物和它們的混合物。涂料可以任選地進(jìn)一步被適合的氟硅酮、多糖、聚乙二醇、磷脂或其組合的表層所覆蓋，以賦予組合物的控釋特征。
本發(fā)明的另一個方面涉及調(diào)控生物樣品或患者中(例如，體外或體內(nèi))的ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性，該方法包括向患者給藥或使所述生物樣品接觸式I化合物或包含所述化合物的組合物。本文所用的術(shù)語“生物樣品”非限制性地包括細(xì)胞培養(yǎng)物及其提取物；從哺乳動物或其提取物獲得的活組織檢查材料；以及血液、唾液、尿、糞便、精液、淚液或其它流體或者其提取物。
生物樣品中ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性的調(diào)控可用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種目的。上述目的的實例包括，但不限于，在生物和病理現(xiàn)象中研究ABC轉(zhuǎn)運蛋白；以及新ABC轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)控劑的對比評價。
在又一個實施方案中，提供在體外或體內(nèi)調(diào)控陰離子通道活性的方法，其包括將所述通道與式(I)化合物接觸的步驟。在優(yōu)選實施方案中，該陰離子通道是氯化物通道或碳酸氫根通道。在其它優(yōu)選實施方案中，該陰離子通道是氯化物通道。
按照可替代的實施方案，本發(fā)明提供增加細(xì)胞膜中的功能性ABC轉(zhuǎn)運蛋白的數(shù)量的方法，其包括將所述細(xì)胞與式(I)化合物接觸的步驟。本文所用術(shù)語“功能性ABC轉(zhuǎn)運蛋白”表示具有轉(zhuǎn)運活性的ABC轉(zhuǎn)運蛋白。在優(yōu)選實施方案中，所述功能性ABC轉(zhuǎn)運蛋白是CFTR。
按照另一個優(yōu)選實施方案，通過測量跨膜電壓電位來測量ABC轉(zhuǎn)運蛋白的活性。在生物樣品中測量跨膜電壓電位的手段可以借助本領(lǐng)域中的任意已知方法，比如光學(xué)膜電位測定法或其它電生理學(xué)方法。
光學(xué)膜電位測定法采用如Gonzalez和Tsien所述的電壓-敏感性FRET傳感器(參見，Gonzalez，J.E.和R.Y.Tsien(1995)"Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer in single cells"Biophys J 69(4):1272-80，以及Gonzalez，J.E.和R.Y.Tsien(1997)"Improved indicators of cell membrane potential that use fluorescence resonance energy transfer"Chem Biol 4(4):269-77)與測量熒光變化的儀器的組合，例如電壓/離子探針讀數(shù)器(VIPR)(參見，Gonzalez，J.E.，K.Oades，等人(1999)"Cell-based assays and instrumentation for screening ion-channel targets"Drug DiscovToday 4(9):431-439)。
這些電壓敏感性測定法基于膜溶性、電壓敏感性染劑DiSBAC2(3)與熒光磷脂CC2-DMPE之間熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的變化，所述熒光磷脂連接于質(zhì)膜的外部小葉，充當(dāng)FRET供體。膜電位(Vm)的變化導(dǎo)致帶負(fù)電的DiSBAC2(3)穿過質(zhì)膜重新分布，從CC2-DMPE轉(zhuǎn)移的能量相應(yīng)地改變。熒光發(fā)射的變化可以利用VIPRTM II監(jiān)測，它是一種集成的液體處理器和熒光檢測器，被設(shè)計用來在96-或384-孔微量滴定平板中進(jìn)行細(xì)胞類篩選。
在另一方面，本發(fā)明提供用于在體外或體內(nèi)測量生物樣品中ABC轉(zhuǎn)運蛋白或其片段活性的試劑盒，其包含(i)包含式(I)化合物的組合物或者任意上述實施方案；以及(ii)關(guān)于如下內(nèi)容的說明書：a)將該組合物與生物樣品接觸和b)測量所述ABC轉(zhuǎn)運蛋白或其片段的活性。在一個實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含關(guān)于如下內(nèi)容的說明書：a)將附加組合物與生物樣品接觸；b)在所述附加化合物存在下測量ABC轉(zhuǎn)運蛋白或其片段的活性，以及c)比較附加化合物存在下的ABC轉(zhuǎn)運蛋白的活性與式(I)組合物存在下的ABC轉(zhuǎn)運蛋白的密度。在優(yōu)選實施方案中，所述試劑盒用于測量CFTR的密度。
具體實施方式
為了可以更加充分地理解本文所述的發(fā)明，描述下列實施例。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅供闡述目的，不被解釋為以任何方式限制本發(fā)明。
實施例
1-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基-環(huán)丙烷甲酸的制備
在70℃，加熱2-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯)乙腈(5.10g 31.7mmol)、1-溴-2-氯-乙烷(9.00mL 109mmol)和氯化芐基三乙銨(0.181g，0.795mmol)的混合物，然后向混合物中緩慢添加50％(wt./wt.)氫氧化鈉水溶液(26mL)。在70℃，將反應(yīng)攪拌24小時，然后在130℃加熱48小時。將深棕色的反應(yīng)混合物用水(400mL)稀釋，用等體積的乙酸乙酯萃取一次并用等體積的二氯甲烷萃取一次。用濃鹽酸酸化堿性水溶液至pH小于1，過濾沉淀物并用1M鹽酸洗滌。將固體物質(zhì)溶于二氯甲烷(400mL)，用等體積的1M鹽酸萃取兩次并用飽和的氯化鈉水溶液萃取一次。將有機(jī)溶液用硫酸鈉干燥并蒸發(fā)至干，得到白色至淡灰白色固體(5.23g，80％)ESI-MS m/z計算值為206.1，實測值為207.1(M+1)+。保留時間2.37分鐘。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.07-1.11(m，2H)，1.38-1.42(m，2H)，5.98(s，2H)，6.79(m，2H)，6.88(m，1H)，12.26(s，1H)。
1-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙烷甲酸的制備
步驟a：2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-甲酸甲酯
在一氧化碳?xì)夥?55PSI)下，在75℃(油浴溫度)，將5-溴-2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯(11.8g，50.0mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)[Pd(PPh3)4，5.78g，5.00mmol]在含有乙腈(30mL)和三乙胺(10mL)的甲醇(20mL)中的溶液攪拌15小時。將冷卻的反應(yīng)混合物過濾并將濾液蒸發(fā)至干。通過硅膠柱色譜法純化殘余物，得到粗制的2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-甲酸甲酯(11.5g)，將其直接用于下一步驟中。
步驟b：(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-甲醇
在0℃，將溶于20mL無水四氫呋喃(THF)中的粗制2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-甲酸甲酯(11.5g)緩慢添加至氫化鋁鋰(4.10g，106mmol)在無水THF(100mL)中的懸浮液中。然后，將混合物溫?zé)嶂潦覝?。在室溫攪?小時后，將反應(yīng)混合物冷卻至0℃并用水(4.1g)處理，接著用氫氧化鈉(10％水溶液，4.1mL)處理。將得到的於漿過濾并用THF洗滌。將合并的濾液蒸發(fā)至干并通過硅膠柱色譜法純化殘余物，得到(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯)-甲醇(7.2g，38mmol，76％，兩步)，為無色的油。
步驟c：5-氯甲基-2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯
在0℃，將亞硫酰氯(45g，38mmol)緩慢添加至(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-甲醇(7.2g，38mmol)在二氯甲烷(200mL)中的溶液中。在室溫，將得到的混合物攪拌過夜，然后蒸發(fā)至干。將殘余物分配在飽和的碳酸氫鈉水溶液(100mL)和二氯甲烷(100mL)之間。用二氯甲烷(150mL)萃取分離的水層并將有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)至干，得到粗制的5-氯甲基-2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯(4.4g)，在不進(jìn)一步純化的情況下，將其直接用于下一步驟中。
步驟d：(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-乙腈
在室溫，將粗制的5-氯甲基-2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯(4.4g)和氰化鈉(1.36g，27.8mmol)在二甲亞砜(50mL)中的混合物攪拌過夜。將反應(yīng)混合物倒入冰中并用乙酸乙酯(300mL)萃取。將有機(jī)層用硫酸鈉干燥并蒸發(fā)至干，得到粗制的(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-乙腈(3.3g)，將其直接用于下一步驟中。
步驟e：1-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙腈
在70℃，將氫氧化鈉(50％水溶液，10mL)緩慢添加至粗制的(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-乙腈、氯化芐基三乙銨(3.00g，15.3mmol)和1-溴-2-氯乙烷(4.9g，38mmol)的混合物中。在70℃，將混合物攪拌過夜，然后將反應(yīng)混合物用水(30mL)稀釋并用乙酸乙酯萃取。將合并的有機(jī)層用硫酸鈉干燥并蒸發(fā)至干，得到粗制的1-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙腈，將其直接用于下一步驟中。
步驟f：1-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙烷甲酸
將1-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙腈(來自上一步驟的粗制品)在10％氫氧化鈉水溶液(50mL)中回流2.5小時。用乙醚(100mL)洗滌冷卻的反應(yīng)混合物并用2M鹽酸將水相酸化至pH 2。將沉淀出的固體過濾，得到1-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙烷甲酸，為白色固體(0.15g，1.6％，四步)。ESI-MS m/z計算值為242.04，實測值為241.58(M+1)+；1H NMR(CDCl3)δ7.14-7.04(m，2H)，6.98-6.96(m，1H)，1.74-1.64(m，2H)，1.26-1.08(m，2H)。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
在氮氣下，將1-苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基-環(huán)丙烷甲酸(2.76g，13.4mmol)置于烘箱干燥的燒瓶中。添加亞硫酰氯(3.0mL)和N,N-二甲基甲酰胺(0.3mL)并在室溫讓溶液攪拌10分鐘。在真空下除去過量的亞硫酰氯并將得到的固體懸浮在10mL無水二氯甲烷中。然后將該溶液緩慢地添加到5-溴-6-甲基吡啶-3-胺(2.50g，13.4mmol)在10mL含有三乙胺(5.64mL，40.2mmol)的無水二氯甲烷中的溶液中。在室溫，讓得到的混合物攪拌10分鐘。然后將粗制的產(chǎn)物用飽和的碳酸氫鈉水溶液洗滌三次，接著用飽和的氯化鈉水溶液洗滌兩次。將有機(jī)層用硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，并在沒有進(jìn)一步純化的情況下使用得到的黃色粉末(3.62g，9.65mmol，72.0％)。ESI-MS m/z計算值為374.0，實測值；375.1(M+1)+保留時間2.30分鐘。1H NMR(400MHz，CD3CN)δ8.38(d，J＝2.2Hz，1H)，8.14(d，J＝2.2Hz，1H)，7.80-7.60(m，1H)，7.08-6.95(s，2H)，6.89(dd，J＝1.2，7.3Hz，1H)，6.01(s，2H)，2.54(s，3H)，1.59-1.50(m，2H)，1.19-1.09(m，2H)。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
將1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺(38mg，0.10mmol)溶于1mL含有0.2mL 2M碳酸鉀水溶液和12mg Fibre-Cat 1007的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。然后將反應(yīng)混合物加熱至80℃持續(xù)16小時。將得到的物質(zhì)冷卻至室溫，過濾，并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物。ESI-MS m/z計算值為372.2，實測值為373.2(M+1)+。保留時間1.80分鐘。
4-(5-(1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-2-甲基吡啶-3-基)苯甲酰胺的制備
以與制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺類似的方式，由4-氨基甲?；交鹚岷?-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備4-(5-(1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-2-甲基吡啶-3-基)苯甲酰胺。
4-(5-(1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-2-甲基吡啶-3-基)-N-甲基苯甲酰胺的制備
以與制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺類似的方式，由4-(甲基氨基甲酰基)苯基硼酸和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備4-(5-(1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-2-甲基吡啶-3-基)-N-甲基苯甲酰胺。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-(3-(羥甲基)苯基)-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
以與制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺類似的方式，由3-(羥甲基)苯基硼酸和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-(3-(羥甲基)苯基)-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-(4-(N-甲基氨磺?；?苯基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
以與制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺類似的方式，由4-(N-甲基氨磺?；?苯基硼酸和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-(4-(N-甲基氨磺?；?苯基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-(3-(N,N-二甲基氨磺?；?苯基)-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
以與制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺類似的方式，由3-(N,N-二甲基氨磺?；?苯基硼酸和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-(3-(N,N-二甲基氨磺酰基)苯基)-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-(4-(N,N-二甲基氨磺?；?苯基)-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
以與制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺類似的方式，由4-(N,N-二甲基氨磺酰基)苯基硼酸和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-(4-(N,N-二甲基氨磺?；?苯基)-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺。
3-(5-(1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-2-甲基吡啶-3-基)苯甲酰胺的制備
以與制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺類似的方式，由3-氨基甲酰基苯基硼酸和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備3-(5-(1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-2-甲基吡啶-3-基)苯甲酰胺。
3-(5-(1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-2-甲基吡啶-3-基)苯甲酸的制備
以與制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺類似的方式，由3-二羥硼基苯甲酸和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備3-(5-(1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-2-甲基吡啶-3-基)苯甲酸。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-(4-(羥甲基)苯基)-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
以與制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺類似的方式，由4-(羥甲基)苯基硼酸和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-(4-(羥甲基)苯基)-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-(3-氨磺?；交?吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
以與制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺類似的方式，由3-氨磺酰基苯基硼酸和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴-6-甲基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-甲基-5-(3-氨磺酰基苯基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-異丙基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
將1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酸(20.6mg，0.100mmol)和6-異丙基吡啶-3-胺(13.6g，0.100mmol)溶于含有三乙胺(0.042mL，0.300mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF，1mL)中。添加六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲(HATU，39.9mg，0.105mmol)并讓溶液攪拌3小時。然后通過反相制備型液相色譜法，使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度純化混合物，得到純產(chǎn)物。ESI-MS m/z計算值為324.2，實測值為325.3(M+1)+。保留時間2.14分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基芐基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
步驟a：1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-溴吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺
向1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酸(9.50g，46.00mmol)中添加亞硫酰氯(10.00mL，138.00mmol)和DMF(4滴)，攪拌混合物并在60℃加熱30分鐘。在減壓下蒸發(fā)過量的亞硫酰氯。將一部分酰氯(23.20mmol)溶于吡啶(15mL)中并緩慢添加至在吡啶(10mL)中的6-溴吡啶-3-胺(23.20mmol)中。在110℃，將反應(yīng)混合物攪拌1小時30分鐘。在減壓下蒸發(fā)吡啶。將得到的混合物溶于二氯甲烷(200mL)并用1N NaOH(4x50mL)洗滌。將有機(jī)層用無水Na2SO4干燥并在減壓下蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法純化粗制的產(chǎn)物，得到1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-溴吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺(4g，48％)。
步驟b：1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基芐基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺
在室溫，將氯化(2-甲氧基芐基)鋅(II)(4.44mL，0.5M，2.20mmol)在THF和(DPPF)2PdCl2.CH2Cl2(45mg，0.056mmol)中的溶液攪拌20分鐘。向該溶液中添加1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-溴吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺(200mg，0.56mmol)在THF(4mL)中的於漿并在微波反應(yīng)器中將反應(yīng)混合物加熱至150℃持續(xù)10分鐘。將得到的物質(zhì)冷卻至室溫。將Na2EDTA和飽和的NH4Cl水溶液添加至反應(yīng)中并在室溫將混合物攪拌30分鐘。使用二氯甲烷萃取產(chǎn)物。將有機(jī)層用無水Na2SO4干燥并在減壓下蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法純化粗制的產(chǎn)物，得到1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基芐基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺(152mg，68％)。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-氯芐基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
使用1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基芐基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的程序，由氯化(2-氯芐基)鋅(II)和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-溴吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，合成1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-氯芐基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-芐基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
使用1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基芐基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的程序，使用溴化芐基鋅(II)和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-溴吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，合成1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-芐基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-溴吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺(72mg，0.20mmol)、苯基硼酸(16mg，0.13mmol)、K2CO3(19mg，0.14mmol)和(DPPF)2PdCl2.CH2Cl2(6mg，0.007mmol)中添加乙醇(545uL)和水(55uL)。在微波反應(yīng)器中，將反應(yīng)混合物加熱至150℃持續(xù)10分鐘。將得到的物質(zhì)冷卻至室溫。將反應(yīng)混合物用二氯甲烷稀釋，過濾，并濃縮濾液。將粗制的產(chǎn)物溶于DMSO(1mL)，過濾，并通過反相制備型HPLC純化，得到1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，為TFA鹽(8.5mg，0.018mmol，13％)。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基苯基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
使用1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的程序，由2-甲氧基苯基硼酸和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-溴吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，合成1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基苯基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-氯苯基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
使用1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-苯基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的程序，由2-氯苯基硼酸和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-溴吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，合成1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-氯苯基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基苯基氨基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向在二氧雜環(huán)己烷(0.400mL)中的1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-溴吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺(72mg，0.2mmol)中添加XANTPHOS(2.3mg，0.004mmol)、KtBuO(31mg，0.28mmol)、(DPPF)2PdCl2.CH2Cl2(3.00mg，0.004mmol)和2-甲氧基苯胺(30mg，0.24mmol)和Et3N(0.200mL)。在微波反應(yīng)器中，將反應(yīng)混合物加熱至150℃持續(xù)10分鐘。將得到的物質(zhì)冷卻至室溫。通過硅膠柱色譜法純化粗制的產(chǎn)物，得到1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基苯基氨基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，然后將其用含HCl的MeOH處理，形成HCl鹽(2.3mg，0.0053mmol，2.7％)。ESI-MSm/z計算值為403.2，實測值；404.5(M+1)+保留時間2.29分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-芐基吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向溴化芐基鋅(II)在THF(0.8mL，0.4mmol)的0.5M溶液中添加[1,1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(8mg，0.01mmol)并在氮氣下將反應(yīng)攪拌20分鐘。添加1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-氯吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺(32mg，0.1mmol)并在150℃，在微波反應(yīng)器中將反應(yīng)照射10分鐘。用飽和的氯化銨溶液(2mL)和飽和的乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液(2mL)淬滅反應(yīng)。將混合物攪拌30分鐘，然后將其用二氯甲烷(3x4mL)萃取。將有機(jī)物用Na2SO4干燥并蒸發(fā)。將粗制的產(chǎn)物溶于DMSO(1mL)并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物(2.0mg，0.0054mmol，5.4％)。ESI-MS m/z計算值為373.14，實測值為374.1(M+1)+；保留時間3.32分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基芐基)吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
以與關(guān)于1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-芐基吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺所報道的相似程序，由氯化(2-甲氧基芐基)鋅(II)和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-氯吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備了標(biāo)題化合物。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-氯芐基)吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
使用關(guān)于1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-芐基吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺所報道的相似程序，由氯化(2-氯芐基)鋅(II)和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-氯吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備了標(biāo)題化合物。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-(2-氯芐基)吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向氯化(2-氯芐基)鋅(II)在THF(0.8mL，0.4mmol)中的0.5M溶液中添加[1,1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(8mg，0.01mmol)并在氮氣下將反應(yīng)攪拌20分鐘。添加1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺(36mg，0.10mmol)并在150℃，在微波中將反應(yīng)照射10分鐘。用飽和的氯化銨溶液(2mL)和飽和的乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液(2mL)淬滅反應(yīng)。將混合物攪拌30分鐘，然后將其用二氯甲烷(3x4mL)萃取。將有機(jī)物用Na2SO4干燥并蒸發(fā)。將粗制的產(chǎn)物溶于DMSO(1mL)并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物(16mg，0.039mmol，39％)。ESI-MS m/z計算值為407.1，實測值為408.2(M+1)+；保留時間3.82分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-(2-甲氧基芐基)吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
使用關(guān)于1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-(2-氯芐基)吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺所述的相似程序，由氯化(2-甲氧基芐基)鋅(II)和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備了標(biāo)題化合物。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-芐基吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
使用關(guān)于1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-(2-氯芐基)吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺所報道的相似程序，由溴化芐基鋅(II)和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備了標(biāo)題化合物。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-(2-甲氧基苯基氨基)吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-溴吡嗪-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺(72mg，0.2mmol)、2-甲氧基苯胺(30mg，0.24mmol)和叔丁醇鉀(31mg，0.28mmol)在2：1二氧雜環(huán)己烷：Et3N(1.8mL)中的溶液中添加[1,1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(1.6mg，0.0020mmol)和XANTPHOS(1.2mg，0.0020mmol)。將反應(yīng)混合物加熱至80℃持續(xù)18小時。將反應(yīng)混合物過濾并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物(32mg，0.079mmol，39％)。ESI-MS m/z計算值為404.1，實測值為405.3(M+1)+；保留時間3.61分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基芐基)噠嗪-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向氯化(2-甲氧基芐基)鋅(II)在THF(0.8mL，0.4mmol)中的0.5M溶液中添加[1,1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(8mg，0.01mmol)并在氮氣下將反應(yīng)攪拌20分鐘。添加1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-氯噠嗪-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺(32mg，0.1mmol)并在150℃，在微波中將反應(yīng)照射10分鐘。用飽和的氯化銨溶液(2mL)和飽和的乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液(2mL)淬滅反應(yīng)。將混合物攪拌30分鐘，然后將其用二氯甲烷(3x4mL)萃取。將有機(jī)物用Na2SO4干燥并蒸發(fā)。將粗制的產(chǎn)物溶于DMSO(1mL)并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物(21mg，0.052mmol，52％)。ESI-MS m/z計算值為379.2，實測值為380.3(M+1)+；保留時間3.54分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-氯芐基)噠嗪-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
使用關(guān)于1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基芐基)噠嗪-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺所報道的相似程序，由氯化(2-氯芐基)鋅(II)和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-氯噠嗪-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備了標(biāo)題化合物。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(環(huán)己基甲基)噠嗪-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
以與關(guān)于1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基芐基)噠嗪-3-基)環(huán)丙烷-甲酰胺所報道的相似程序，由溴化(環(huán)己基甲基)鋅(II)和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-氯噠嗪-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備了標(biāo)題化合物。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-芐基噠嗪-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
使用關(guān)于1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2-甲氧基芐基)噠嗪-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺所報道的相似程序，由溴化芐基鋅(II)和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-氯噠嗪-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺，制備了標(biāo)題化合物。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(2-芐基吡啶-4-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
步驟a：1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(2-氯吡啶-4-基)環(huán)丙烷-甲酰胺
向含1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酸(1.5g，7.3mmol)的亞硫酰氯(1.6mL，21.8mmol)中添加N,N-二甲基甲酰胺(100μL)。在室溫，將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，然后將其蒸發(fā)至干，得到期望的酰氯。將該酰氯添加到2-氯吡啶-4-胺(0.94g，7.3mmol)在吡啶(10mL)中的溶液中。將反應(yīng)加熱至100℃持續(xù)12小時。將反應(yīng)用二氯甲烷(30mL)稀釋并用1N NaOH(3x20mL)洗滌。將有機(jī)物用Na2SO4干燥并蒸發(fā)至干。通過硅膠色譜法(用含0-50％乙酸乙酯的己烷洗脫)純化粗制的物質(zhì)，得到期望的產(chǎn)物。ESI-MS m/z計算值為316.06，實測值為317.1(M+1)+。保留時間2.97分鐘。
步驟b：1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(2-芐基吡啶-4-基)環(huán)丙烷-甲酰胺
向溴化芐基鋅(II)在THF(0.8mL，0.4mmol)中的0.5M溶液中添加[1,1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(8mg，0.01mmol)并在氮氣下將反應(yīng)攪拌20分鐘。添加1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(2-氯吡啶-4-基)環(huán)丙烷甲酰胺(32mg，0.10mmol)并在150℃，在微波中將反應(yīng)照射10分鐘。用飽和的氯化銨溶液(2mL)和飽和的乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液(2mL)淬滅反應(yīng)。將混合物攪拌30分鐘，然后將其用二氯甲烷(3x4mL)萃取。將有機(jī)物用Na2SO4干燥并蒸發(fā)。將粗制的產(chǎn)物溶于DMSO(1mL)并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物(18mg，0.048mmol，48％)。ESI-MS m/z計算值為372.1，實測值為373.3(M+1)+；保留時間2.44分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(2-(2-甲氧基芐基)吡啶-4-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
使用關(guān)于1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(2-芐基吡啶-4-基)環(huán)丙烷甲酰胺所報道的相似程序，由氯化(2-甲氧基芐基)鋅(II)和1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(2-氯吡啶-4-基)環(huán)丙烷-甲酰胺，制備了標(biāo)題化合物。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(4-羥基-6-甲基嘧啶-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向含1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷碳酰氯(45mg，0.2mmol)的吡啶(2mL)中添加2-氨基-6-甲基嘧啶-4-醇(25mg，0.2mmol)并在115℃將反應(yīng)混合物攪拌15小時。將溶劑蒸發(fā)至干并將殘余物再溶于DMF，過濾并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物。ESI-MS m/z計算值為313.1，實測值為314.1(M+1)+。保留時間2.31分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(4-甲基嘧啶-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向含1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷碳酰氯(45mg，0.2mmol)的吡啶(2mL)中添加4-甲基嘧啶-2-胺(22mg，0.2mmol)并在115℃將反應(yīng)混合物攪拌15小時。將溶劑蒸發(fā)至干并將殘余物再溶于DMF，過濾并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物。ESI-MS m/z計算值為297.3，實測值為298.3(M+1)+。保留時間2.14分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-氰基吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向含1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷碳酰氯(45mg，0.2mmol)的吡啶(2mL)中添加5-氨基吡啶甲腈(24mg，0.2mmol)并在115℃將反應(yīng)混合物攪拌15小時。將溶劑蒸發(fā)至干并將殘余物再溶于DMF，過濾并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物。ESI-MS m/z計算值為307.3，實測值為308.3(M+1)+。保留時間2.87分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(2,6-二甲氧基嘧啶-4-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向含1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷碳酰氯(45mg，0.2mmol)的吡啶(2mL)中添加2,6-二甲氧基嘧啶-4-胺(31mg，0.2mmol)并在115℃將反應(yīng)混合物攪拌15小時。將溶劑蒸發(fā)至干并將殘余物再溶于DMF，過濾并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物。ESI-MS m/z計算值為343.3，實測值為344.1(M+1)+。保留時間2.87分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(6-(2,3-二甲基苯氧基)吡啶-3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向含1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷碳酰氯(45mg，0.2mmol)的吡啶(2mL)中添加6-(2,3-二甲基苯氧基)吡啶-3-胺(43mg，0.2mmol)并在115℃將反應(yīng)混合物攪拌15小時。將溶劑蒸發(fā)至干并將殘余物再溶于DMF，過濾并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物。ESI-MS m/z計算值為402.4，實測值為403.1(M+1)+。保留時間3.11分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(4-(1-(4-氯苯氧基)乙基)嘧啶-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向含1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷碳酰氯(45mg，0.2mmol)的吡啶(2mL)中添加4-(1-(4-氯苯氧基)乙基)嘧啶-2-胺(50mg，0.2mmol)并在115℃將反應(yīng)混合物攪拌15小時。將溶劑蒸發(fā)至干并將殘余物再溶于DMF，過濾并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物。ESI-MSm/z計算值為437.9，實測值為438.1(M+1)+。保留時間3.16分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向含1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷碳酰氯(45mg，0.2mmol)的吡啶(2mL)中添加N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)吡啶-2-胺(48mg，0.2mmol)并在115℃將反應(yīng)混合物攪拌15小時。將溶劑蒸發(fā)至干并將殘余物再溶于DMF，過濾并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物。ESI-MS m/z計算值為427.4，實測值為428.1(M+1)+。保留時間2.91分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5,6-二氫呋喃并[2,3-h]喹唑啉-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向含1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷碳酰氯(45mg，0.2mmol)的吡啶(2mL)中添加5,6-二氫呋喃并[3,2-f]喹唑啉-3-胺(37mg，0.2mmol)并在115℃將反應(yīng)混合物攪拌15小時。將溶劑蒸發(fā)至干并將殘余物再溶于DMF，過濾并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液的梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物。ESI-MS m/z計算值為375.4，實測值為375.1(M+1)+。保留時間2.61分鐘。
1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(2-甲苯磺?；拎?3-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向1-(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷碳酰氯(45mg，0.2mmol)的吡啶(2mL)中添加2-甲苯磺?；拎?3-胺(50mg，0.2mmol)并在115℃將反應(yīng)混合物攪拌15小時。將溶劑蒸發(fā)至干并將殘余物再溶于DMF，過濾并使用含有0.05％三氟乙酸的0-99％乙腈水溶液梯度，通過反相制備型液相色譜法純化，得到純產(chǎn)物。ESI-MS m/z計算值為436.5，實測值為437.1(M+1)+。保留時間3.16分鐘。
3-(2-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸的制備
步驟a：5-甲基異胞嘧啶
在室溫，將新制備的甲醇鈉(10.8g，200mmol)懸浮在丙酸乙酯(15.3g，150mmol)的DMF(20mL)溶液中。在1小時期間，添加甲酸甲酯(6.0g，100mmol)。攪拌30分鐘后，快速添加鹽酸胍(9.6g g，100mmol)的MeOH(35mL)溶液并將反應(yīng)混合物回流12小時。冷卻至30℃并用濃鹽酸將pH調(diào)節(jié)至6.0后，將於漿在5℃保持30分鐘。收集固體，用甲醇洗滌，從水中結(jié)晶并在真空中干燥，得到5-甲基異胞嘧啶(7.3g，58.4％收率)。1H NMR(300MHz，DMSO)：δ10.83(br s，2H)，7.38(s，1H)，6.26(br s，2H)，1.72(s，3H)。
步驟b：4-氯-2-氨基-5-甲基嘧啶
將5-甲基異胞嘧啶(3g，24.0mmol)和POCl3(20mL)的混合物回流45分鐘。減壓下除去過量的POCl3并將殘余物倒在冰上。在10℃，將得到的混合物用氨變成堿性。將沉淀物過濾并從乙醇中結(jié)晶，得到4-氯-2-氨基-5-甲基嘧啶(1g 29.0％收率)。1H NMR(400MHz，DMSO)：δ8.11(s，1H)，6.81(br s，2H)，2.04(s，3H)。
步驟c：3-(2-氨基-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸叔丁酯
向4-氯-5-甲基嘧啶-2-胺(150mg，1.04mmol)、四三苯基膦鈀(0)(60mg，0.052mmol)和3-(叔丁氧羰基)苯基硼酸(347mg，1.56mmol)中添加1,2-DME(3mL)和Na2CO3(1.04mL，2M，2.08mmol)并在微波反應(yīng)器中加熱至120℃持續(xù)30分鐘。使用EtOAc將反應(yīng)混合物過濾，將濾液用無水Na2SO4干燥并在減壓下蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法純化粗制的產(chǎn)物，得到3-(2-氨基-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸叔丁酯(148mg，50％)。ESI-MS m/z計算值為285.1，實測值為286.5(M+1)+。保留時間1.33分鐘。
步驟d：3-(2-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸叔丁酯
向1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷碳酰氯(91mg，0.35mmol)和3-(2-氨基-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸叔丁酯(50mg，0.175mmol)中添加吡啶(2mL)。在90℃，將反應(yīng)加熱24小時。在減壓下蒸發(fā)吡啶。得到的混合物溶于乙酸乙酯并過濾。用飽和的NaHCO3水溶液(x 3)洗滌濾液。將有機(jī)層用無水Na2SO4干燥并在減壓下蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法純化粗制的產(chǎn)物，得到3-(2-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸叔丁酯。ESI-MS m/z計算值為509.18，實測值為510.5(M+1)+。保留時間2.22分鐘
步驟e：3-(2-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸
向3-(2-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸叔丁酯(48mg，0.094mmol)中添加二氯甲烷(1mL)和TFA(726μL)并在室溫攪拌4小時。在減壓下蒸發(fā)二氯甲烷和TFA。將粗制的產(chǎn)物溶于DMSO(1mL)，過濾并通過反相制備型HPLC純化，得到3-(2-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸。ESI-MS m/z計算值為453.11，實測值為454.3(M+1)+。保留時間1.63分鐘。
4-(2-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸的制備
步驟a：4-(2-氨基-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸叔丁酯
向4-氯-5-甲基嘧啶-2-胺(150mg，1.04mmol)、四三苯基膦鈀(0)(60mg，0.052mmol)和4-(叔丁氧羰基)苯基硼酸(347mg，1.56mmol)中添加1,2-DME(3mL)和Na2CO3(1.04mL，2M，2.08mmol)并在微波反應(yīng)器中加熱至120℃持續(xù)30分鐘。使用EtOAc過濾反應(yīng)混合物，將濾液用水Na2SO4干燥并在減壓下蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法純化粗制的產(chǎn)物，得到4-(2-氨基-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸叔丁酯(149mg，50％)。ESI-MS m/z計算值為285.1，實測值為286.3(M+1)+。保留時間1.36分鐘。
步驟b：4-(2-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸叔丁酯
向1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷碳酰氯(91mg，0.35mmol)和4-(2-氨基-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸叔丁酯(50mg，0.175mmol)中添加吡啶(2mL)。在90℃，將反應(yīng)加熱24小時。在減壓下蒸發(fā)吡啶。將得到的混合物溶于EtOAc并過濾。用飽和的NaHCO3水溶液(x 3)洗滌濾液。將有機(jī)層用無水Na2SO4干燥并在減壓下蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法純化粗制的產(chǎn)物，得到4-(2-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸叔丁酯。ESI-MS m/z計算值為509.2，實測值為510.5(M+1)+。保留時間2.18分鐘。
步驟c：4-(2-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸
向4-(2-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸叔丁酯(68mg，0.13mmol)中添加DCM(1.42mL)和TFA(1.00mL)并在室溫攪拌1小時。在減壓下蒸發(fā)DCM和TFA。將粗制的產(chǎn)物溶于DMSO(1mL)，過濾并通過反相制備型HPLC純化，得到4-(2-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酰氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)苯甲酸。ESI-MS m/z計算值為453.1，實測值為454.3(M+1)+。保留時間1.62分鐘。
1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(4-(6-甲氧基吡啶-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
步驟a：4-(6-甲氧基吡啶-3-基)-5-甲基嘧啶-2-胺
向4-氯-5-甲基嘧啶-2-胺(250mg，1.74mmol)、四三苯基膦鈀(0)(100mg，0.087mmol)和6-甲氧基吡啶-3-基硼酸(398mg，2.60mmol)中添加1,2-DME(6mL)和Na2CO3(1.74mL，2M，3.47mmol)并在微波反應(yīng)器中加熱至120℃持續(xù)30分鐘。使用乙腈過濾反應(yīng)混合物并將濾液用無水Na2SO4干燥并在減壓下蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法純化粗制的產(chǎn)物，得到4-(6-甲氧基吡啶-3-基)-5-甲基嘧啶-2-胺(160mg，43％)。ESI-MS m/z計算值為216.10，實測值為217.5(M+1)+。保留時間0.52分鐘。
步驟b：1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(4-(6-甲氧基吡啶-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺
向1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷碳酰氯(369mg，1.42mmol)和4-(6-甲氧基吡啶-3-基)-5-甲基嘧啶-2-胺(153mg，0.71mmol)中添加吡啶(4mL)。在90℃，將反應(yīng)加熱3.5小時。在減壓下蒸發(fā)吡啶。將得到的混合物溶于乙酸乙酯并過濾。用飽和的NaHCO3水溶液(x 3)洗滌濾液。將有機(jī)層用無水Na2SO4干燥并在減壓下蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法純化粗制的產(chǎn)物，得到1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(4-(6-甲氧基吡啶-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺。ESI-MS m/z計算值為440.13，實測值為441.5(M+1)+。保留時間1.72分鐘。
1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-甲基-4-(6-氧代-1,6-二氫吡啶-3-基)嘧啶-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺的制備
向1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(4-(6-甲氧基吡啶-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺(126mg，0.286mmol)的1,4-二氧雜環(huán)己烷(1.50mL)溶液中添加4M HCl水溶液(775μL，3.10mmol)并在90℃攪拌1小時。將反應(yīng)冷卻至室溫，用Et3N淬滅并濃縮。將得到的混合物溶于EtOAc并過濾。將固體溶于水并使用乙酸乙酯(x3)萃取產(chǎn)物。將合并的有機(jī)層用無水Na2SO4干燥并在減壓下蒸發(fā)。將粗制的產(chǎn)物溶于DMSO(1mL)，過濾并通過反相制備型HPLC純化，得到1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-N-(5-甲基-4-(6-氧代-1,6-二氫吡啶-3-基)嘧啶-2-基)環(huán)丙烷甲酰胺。ESI-MS m/z計算值為426.11，實測值為427.3(M+1)+。保留時間1.34分鐘。
下面列出的是根據(jù)上述實施例制備的本發(fā)明化合物的表征數(shù)據(jù)。
表2.
檢測和測量化合物的△F508-CFTR糾正性質(zhì)的測定法
測定化合物的△F508-CFTR調(diào)控性質(zhì)的膜電位光學(xué)方法。
該測定法采用熒光電壓敏感性染料來測量膜電位變化，用熒光板讀取器(例如，F(xiàn)LIPR III，Molecular Devices，Inc.)來讀出NIH 3T3細(xì)胞中的功能性ΔF508-CFTR的增加。該響應(yīng)的驅(qū)動力是氯離子梯度的形成，與預(yù)先用化合物處理細(xì)胞并隨后載入電壓敏感性染料之后通過單獨的液體添加步驟的通道活化有關(guān)。
糾正化合物的鑒定
為了鑒定糾正有關(guān)△F508-CFTR的運輸缺陷的小分子，開發(fā)了單加入HTS測定格式。在組織培養(yǎng)溫育器中，在37℃、5％CO2、90％濕度下溫育含有細(xì)胞的測定板約2-4小時。在附著于測定板底部后，細(xì)胞即準(zhǔn)備好進(jìn)行化合物暴露。
在組織培養(yǎng)溫育器中，在37℃、5％CO2、90％濕度下，在試驗化合物存在或不存在(陰性對照)下，在不含血清的培養(yǎng)基中溫育細(xì)胞16-24小時。隨后用Krebs Ringers溶液沖洗上述細(xì)胞3次，并載入電壓敏感再分布染料。為了活化ΔF508-CFTR，將10μM福司扣林和CFTR強(qiáng)化劑染料木素(20μM)與無Cl-培養(yǎng)基一起加入各孔。無Cl-培養(yǎng)基的加入促進(jìn)響應(yīng)于ΔF508-CFTR活化的Cl-流出，使用電壓-傳感染劑來光學(xué)監(jiān)測所致膜的去極化。
強(qiáng)化劑化合物的鑒定
為了鑒定ΔF508-CFTR的強(qiáng)化劑，開發(fā)了雙加入HTS測定形式。該HTS測試法采用熒光電壓敏感性染料來在FLIPR III上測量膜電位變化，它是在溫度糾正的ΔF508CFTR NIH 3T3細(xì)胞中的ΔF508CFTR門控(傳導(dǎo))增加的度量。該響應(yīng)的驅(qū)動力是Cl-離子梯度，與預(yù)先用強(qiáng)化劑化合物(或DMSO介質(zhì)對照)處理細(xì)胞并隨后載入再分布染料之后在使用熒光板讀取器如FLIPR III的單獨液體添加步驟中用福司扣林的通道活化有關(guān)。
溶液：
浴溶液#1:(mM)NaCl 160，KCl 4.5，CaCl2 2，MgCl2 1，HEPES 10，用NaOH調(diào)至pH 7.4。
無氯化物的浴溶液：用葡萄糖酸鹽代替浴溶液#1中的氯化物鹽。
細(xì)胞培養(yǎng)
使用穩(wěn)定表達(dá)ΔF508-CFTR的NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行膜電位的光學(xué)測量。在175cm2培養(yǎng)燒瓶中，將細(xì)胞供養(yǎng)在37℃下、在5％CO2和90％濕度中和Dulbecco氏改性Eagle培養(yǎng)基中，其中補(bǔ)充有2mM谷氨酰胺、10％胎牛血清、1X NEAA，β-ME、1X青霉素/鏈霉素和25mM HEPES。就全部光學(xué)測定而言，將細(xì)胞按約20,000/孔接種在384-孔涂有基質(zhì)膠的平板中，在37℃下培養(yǎng)2小時，然后在27℃下培養(yǎng)24小時，供強(qiáng)化劑測定。就糾正測定而言，在27℃或37℃下將細(xì)胞用和不用化合物培養(yǎng)16－24小時。
測定化合物ΔF508-CFTR調(diào)控性質(zhì)的電生理測定法。
1.Ussing室測試法
對表達(dá)ΔF508-CFTR的極化導(dǎo)氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行Ussing室實驗，以進(jìn)一步鑒定在光學(xué)測定法中鑒別的ΔF508-CFTR調(diào)控劑。非CF和CF導(dǎo)氣管上皮分離自支氣管組織，按先前的描述(Galietta，L.J.V.，Lantero，S.，Gazzolo，A.，Sacco，O.，Romano，L.，Rossi，G.A.，&Zegarra-Moran，O.(1998)In Vitro Cell.Dev.Biol.34，478-481)來培養(yǎng)，并覆蓋至預(yù)涂NIH3T3條件培養(yǎng)基的 SnapwellTM過濾器上。四天后，除去頂端培養(yǎng)基，在使用前在空氣液體界面生長細(xì)胞>14天。獲得完全分化的纖毛柱狀細(xì)胞單層，這正是導(dǎo)氣管上皮的特征。非CF HBE分離自無任何已知肺病的不吸煙者。CF-HBE分離自對△F508-CFTR純合的患者。
將生長在 SnapwellTM細(xì)胞培養(yǎng)插件上的HBE固定在Ussing室內(nèi)(Physiologic Instruments，Inc.，San Diego，CA)，利用電壓鉗系統(tǒng)(Department of Bioengineering，University of Iowa，IA)來測量在基底外側(cè)到頂端的Cl-梯度(ISC)存在下的經(jīng)上皮電阻和短路電流。簡言之，在37℃下于電壓鉗記錄條件下(Vhold＝0mV)檢驗HBE?；淄鈧?cè)溶液包含(mM)145NaCl，0.83K2HPO4，3.3KH2PO4，1.2MgCl2，1.2CaCl2，10葡萄糖，10HEPES(用NaOH調(diào)至pH為7.35)，而頂端溶液包含(mM)145葡萄糖酸鈉，1.2MgCl2，1.2CaCl2，10葡萄糖，10HEPES(用NaOH調(diào)至pH為7.35)。
糾正化合物的鑒定
典型的方案采用基底外側(cè)至頂端膜Cl-濃度梯度。為了建立這種梯度，對基底外側(cè)膜使用正常的套環(huán)，而頂端NaCl被等摩爾葡糖酸鈉代替(用NaOH滴定至pH為7.4)，得到穿過上皮的大幅Cl-濃度梯度。全部實驗都是用完好的單層進(jìn)行的。為了完全活化ΔF508-CFTR，將福司扣林(10μM)、PDE抑制劑、IBMX(100μM)和CFTR強(qiáng)化劑染料木素(50μM)加至頂端一側(cè)。
如在其它細(xì)胞類型中所觀察到的，在低溫下溫育FRT細(xì)胞和分離自患病CF患者的人支氣管上皮細(xì)胞(CF-HBE)表明ΔF508-CFTR增加在質(zhì)膜中的CFTR功能性密度。為確定糾正化合物的活性，在37℃下將細(xì)胞與試驗化合物一起溫育24-48小時，并隨后在記錄前洗滌3次。將cAMP和染料木素介導(dǎo)的經(jīng)化合物處理的細(xì)胞中的ISC歸一至37℃對照，并表達(dá)為野生型HBE的CFTR活性的百分比活性。相比37℃對照，用糾正化合物預(yù)溫育細(xì)胞顯著增加了所述cAMP和染料木素介導(dǎo)的ISC。
強(qiáng)化劑化合物的鑒定
典型的方案采用基底外側(cè)至頂端膜Cl-濃度梯度。為了建立這種梯度，對基底外側(cè)膜使用正常的套環(huán)，而頂端NaCl被等摩爾葡糖酸鈉代替(用NaOH滴定至pH 7.4)，得到穿過上皮的大幅Cl-濃度梯度。向細(xì)胞培養(yǎng)插件頂端側(cè)加入福司扣林(10μM)和所有供試化合物。比較假定△F508-CFTR強(qiáng)化劑與已知強(qiáng)化劑染料木素的功效。
2.膜片鉗記錄
利用如先前所描述的(Rae，J.，Cooper，K.，Gates，P.，&Watsky，M.(1991)J.Neurosci.Methods 37，15-26)開孔-碎片記錄技術(shù)，監(jiān)測△F508-NIH3T3細(xì)胞中的總Cl-電流。利用Axopatch 200B碎片-鉗放大器(Axon Instruments Inc.，F(xiàn)oster City，CA)，在22℃下進(jìn)行電壓鉗記錄。吸移管溶液包含(mM)150N-甲基-d-葡萄糖胺(NMDG)-Cl、2MgCl2、2CaCl2、10EGTA、10HEPES和240μg/ml兩性霉素-B(用HCl調(diào)節(jié)至pH為7.35)。細(xì)胞外培養(yǎng)基包含(mM)150NMDG-Cl、2MgCl2、2CaCl2、10HEPES(用HCl調(diào)節(jié)至pH為7.35)。利用裝有Digidata 1320A/D界面連接Clampex 8(Axon Instruments Inc.)的PC進(jìn)行脈沖發(fā)生、數(shù)據(jù)獲取和分析。為了活化△F508-CFTR，將10μM福司扣林和20μM染料木素加至所述浴中，并每30秒監(jiān)測一次電流-電壓關(guān)系。
糾正化合物的鑒定
為了確定糾正化合物在質(zhì)膜中增加功能性ΔF508-CFTR密度的活性，在用所述糾正化合物處理24小時之后使用上述開孔-鉗記錄技術(shù)來測量電流密度。為了完全活化ΔF508-CFTR，將10μM福司扣林和20μM染料木素加至所述細(xì)胞。在該記錄條件下，在27℃下溫育24小時后的電流密度高于在37℃下溫育24小時后觀察到的電流密度。這些結(jié)果與低溫溫育對質(zhì)膜中的ΔF508-CFTR密度的已知效果相符。為了確定糾正化合物對CFTR電流密度的效果，將所述細(xì)胞與10μM試驗化合物在37℃下溫育24小時，將電流密度與27℃和37℃的對照比較(％活性)。在記錄之前用細(xì)胞外記錄培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，除去任何余留的試驗化合物。相比所述37℃對照，用10μM糾正化合物預(yù)溫育顯著增加所述cAMP和染料木素決定的電流。
強(qiáng)化化合物的鑒定
也利用開孔-碎片-記錄技術(shù)研究了△F508-CFTR強(qiáng)化劑增加穩(wěn)定表達(dá)△F508-CFTR的NIH3T3細(xì)胞中宏觀△F508-CFTR Cl-電流(I△F508)的能力。從光學(xué)測定法鑒定的強(qiáng)化劑引起I△F508的劑量-依賴性增加，效力和功效與光學(xué)測定法相似。在所有所檢查的細(xì)胞中，強(qiáng)化劑施加之前和期間的反向電位為-30mV左右，它是所計算的ECl(-28mV)。
細(xì)胞培養(yǎng)
使用穩(wěn)定表達(dá)△F508-CFTR的NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞記錄。在175cm2培養(yǎng)燒瓶中，將細(xì)胞供養(yǎng)在37℃下、在5％CO2和90％濕度中和Dulbecco氏改性Eagle培養(yǎng)基中，其中補(bǔ)充有2mM谷氨酰胺、10％胎牛血清、1X NEAA，β-ME、1X青霉素/鏈霉素和25mM HEPES。就全細(xì)胞記錄而言，將2,500－5,000細(xì)胞接種在涂有聚-L-賴氨酸的玻璃蓋片上，在27℃下培養(yǎng)24－48小時，然后用于測試強(qiáng)化劑活性；用或不用糾正化合物在37℃下溫育，用于測量糾正劑的活性。
3.單通道記錄
借助在先描述的切除的內(nèi)側(cè)外翻的膜片記錄(Dalemans，W.，Barbry，P.，Champigny，G.，Jallat，S.，Dott，K.，Dreyer，D.，Crystal，R.G.，Pavirani，A.，Lecocq，J-P.，Lazdunski，M.(1991)Nature 354，526-528)用Axopatch 200B碎片鉗放大器(Axon Instruments Inc.)來觀察表達(dá)于NIH3T3細(xì)胞中的野生型CFTR和溫度糾正的△F508-CFTR的門控活性。吸移管包含(mM)：150NMDG、150天冬氨酸、5CaCl2、2MgCl2和10HEPES(用Tris堿將pH調(diào)至7.35)。浴包含(mM)：150NMDG-Cl、2MgCl2、5EGTA、10TES和14Tris堿(用HCl將pH調(diào)至7.35)。切除后加入1mM Mg-ATP、75nM cAMP-依賴性蛋白激酶催化性亞單位(PKA；Promega Corp.Madison，WI)和10mM NaF，活化野生型CFTR和△F508-CFTR，抑制阻止電流減少的蛋白磷酸酶。吸移管電位維持在80mV。分析含有≤2個活動通道的膜片的通道活動。在實驗過程期間同時開放的最大數(shù)量決定了活動通道的數(shù)量。為了測定單通道電流幅度，在100Hz下“離線”過濾從120秒△F508-CFTR活性記錄的數(shù)據(jù)，然后用于構(gòu)建全點幅度直方圖，利用Bio-Patch分析軟件(Bio-Logic Comp.France)用多高斯函數(shù)擬合。從120秒通道活動測定總微觀電流和開放概率(PO)。PO是利用Bio-Patch軟件或者從PO＝I/i(N)測定的，其中I＝平均電流，i＝單通道電流幅度，N＝碎片中活動通道的數(shù)量。
細(xì)胞培養(yǎng)
使用穩(wěn)定表達(dá)△F508-CFTR的NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行切除膜片鉗記錄。在175cm2培養(yǎng)燒瓶中，將細(xì)胞供養(yǎng)在37℃下、在5％CO2和90％濕度中和Dulbecco氏改性Eagle培養(yǎng)基中，其中補(bǔ)充有2mM谷氨酰胺、10％胎牛血清、1X NEAA，β-ME、1X青霉素/鏈霉素和25mM HEPES。就單通道記錄而言，將2,500－5,000細(xì)胞接種在涂有聚-L-賴氨酸的玻璃蓋片上，在27℃下培養(yǎng)24－48小時備用。
發(fā)現(xiàn)表1的化合物在上文所描述的測定法中測定時顯示糾正活性。
本發(fā)明化合物可用作ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)控劑。使用前文描述的方法，測定了本發(fā)明化合物的活性，即EC50，并將其顯示于表3。
表3.