本發(fā)明所述涉及一種基于四乙烯基的Gemini型兩親性化合物，特別涉及一種基于四苯乙烯基的Gemini型類兩親化合物的制備及其作為非病毒基因載體、DNA分子熒光探針、生物顯影劑以及基因示蹤劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因治療是將外援正?；?qū)氩◇w細(xì)胞以替換或修補(bǔ)缺陷的基因，從而達(dá)到治療相應(yīng)疾病的目的。在細(xì)胞膜上有很多帶有負(fù)電荷的糖蛋白和糖脂化合物，核酸的骨架結(jié)構(gòu)中的磷酸基團(tuán)也帶有負(fù)電荷，并且核酸本身具有較大的體積，因此裸露的核酸難以被細(xì)胞吞噬。為了解決裸露核酸難以被細(xì)胞攝取的難題，科研工作者們發(fā)展了基因載體?；蜉d體可以有效的將細(xì)胞外的核酸帶入細(xì)胞內(nèi)，并可以一定程度上保護(hù)核酸在細(xì)胞核不被核酸酶水解。另外，基因載體在運(yùn)輸核酸進(jìn)入細(xì)胞后，也可以將核酸釋放，而被釋放的核酸又可以進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行相應(yīng)的蛋白表達(dá)，最終達(dá)到基因治療的目的。

基因載體一般可分為兩類，一類是病毒型載體，一類是非病毒載體。通常，病毒型載體的轉(zhuǎn)染效率很高，并且可進(jìn)行迅速表達(dá)，因而病毒型載體在臨床試驗(yàn)中被廣發(fā)使用。但是，病毒型載體也要其固有的缺陷，如：潛在的免疫原性和致瘤性；攜帶的核酸尺寸有限(通常為2-3kb)；制備和存儲(chǔ)困難復(fù)雜等。而非病毒型載體不僅僅可以完全避免上述缺陷，且其本身還有很多其他優(yōu)點(diǎn)，如結(jié)構(gòu)可調(diào)、可大規(guī)模生產(chǎn)和具有靶標(biāo)性。這些特性更利于非病毒載體在基因治療中的應(yīng)用。但是，非病毒基因載體也有缺陷，其中最重要的，也是最亟待克服的是如何解決其轉(zhuǎn)染效率低的難題。

目前，非病毒類載體有很多種，包括陽(yáng)離子化合物，陽(yáng)離子脂質(zhì)體，陽(yáng)離子聚合物，功能納米粒子，無(wú)機(jī)配合物以及量子點(diǎn)等。在陽(yáng)離子化合物中，具有Gemini型結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)由于具有較高的荷質(zhì)比(電荷/質(zhì)量)，可以更有效的凝聚DNA。因而發(fā)展Gemini型脂質(zhì)作為非病毒基因載體也被廣泛研究。在大量的Gemini型非病毒基因載體中，已經(jīng)有一些具有不錯(cuò)的轉(zhuǎn)染效果。但是它們的轉(zhuǎn)染效率與病毒型載體還相差甚遠(yuǎn)，并且目前所報(bào)道的Gemini型載體功能單一，只是作為DNA凝聚和運(yùn)輸工具。發(fā)展具有高轉(zhuǎn)染效率的具有 熒光性質(zhì)Gemini型基因載體可以同時(shí)滿足運(yùn)輸基因和研究基因表達(dá)機(jī)制的兩方面需求?；诖?，設(shè)計(jì)對(duì)DNA具有熒光響應(yīng)的新型Gemini型基因載體具有非常重要的研究?jī)r(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種基于四乙烯基的Gemini型兩親性化合物及其制備方法和用途，本發(fā)明所涉及到的化合物是以四苯乙烯為核心，在四苯乙烯的兩側(cè)分別接上親水的[12]aneN₃單元和疏水的長(zhǎng)碳鏈單元，形成兩親性化合物；這種化合物可以在水溶液中自組裝形成AIE膠束，并可以有效凝聚DNA形成納米顆粒；膠束和納米顆?？梢韵嗷マD(zhuǎn)換；而膠束和納米顆粒被細(xì)胞攝取后，在細(xì)胞中以不同的形態(tài)分布，利用這種特性，可以將本發(fā)明的化合物應(yīng)用于示蹤基因轉(zhuǎn)染的過(guò)程。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種基于四乙烯基的Gemini型兩親性化合物，其特征在于，由式(Ⅰ)表示，

R表示直鏈直鏈烷基或直鏈單烯基。

優(yōu)選的是，所述的基于四乙烯基的Gemini型兩親性化合物中，R表示C₈、C₁₂或C₁₈直鏈烷基。

優(yōu)選的是，所述的基于四乙烯基的Gemini型兩親性化合物中，R表示C₁₈直鏈單烯基。

優(yōu)選的是，所述的基于四乙烯基的Gemini型兩親性化合物中，該Gemini型兩親性化合物作為DNA分子熒光探針的應(yīng)用。

優(yōu)選的是，所述的基于四乙烯基的Gemini型兩親性化合物中，該Gemini型兩親性化合物作為非病毒基因載體的應(yīng)用。

優(yōu)選的是，所述的基于四乙烯基的Gemini型兩親性化合物中，該Gemini型兩親性化合物作為基因示蹤劑中有效成分的應(yīng)用。

優(yōu)選的是，所述的基于四乙烯基的Gemini型兩親性化合物中，該Gemini型兩親性化 合物作為生物顯影劑中有效成分的應(yīng)用。

一種合成權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)化合物的方法，包括以下步驟：(1)通過(guò)McMurry偶聯(lián)反應(yīng)制備式(Ⅱ)所示的雙羥基雙溴四苯乙烯；(2)在通過(guò)對(duì)式(Ⅱ)進(jìn)行親核取代反應(yīng)制備式(Ⅲ)所示的化合物；(3)式(Ⅲ)通過(guò)與炔基修飾的[12]aneN₃的Click反應(yīng)合成式(Ⅰ)的化合物；

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

第一、本發(fā)明的化合物是以四苯乙烯為核心單元，兩端修飾親水的[12]aneN₃單元和疏水的長(zhǎng)碳鏈單元，形成具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性的兩親性化合物；

第二、本發(fā)明的化合物可自組裝形成膠束，也可凝聚DNA形成納米顆粒；

第三、本發(fā)明的化合物可作為非病毒基因載體，其中實(shí)施例中給出的化合物1和2的轉(zhuǎn)染效率接近，甚至在某些情況下超過(guò)了商業(yè)化的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000。

第四、本發(fā)明公開的化合物實(shí)現(xiàn)了膠束和納米顆粒在體外可相互轉(zhuǎn)化；利用這種特性，可將本發(fā)明的化合物應(yīng)用于示蹤基因轉(zhuǎn)染過(guò)程，便于研究轉(zhuǎn)染機(jī)制，從而為設(shè)計(jì)新型的脂質(zhì)類非病毒基因載體提供有價(jià)值的信息。

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說(shuō)明

圖1A為本發(fā)明實(shí)施例2中化合物1自組裝膠束的臨界膠束濃度測(cè)定結(jié)果圖；

圖1B為本發(fā)明實(shí)施例2中化合物2自組裝膠束的臨界膠束濃度測(cè)定結(jié)果圖；

圖1C為本發(fā)明實(shí)施例2中化合物3自組裝膠束的臨界膠束濃度測(cè)定結(jié)果圖；

圖1D為本發(fā)明實(shí)施例2中化合物4自組裝膠束的臨界膠束濃度測(cè)定結(jié)果圖；

圖1E為本發(fā)明實(shí)施例2中化合物1自組裝膠束的掃描顯微鏡圖；

圖1F為本發(fā)明實(shí)施例2中化合物2自組裝膠束的掃描顯微鏡圖；

圖1G為本發(fā)明實(shí)施例2中化合物3自組裝膠束的掃描顯微鏡圖；

圖1H為本發(fā)明實(shí)施例2中化合物4自組裝膠束的掃描顯微鏡圖；

圖2A為本發(fā)明實(shí)施例3中化合物1對(duì)pGL-3的瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)圖；

圖2B為本發(fā)明實(shí)施例3中化合物2對(duì)pGL-3的瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)圖；

圖2C為本發(fā)明實(shí)施例3中化合物3對(duì)pGL-3的瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)圖；

圖2D為本發(fā)明實(shí)施例3中化合物4對(duì)pGL-3的瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)圖；

圖3A為本發(fā)明實(shí)施例4中細(xì)胞對(duì)化合物1形成的膠束的攝取圖；

圖3B為本發(fā)明實(shí)施例4中細(xì)胞對(duì)化合物2形成的膠束的攝取圖；

圖3C為本發(fā)明實(shí)施例4中細(xì)胞對(duì)化合物3形成的膠束的攝取圖；

圖3D為本發(fā)明實(shí)施例4中細(xì)胞對(duì)化合物4形成的膠束的攝取圖；

圖3E為本發(fā)明實(shí)施例4中細(xì)胞對(duì)化合物1凝聚DNA的納米顆粒的細(xì)胞攝圖；

圖3F為本發(fā)明實(shí)施例4中細(xì)胞對(duì)化合物2凝聚DNA的納米顆粒的細(xì)胞攝圖；

圖3G為本發(fā)明實(shí)施例4中細(xì)胞對(duì)化合物3凝聚DNA的納米顆粒的細(xì)胞攝圖；

圖3H為本發(fā)明實(shí)施例4中細(xì)胞對(duì)化合物4凝聚DNA的納米顆粒的細(xì)胞攝圖；

圖4A為本發(fā)明實(shí)施例5中化合物1本身轉(zhuǎn)染pEGFP-N1基因的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；

圖4B為本發(fā)明實(shí)施例5中化合物2本身轉(zhuǎn)染pEGFP-N1基因的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；

圖4C為本發(fā)明實(shí)施例5中化合物3本身轉(zhuǎn)染pEGFP-N1基因的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；

圖4D為本發(fā)明實(shí)施例5中化合物4本身轉(zhuǎn)染pEGFP-N1基因的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；

圖4E為本發(fā)明實(shí)施例5中化合物1與DOPE形成的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pEGFP基因的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；

圖4F為本發(fā)明實(shí)施例5中化合物2與DOPE形成的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pEGFP基因的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；

圖4G為本發(fā)明實(shí)施例5中化合物3與DOPE形成的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pEGFP基因的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；

圖4H為本發(fā)明實(shí)施例5中化合物4與DOPE形成的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pEGFP基因的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；

圖4I為本發(fā)明實(shí)施例5中Lip2000轉(zhuǎn)染pEGFP-N1基因的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；

圖4J為本發(fā)明實(shí)施例5中pEGFP的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；

圖4K為本發(fā)明實(shí)施例5中DOPE轉(zhuǎn)染pEGFP基因的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；

圖4L為本發(fā)明實(shí)施例5中空白對(duì)照組的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；

圖5A為本發(fā)明實(shí)施例6中不同濃度的化合物1～4在HepG2細(xì)胞中的熒光素酶表達(dá)結(jié)果；

圖5B為本發(fā)明實(shí)施例6中化合物1與DOPE在不同配比下形成的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pGL-3基因的熒光素酶表達(dá)結(jié)果；

圖5C為本發(fā)明實(shí)施例6中化合物2與DOPE在不同配比下形成的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pGL-3基因的熒光素酶表達(dá)結(jié)果；

圖5D為本發(fā)明實(shí)施例6中化合物3與DOPE在不同配比下形成的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pGL-3基因的熒光素酶表達(dá)結(jié)果；

圖5E為本發(fā)明實(shí)施例6中化合物4與DOPE在不同配比下形成的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pGL-3基因的熒光素酶表達(dá)結(jié)果；

圖5F為本發(fā)明實(shí)施例6中化合物1～4以及化合物1～4與DOPE形成的脂質(zhì)體在HepG2、Hela、A549和HEK293T中的轉(zhuǎn)染pGL-3基因的熒光素酶表達(dá)結(jié)果；

圖6A為本發(fā)明實(shí)施例7中細(xì)胞攝取化合物2凝聚的pUC18 DNA在0.5h的BF圖；

圖6B為本發(fā)明實(shí)施例7中細(xì)胞攝取化合物2凝聚的pUC18 DNA在2.0h的BF圖；

圖6C為本發(fā)明實(shí)施例7中細(xì)胞攝取化合物2凝聚的pUC18 DNA在4.0h的BF圖；

圖6D為本發(fā)明實(shí)施例7中細(xì)胞攝取化合物2凝聚的pUC18 DNA在24h的BF圖；

圖6E為本發(fā)明實(shí)施例7中細(xì)胞攝取化合物2凝聚的pUC18 DNA在0.5h的DAPI圖；

圖6F為本發(fā)明實(shí)施例7中細(xì)胞攝取化合物2凝聚的pUC18 DNA在2.0h的DAPI圖；

圖6G為本發(fā)明實(shí)施例7中細(xì)胞攝取化合物2凝聚的pUC18 DNA在4.0h的DAPI圖；

圖6H為本發(fā)明實(shí)施例7中細(xì)胞攝取化合物2凝聚的pUC18 DNA在24h的DAPI圖；

圖6I為本發(fā)明實(shí)施例7中細(xì)胞攝取化合物2凝聚的pUC18 DNA在0.5h的BF和DAPI的合并圖；

圖6J為本發(fā)明實(shí)施例7中細(xì)胞攝取化合物2凝聚的pUC18 DNA在2.0h的BF和DAPI的合并圖；

圖6K為本發(fā)明實(shí)施例7中細(xì)胞攝取化合物2凝聚的pUC18 DNA在4.0h的BF和DAPI的合并圖；

圖6L為本發(fā)明實(shí)施例7中細(xì)胞攝取化合物2凝聚的pUC18 DNA在24h的BF和DAPI的合并圖；

圖7A、圖7E、圖7I、圖7M、圖7Q和圖7U分別為本發(fā)明實(shí)施例8中DAPI圖像中HepG2細(xì)胞對(duì)化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h細(xì)胞攝取結(jié)果圖；

圖7B、圖7F、圖7J、圖7N、圖7R和圖7V分別為本發(fā)明實(shí)施例8中FITC圖像中HepG2細(xì)胞對(duì)化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h細(xì)胞攝取結(jié)果圖；

圖7C、圖7G、圖7K、圖7O、圖7S和圖7W分別為本發(fā)明實(shí)施例8中DAPI+FITC圖像中HepG2細(xì)胞對(duì)化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h細(xì)胞攝取結(jié)果圖；

圖7D、圖7H、圖7L、圖7P、圖7T和圖7X分別為本發(fā)明實(shí)施例8中DAPI+FITC+BF圖像中HepG2細(xì)胞對(duì)化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h細(xì)胞攝取結(jié)果圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例9中ctDNA對(duì)10μM化合物1、2、3和4的熒光滴定結(jié)果；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語(yǔ)并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。

本發(fā)明的目的在于提供一種可作為新型的Gemini型非病毒基因載體的化合物的制備及其在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。本發(fā)明所涉及到的化合物是以四苯乙烯為核心，在四苯乙烯的兩側(cè)分別接上親水的[12]aneN₃單元和疏水的長(zhǎng)碳鏈單元，形成兩親性化合物。這種化合物可以在水溶液中自組裝形成AIE膠束，并可以有效凝聚DNA形成納米顆粒。膠束和納米顆?？梢韵嗷マD(zhuǎn)換。而膠束和納米顆粒被細(xì)胞攝取后，在細(xì)胞中以不同的形態(tài)分布，利用這種特性，可以將本發(fā)明的化合物應(yīng)用于示蹤基因轉(zhuǎn)染的過(guò)程。

實(shí)施例1、

合成式(Ⅰ)所示的基于四乙烯基的Gemini型兩親性化合物，

R表示直鏈烷基或直鏈單烯基；在本實(shí)施例中以R表示C₈、C₁₂和C₁₈的直鏈烷基，以及(E)-9-十八烯基為例；R表示C₈直鏈烷基時(shí)為化合物1，R表示C₁₂直鏈烷基時(shí)為化合物2，R表示C₁₈直鏈烷基時(shí)為化合物3，R表示(E)-9-十八烯基時(shí)為化合物4。

合成路線為：

路線1化合物1，2，3和4的制備流程：(i)鋅粉，四氯化鈦，四氫呋喃，-78℃至60℃，過(guò)夜；(ii)碳酸鉀，碘化鉀，丙酮，回流，48小時(shí)；(iii)正丁基鋰，四氫呋喃，-78℃至室溫；(iv)a：五水硫酸銅，抗壞血酸鈉，四氫呋喃/水，氬氣，室溫過(guò)夜；b：氯化氫飽和乙酸乙酯溶液，室溫30分鐘；c：氫氧化鈉，水，室溫30分鐘。

路線2化合物14，15和16的制備流程：(i)疊氮鈉，丙酮/水，0℃至室溫，過(guò)夜；(ii)炔丙基溴，三乙胺，乙腈，回，過(guò)夜；(iii)四溴化碳，三苯基膦，二氯甲烷，0℃至室溫，過(guò)夜。

具體合成步驟為：

(1)、在惰性氣氛和-78℃條件下，將等當(dāng)量的4,4’-二羥基二苯甲酮和4,4’-二溴二苯甲酮，和8.0當(dāng)量的鋅粉加入至三口燒瓶中，Ar氣換氣三次后，用注射器注入無(wú)水四氫呋喃；再用Ar氣換氣三次后，用注射器緩慢注入4.0當(dāng)量的四氯化鈦；將溶液移至室溫反應(yīng)30min后，升溫至60℃，反應(yīng)過(guò)夜；將反應(yīng)溶液降低至室溫，濃縮，然后加入30mL 10％的碳酸鉀水溶液；30mL乙酸乙酯萃取三次后，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥；過(guò)濾，濃縮得到粗產(chǎn)物；通過(guò)柱色譜純化，得到化合物5，產(chǎn)率26％；

FT-IR(KBr,cm^-1):3364(s),3027(w),2926(w),1607(s),1590(m),1508(vs),1429(m),1254(s),1170(s),1070(m),1009(s),827(s),798(m).¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ(ppm)9.40(s,2H),7.30(d,J＝8.5Hz,4H),6.83(d,J＝8.4Hz,4H),6.72(d,J＝8.5Hz,4H),6.50(d,J＝8.5Hz,4H).¹³C NMR(DMSO-d₆,101MHz):δ(ppm)155.72,142.47,141.53,134.54,132.95,132.40,131.54,130.30,118.76,114.21.ESI-MS:cald.For[C₂₆H₁₈Br₂O₂]521.9653,found 521.9664。

(2)、向化合物5的丙酮溶液中，加入3.0當(dāng)量的1-溴-烷烴，4.0當(dāng)量的碳酸鉀和催化量的碘化鉀；反應(yīng)液攪拌回流48h后，冷卻至室溫；過(guò)濾收集濾液，硅膠吸附，柱色譜得到純化合物6～9，產(chǎn)率50～92％；

化合物6：1.20g，1.40mmol；產(chǎn)率：73％。FT-IR(KBr,cm^-1):3062(w),3036(w),2953(vs),2925(vs),2854(vs),1604(vs),1571(m),1508(vs),1486(vs),1469(vs),1391(s),1292(s),1245(vs),1173(vs),1070(s),1010(vs),823(vs),790(s).¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ(ppm)7.25(d,J＝8.5Hz,2H),6.94-6.85(m,4H),6.67(d,J＝8.8Hz,2H),3.92(t,J＝6.6Hz,2H),1.82-1.70(m,2H),1.45(m,2H),1.36-1.25(m,8H),0.92(t,J＝6.7Hz,3H).¹³C NMR(CDCl3,101MHz):δ(ppm)157.00,141.90,140.65,135.31,134.39,132.05,131.53,130.00,119.22,112.70,66.86,30.85,28.42,28.32,28.28,25.10,21.70,13.17.MALDI-TOF-MS:m/z calcd.for[C₄₂H₅₀Br₂O₂+H]⁺747.224；found 746.687.

化合物7：1.51g，1.75mmol；產(chǎn)率：91％。FT-IR(KBr,cm^-1):3062(w),3033(w),2920(vs),2850(vs),1604(vs),1507(vs),1468(vs),1392(s),1286(s),1244(vs),1173(vs),1070(s),1010(vs),834(s),792(s).¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ(ppm)7.22(d,J＝8.1Hz,2H),6.87(m,4H),6.64(d,J＝8.3Hz,2H),3.88(t,J＝6.5Hz,2H),1.75(m,2H),1.42(m,2H),1.27(s,16H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H).¹³C NMR(CDCl₃,101MHz):δ(ppm)157.00,141.91,140.66,135.31,134.39,132.06,131.54,130.01,119.23,112.71,66.86,30.97,28.72,28.69,28.66,28.63, 28.48,28.41,28.33,25.11,21.75,13.20.MALDI-TOF-MS:m/z calcd.for[C₅₀H₆₆Br₂O₂+H]⁺859.349；found 858.885.

化合物8：1.42g，1.38mmol；產(chǎn)率：72％。FT-IR(KBr,cm^-1):3061(w),3031(w),2952(vs),2923(vs),2850(vs),1604(s),1507(vs),1468(vs),1392(m),1285(m),1244(vs),1174(s),1070(s),1010(s),834(s),792(s).¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ(ppm)7.23(d,J＝8.5Hz,2H),6.88(m,4H),6.64(d,J＝8.3Hz,2H),3.89(t,J＝6.6Hz,2H),1.81-1.68(m,2H),1.50-1.40(m,2H),1.26(s,28H),0.89(t,J＝6.7Hz,3H).¹³C NMR(CDCl₃,101MHz):δ(ppm)157.00,141.89,140.64,135.31,134.38,132.04,131.52,129.90,119.21,112.70,66.87,30.96,28.73,28.69,28.64,28.61,28.46,28.40,28.32,25.09,21.73,13.17.MALDI-TOF-MS:m/z calcd.for[C₆₂H₉₀Br₂O₂+H]⁺1027.537；found 1027.192.

化合物9：0.97g，0.95mmol；Yield：50％。FT-IR(KBr,cm^-1):2923(s),2852(s),1650(w),1605(s),1507(s),1486(m),1467(m),1391(m),1292(m),1245(vs),1173(s),1010(s),1010(s),824(vs),791(s).¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ(ppm)7.22(d,J＝8.4Hz,2H),6.87(m,4H),6.64(d,J＝8.8Hz,2H),5.42–5.28(m,2H),3.88(t,J＝6.6Hz,2H),2.00(m,4H),1.75(m,2H),1.44(m,2H),1.36–1.25(m,20H),0.88(t,J＝6.9Hz,3H).¹³C NMR(CDCl₃,101MHz):δ(ppm)157.01,141.89,140.66,135.32,134.39,132.03,131.51,129.99,128.98,128.83,119.21,112.71,66.85,31.63,30.93,28.79,28.77,28.72,28.68,28.59,28.55,28.48,28.45,28.42,28.34,28.31,26.21,25.93,25.08,21.71,21.68,13.15.MALDI-TOF-MS:m/z calcd.for[C₆₂H₈₆Br₂O₂+H]⁺1023.505；found 1023.126.

(3)將6～9溶于無(wú)水四氫呋喃中，冷卻至-78℃，并用Ar氣換氣三次；用注射器緩慢注入2.5當(dāng)量的正丁基鋰四氫呋喃溶液(2.5M)；保持-78℃攪拌2小時(shí)后，用注射器緩慢注入3.0當(dāng)量的化合物15的四氫呋喃溶液；繼續(xù)保持-78℃反應(yīng)1小時(shí)后，自然升溫至室溫反應(yīng)過(guò)夜；次日，緩慢加入30mL飽和氯化銨水溶液淬滅反應(yīng)；然后用30mL二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮得到粗產(chǎn)物；柱色譜分離得到純化合物10～13；

化合物10：產(chǎn)率：39％。FT-IR(KBr,cm^-1):3033(w),2954(m),2928(m),2857(m),2121(s),2088(s),1604(s),1506(vs),1462(m),1291(vs),1244(vs),1174(s),1111(m),1028(m),831(vs).¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ(ppm)6.99(d,J＝8.1Hz,2H),6.91(d,J＝8.3Hz,2H),6.78(d,J＝8.2Hz,2H),6.65(d,J＝8.4Hz,2H),3.89(t,J＝6.6Hz,2H),1.75(m,2H),1.43(m,2H),1.37–1.20(m,8H),0.89(t,J＝6.7Hz,3H).¹³C NMR(CDCl₃,101MHz):δ(ppm)156.86,140.63,139.98,136.64,135.80,134.75,131.82,131.57,117.47,112.66,66.85,30.85,28.43,28.34,28.28,25.10,21.71,13.17.

化合物11：產(chǎn)率：24％。FT-IR(KBr,cm^-1):3033(w),2954(s),2924(vs),2853(s),2120 (vs),2090(s),1604(s),1508(vs),1467(m),1292(s),1254(vs),1173(m),1112(w),1029(w),830(m).¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ(ppm)6.99(d,J＝8.1Hz,2H),6.90(d,J＝8.2Hz,2H),6.78(d,J＝8.1Hz,2H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),3.89(t,J＝6.7Hz,2H),1.75(m,2H),1.42(m,2H),1.29(s,16H),0.89(t,J＝6.6Hz,3H).¹³C NMR(CDCl₃,101MHz):δ(ppm)156.85,140.02,139.96,136.63,135.70,134.73,131.79,131.55,117.46,112.65,66.81,30.94,28.73,28.69,28.66,28.63,28.60,28.45,28.38,28.32,25.09,21.72,13.17.

化合物12：產(chǎn)率：27％。FT-IR(KBr,cm^-1):3033(w),2924(vs),2853(vs),2102(vs),2089(vs),1604(vs),1570(m),1507(vs),1466(s),1292(vs),1244(vs),1173(s),1111(m),1028(m),831(s).¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ(ppm)6.98(d,J＝8.5Hz,2H),6.90(d,J＝8.8Hz,2H),6.77(d,J＝8.7Hz,2H),6.63(d,J＝8.7Hz,2H),3.88(t,J＝6.6Hz,2H),1.81–1.69(m,2H),1.42(m,2H),1.26(s,28H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H).¹³C NMR(CDCl₃,101MHz):δ(ppm)156.85,140.02,139.96,136.63,135.79,134.73,131.80,131.55,117.46,112.64,66.85,30.95,28.73,28.69,20.63,28.61,28.46,28.40,28.33,25.92,25.09,21.72,13.17.

化合物13：產(chǎn)率：53％。FT-IR(KBr,cm^-1):3034(w),2952(vs),2919(vs),2853(vs),2120(vs),2089(vs),1604(s),1507(vs),1466(s),1292(vs),1244(vs),1174(s),1029(m),831(vs). ¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ(ppm)6.98(d,J＝8.5Hz,2H),6.90(d,J＝8.7Hz,2H),6.77(d,J＝8.7Hz,2H),6.63(d,J＝8.7Hz,2H),5.46–5.24(m,2H),3.88(t,J＝6.5Hz,2H),2.01(m,4H),1.83–1.66(m,2H),1.42(m,2H),1.37–1.15(m,20H),0.87(t,J＝6.7Hz,3H).¹³C NMR(CDCl₃,101MHz):δ(ppm)156.87,140.04,136.66,134.76,131.81,131.56,129.30,128.99,128.83,125.58,117.47,112.67,66.83,30.94,28.80,28.78,28.56,28.49,28.43,28.36,28.33,28.26,26.25,26.22,25.09,21.72,13.16.

(4)、在氬氣氛圍下，向化合物10～13的四氫呋喃溶液中加入2.5當(dāng)量的化合物15，0.2當(dāng)量的五水硫酸銅和0.4當(dāng)量的抗壞血酸鈉水溶液；室溫反應(yīng)過(guò)夜后，濃縮，用30mL二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮得到粗產(chǎn)物，柱色譜得到相應(yīng)化合物1～4的Boc(叔丁氧羰基)保護(hù)產(chǎn)物。將上述化合物溶于5mL飽和氯化氫的乙酸乙酯溶液，室溫?cái)嚢?0min后，過(guò)濾得到相應(yīng)化合物1～4的鹽酸鹽產(chǎn)物；再將上述產(chǎn)物溶于10mL的1mol/mL的氫氧化鈉水溶液，室溫?cái)嚢?0min；然后用30mL二氯甲烷溶液萃取三次，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮得到純產(chǎn)物化合物1～4。

化合物1：產(chǎn)率：76％。FT-IR(KBr,cm^-1):3431(m),3253(m),3044(m),2925(vs),2853(s),1061(s),1506(s),1471(s),1387(m),1291(m),1244(vs),1169(s),1113(m),1054(s),981(s),830(s).¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ(ppm)8.18(s,1H),7.53(d,J＝8.3Hz,2H),7.13(d,J＝8.2Hz,2H),6.91(d,J＝8.3Hz,2H),6.61(d,J＝8.2Hz,2H),3.84(m,4H),2.99(t,J＝5.4Hz,4H),2.85(t,J＝5.5Hz,4H),2.66(t,J＝5.7Hz,4H),2.10–1.73(m,6H),1.69(m, 2H),1.43–1.35(m,2H),1.28–1.08(m,8H),0.82(t,J＝6.6Hz,3H).¹³C NMR(CDCl₃,101MHz):δ(ppm)157.18,143.57,142.76,141.80,134.90,134.12,133.79,131.69,131.58,120.37,118.70,112.79,66.87,51.87,48.32,46.27,44.40,30.76,28.34,28.26,28.18,25.03,23.04,22.59,21.61,13.09.HRMS:cald.[C₆₆H₉₆N₁₂O₂+H]⁺1089.7851,found 1089.7853.

化合物2：產(chǎn)率：83％。FT-IR(KBr,cm^-1):3431(m),3246(m),3038(m),2924(vs),2859(s),1608(s),1509(vs),1468(s),1387(m),1289(m),1238(vs),1172(s),1113(m),1047(s),988(s),833(s).¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ(ppm)8.19(s,1H),7.53(d,J＝8.3Hz,2H),7.12(d,J＝8.3Hz,2H),6.90(d,J＝8.4Hz,2H),6.60(d,J＝8.3Hz,2H),3.81(m,4H),2.95(t,J＝5.3Hz,4H),2.82(t,J＝5.4Hz,4H),2.63(t,J＝5.7Hz,4H),2.08–1.72(m,6H),1.68(m,2H),1.36(m,2H),1.21(s,16H),0.81(t,J＝6.7Hz,3H).¹³C NMR(CDCl₃,101MHz):δ(ppm)157.16,143.54,142.87,141.79,134.79,134.11,133.79,131.68,131.57,120.32,118.67,112.77,66.86,52.04,48.49,46.35,44.56,30.87,28.66,28.61,28.59,28.55,28.52,28.39,28.30,28.26,25.03,23.15,22.70,21.65,13.11.HRMS:cald.[C₇₄H₁₁₂N₁₂O₂+2H]²⁺/2 601.4588,found601.4587.

化合物3：Yield：90％。FT-IR(KBr,cm^-1):3425(m),3250 9m),3044(m),2928(vs),2853(s),1608(s),1512(vs),1465(m),1384(m),1286(m),1244(vs),1172(s),1119(m),1041(s),981(s),833(s).¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ(ppm)8.20(s,1H),7.52(d,J＝8.2Hz,2H),7.10(d,J＝8.2Hz,2H),6.88(d,J＝8.2Hz,2H),6.58(d,J＝8.2Hz,2H),3.81(m,4H),3.06-2.89(m,4H),2.81(t,J＝5.3Hz,4H),2.63(t,J＝5.7Hz,4H),2.06–1.74(m,6H),1.66(m,2H),1.35(m,2H),1.18(s,28H),0.80(t,J＝6.6Hz,3H).¹³C NMR(CDCl₃,101MHz):δ(ppm)157.13,143.52,142.78,141.76,134.76,134.09,133.77,131.67,131.56,120.35,118.64,112.74,66.83,51.93,48.38,46.29,44.44,30.87,28.65,28.61,28.56,28.53,28.40,28.32,28.26,25.03,23.09,22.61,21.65,13.11.HRMS:cald.[C₈₆H₁₃₆N₁₂O₂+2H]²⁺/2 685.5527,found 685.5522.

化合物4：產(chǎn)率：71％。FT-IR(KBr,cm^-1):3360(m),3193(m),2963(vs),2918(vs),2853(s),1720(m),1690(m),1595(w),1512(w),1453(s),1381(s),1244(s),1172(m),1059(s),1024(s),958(w).¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ(ppm)7.92(s,1H),7.47(d,J＝8.4Hz,2H),7.11(d,J＝8.3Hz,2H),6.89(d,J＝8.4Hz,2H),6.59(d,J＝8.4Hz,2H),5.36–5.16(m,2H),3.81(t,J＝6.6Hz,2H),3.76(s,2H),2.76(t,J＝5.2Hz,4H),2.76(t,J＝5.2Hz,4H),2.56(t,J＝5.6Hz,4H),2.00–1.84(m,4H),1.75–1.59(m,8H),1.34(m,2H),1.28–1.17(m,20H),0.80(t,J＝6.7Hz,3H).¹³C NMR(CDCl₃,101MHz):δ(ppm)157.16,143.65,143.45,141.77,134.78,134.10,133.94,131.65,128.89,128.74,119.53,118.72,112.75,66.79,51.53,48.57,46.24,44.78,31.56,38.86,28.71,28.69,28.65,28.62,28.56,28.52,28.48,28.41,28.35,28.27,28.17,28.13,28.08,26.16,26.14,25.02,24.70,24.44,21.64,21.61,13.11.HRMS:cald.[C₈₆H₁₃₂N₁₂O₂+2H]²⁺/2 683.5370,found 683.5373.

上述反應(yīng)流中涉及的中間化合物14，15和16的制備參見：Chem.Eur.J.,2014,20,12421–12425；Org.Biomol.Chem.,2011,9,6788–6796；J.Phys.Chem.B,2007,111,1384–1392。

實(shí)施例2、

將化合物1、2、3和4配置成不同濃度的水溶液，測(cè)定化合物1～4的水溶液的熒光強(qiáng)度；將熒光強(qiáng)度的最大值隨濃度(10^-9-10^-3M)的變化趨勢(shì)作圖，得到圖1A～圖1D，在圖1A～1D中，X軸為溶液濃度，Y軸為熒光強(qiáng)度。

圖1A～1D分別是化合物1～4對(duì)臨界膠束濃度測(cè)定圖和膠束形貌圖，從圖1A～1D可以看出化合物1～4的臨界膠束濃度均非常低，化合物1～4臨界膠束濃度分別為4.62×10^-6M、4.58×10^-6M、4.02×10^-6M和4.94×10^-6M。

取2μL濃度為5μM的混合物1～4水溶液，分別滴到200目的銅網(wǎng)上，自然干燥后，圖1E～1H透射電鏡觀察膠束形貌。

化合物1～4形成的膠束形貌為圓形，且分散性較好。

實(shí)施例3、

分別配制不同濃度化合物1～4的溶液，將不同濃度的化合物1～4的溶液和pUC18質(zhì)粒DNA(9μg/mL)置于37℃水浴中，作用1h，進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)得到不同濃度的化合物1～4對(duì)pUC18 DNA的凝膠阻滯結(jié)果。

圖2A～2D分別是本發(fā)明化合物1～4的pUC18 DNA的瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖2A～2D上標(biāo)注的數(shù)值為測(cè)試濃度(μM)；圖2A～2D表明化合物1～4均可在較低濃度下完全阻滯DNA在瓊脂糖中遷移；化合物1～4的最低阻滯濃度分別為：16μM、16μM、12μM和30μM。

由實(shí)施例2可以得出，本發(fā)明制備的基于四乙烯基的Gemini型兩親性化合物在水中具有良好的自組裝性，其可自組裝成膠束，實(shí)施例3表明其可以有效凝聚DNA形成納米顆粒，可以作為非病毒基因載體。

實(shí)施例4、

HepG2細(xì)胞對(duì)化合物1～4本身以及其所凝聚的DNA的納米顆粒的攝取實(shí)驗(yàn)

將濃度為20μM的化合物1～4與HepG2細(xì)胞作用30min，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共聚焦顯影得到相應(yīng)的細(xì)胞顯像圖；化合物1～4的細(xì)胞顯像圖分別為圖3A～3D；

將濃度為20μM的化合物1～3和濃度為30μM的化合物4，獨(dú)立與pUC18質(zhì)粒DNA (9μg/mL)形成的復(fù)合物，將形成的復(fù)合物與HepG2細(xì)胞一起培養(yǎng)30min，進(jìn)行共聚焦顯影得到相應(yīng)的共聚焦熒光圖；化合物1～4的共聚焦熒光圖分別為圖3E～3F；

由圖3A～圖3D和圖3E～3F表明，無(wú)論是化合物1～4本身或者化合物1～4與DNA的凝聚顆粒都可以被細(xì)胞有效攝?。?/p>

由圖3A～圖3D可以看出，化合物1～4本身形成的膠束所發(fā)生的特征性的聚集態(tài)熒光可以照亮細(xì)胞，是優(yōu)良的細(xì)胞顯像材料；

由圖3E～3F可以看出，化合物1～4與DNA凝聚顆粒的也可被細(xì)胞攝取，是優(yōu)良的非病毒基因載體材料；

另外化合物1～4以及其與DNA凝聚的顆粒被攝取后，膠束在細(xì)胞質(zhì)中均勻分散，而攝取的凝聚體不均勻的分布在細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核中的某一處。

實(shí)施例5、

配制濃度為30μM的化合物1～4，選用化合物1與其等當(dāng)量DOPE形成的脂質(zhì)體1/DOPE、化合物2與其等當(dāng)量DOPE形成的脂質(zhì)體2/DOPE、化合物3與其等當(dāng)量DOPE形成的脂質(zhì)體3/DOPE以及化合物4與其等當(dāng)量DOPE形成的脂質(zhì)體4/DOPE，分別與pEGFP(9μg/mL)，在37℃條件下作用30min，加入到HepG2細(xì)胞中培養(yǎng)4h，然后將HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)液換成新鮮的含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h；用1mL PBS將HepG2細(xì)胞洗滌五次后，將細(xì)胞置于共聚焦顯微鏡下進(jìn)行拍照(10倍放大)；

對(duì)裸露的pEGFP基因和pEGFP/DOPE形成復(fù)合物空白對(duì)照采用上述同樣的實(shí)驗(yàn)方法，作為空白對(duì)照組；

對(duì)商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000的綠色熒光蛋白表達(dá)圖采用上述同樣的實(shí)驗(yàn)方法，作為效果對(duì)照組；

圖4A為化合物1的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；圖4B為化合物2的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；圖4C為化合物3的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；圖4D為化合物4的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；圖4E為脂質(zhì)體1/DOPE的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；圖4F為脂質(zhì)體2/DOPE的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；圖4G為脂質(zhì)體3/DOPE的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；圖4H為脂質(zhì)體4/DOPE的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；圖4I為商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；圖4J為pEGFP的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；圖4K為pEGFP/DOPE形成的聚合物的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；圖4L為空白對(duì)照的綠色熒光蛋白表達(dá)圖；

圖4A～4H是本發(fā)明化合物1～4本身以及其與DOPE形成的脂質(zhì)體1/DOPE～4/DOPE 作為非病毒基因載體，在HepG2細(xì)胞中對(duì)pEGFP質(zhì)?；虻谋磉_(dá)熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖；

由圖4J～圖4K可以看出，pEGFP、pEGFP/DOPE和空白參照幾乎沒(méi)有觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)；

由圖4A～圖4H可以看出，化合物1～4本身和脂質(zhì)體1/DOPE～4/DOPE都觀察到了綠色熒光蛋白的表達(dá)；表明本發(fā)明公開的化合物本身以及它們形成的脂質(zhì)體不僅可以作為優(yōu)良的細(xì)胞顯像材料，而且可以作為非病毒基因載體；另外，分析結(jié)果可以看出，化合物1和2以及它們的脂質(zhì)體1/DOPE和2/DOPE的轉(zhuǎn)染效果比相應(yīng)的化合物3和4及3/DOPE和4/DOPE好。

實(shí)施例6

將不同濃度的化合物1～4(10～70μM)以及其與DOPE以不同摩爾比形成的脂質(zhì)體1/DOPE～4/DOPE與pGL-3質(zhì)粒DNA在37℃條件下，作用30min后，加入到HepG2、Hela、A549和HEK293T細(xì)胞中培養(yǎng)4h；然后將細(xì)胞的培養(yǎng)液換成新鮮的含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h；除去培養(yǎng)基后，加入20μL細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解細(xì)胞，再分別測(cè)定相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度和蛋白含量，最終以每毫克蛋白的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU/mg protein)和商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000的百分比(％of Lipo2000)表示化合物1、2、3和4對(duì)pGL-3的轉(zhuǎn)染效率。

圖5A～5F是本發(fā)明化合物1～4以及其與DOPE形成的脂質(zhì)體1/DOPE～4/DOPE作為非病毒基因載體，在不同濃度，不同化合物/DOPE比和不同細(xì)胞中的熒光素酶表達(dá)結(jié)果；以商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000為參照。

圖5A為不同濃度的化合物1～4在HepG2、Hela、A549和HEK293T中的熒光表達(dá)結(jié)果；

圖5A中X軸為表示不同的化合物，在整個(gè)圖5A中由左到右，五組條形柱組分別表示化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和Lipo2000；Y軸表示熒光素酶表達(dá)量；

在第一組條形柱組中，由左到右依次表示化合物1在濃度為10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM和70μM時(shí)的熒光素酶表達(dá)量；在第二組條形柱組中，由左到右依次表示化合物2在濃度為10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM和70μM時(shí)的熒光表達(dá)；在第三組條形柱組中，由左到右依次表示化合物3在濃度為10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM和70μM時(shí)的熒光素酶表達(dá)量；在第四組條形柱組中，由左到右依次表示化合物4在濃度為10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM和70 μM時(shí)的熒光素酶表達(dá)量；最后一個(gè)表示Lipo2000在和10μg/mL時(shí)的熒光素酶表達(dá)量；

圖5B～5E分別為化合物1～4與DOPE在不同配比下形成的脂質(zhì)體的熒光素酶表達(dá)結(jié)果；

圖5B～5E中的X軸表示化合物1～4的濃度，Y軸表示熒光素酶表達(dá)量；

圖5F表示化合物1～4以及化合物1～4與DOPE形成的脂質(zhì)體在HepG2、HeLa、A549和HEK293T中的熒光素酶表達(dá)結(jié)果；

圖5F中X軸為表示不同的化合物，在整個(gè)圖5F中由左到右，八組條形柱組分別表示化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物1與DOPE形成的脂質(zhì)體、化合物2與DOPE形成的脂質(zhì)體、化合物3與DOPE形成的脂質(zhì)體和化合物4與DOPE形成的脂質(zhì)體，分別在HepG2、HeLa、A549和HEK293T中的熒光素酶表達(dá)結(jié)果；Y軸表示熒光素酶表達(dá)量；

(1)結(jié)果表明在HepG2細(xì)胞中，化合物1～4的最佳轉(zhuǎn)染效率分別是Lipofectamine 2000的55％，60％，1.4％和4.9％。

(2)化合物1和2與DOPE形成脂質(zhì)體后可以有效的提高轉(zhuǎn)染性能；化合物1與DOPE的最佳比例為2/1，最佳濃度為30μM，轉(zhuǎn)染效率為L(zhǎng)ipofectamine 2000的98％；化合物2與DOPE的最佳比例為1/1，最佳濃度為30μM，Lipofectamine 2000的175％；化合物3和4與DOPE形成脂質(zhì)體后轉(zhuǎn)染效果仍然較差，不到Lipofectamine 2000的1％。

(3)在不同細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果也不一樣；化合物1～4本身以及他們形成的脂質(zhì)體，在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效果最好，其次是HeLa，接著是A549和HepG2細(xì)胞。

實(shí)施例7

將化合物2(20μM)與pUC18 DNA(9μg/mL)在37℃條件下作用30min后，加入到HepG2細(xì)胞中培養(yǎng)不同時(shí)間(0.5，2.0，4.0和24h)后，除去培養(yǎng)基，用1mL PBS將HepG2細(xì)胞洗滌五次后，用共聚焦顯微鏡拍照得到圖6A～6K結(jié)果。注：24h的結(jié)果是在培養(yǎng)4h后將培養(yǎng)液置換成新鮮的含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至24h得到的。

圖6A～6K是HepG2細(xì)胞對(duì)化合物2凝聚的pUC18 DNA的不同時(shí)間的細(xì)胞攝取結(jié)果圖。

圖6A～6D是BF(明場(chǎng))圖片在0.5h、2.0h、4.0h和24h時(shí)，化合物2凝聚的pUC18DNA的不同時(shí)間的細(xì)胞攝取結(jié)果圖；

圖6E～6H是DAPI(DAPI通道)圖片在0.5h、2.0h、4.0h和24h時(shí)，化合物2凝聚的pUC18 DNA的不同時(shí)間的細(xì)胞攝取結(jié)果圖；

圖6I～6L是Merged(表示BF和DAPI圖的合并圖)圖片在0.5h、2.0h、4.0h和24h時(shí)，化合物2凝聚的pUC18 DNA的不同時(shí)間的細(xì)胞攝取結(jié)果圖；

0.5，2.0和4.0h的CLSM都是化合物2凝聚pUC18 DNA后培養(yǎng)響應(yīng)的時(shí)間后觀察。24h的CLSM是培養(yǎng)4h后用0.5mL PBS洗滌10次后，在利用新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24h。

(1)0.5h:進(jìn)入細(xì)胞的凝聚體很少，細(xì)胞的熒光很弱。大多數(shù)凝聚顆?；径季奂诩?xì)胞膜周圍；

(2)2.0h：進(jìn)入細(xì)胞的凝聚體明顯增多，幾乎所有的細(xì)胞中都能明顯看到藍(lán)色熒光的凝聚顆粒；這些凝聚體大多數(shù)都停留在細(xì)胞質(zhì)中，有些聚集在細(xì)胞核附近，只有少數(shù)凝聚顆粒進(jìn)入細(xì)胞核；

(3)4.0h：進(jìn)入細(xì)胞的凝聚體進(jìn)一步增多，并且可以看出大多數(shù)凝聚體進(jìn)入了細(xì)胞核；

(4)24h：留在細(xì)胞質(zhì)中的藍(lán)色熒光均勻的分布在整個(gè)細(xì)胞中(主要在細(xì)胞質(zhì)，由于細(xì)胞核中的化合物數(shù)量很少，導(dǎo)致難以拍攝明顯的熒光)；這種變化主要是由于DNA與凝聚顆粒解離后，凝聚體回復(fù)至膠束狀態(tài)，因而藍(lán)色熒光在細(xì)胞中的分布特性發(fā)生明顯改變，由明顯的凝聚顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆蚍稚⒌哪z束。

因而，利用這種化合物本身以及與DNA分子之間的超分子組裝的改變可以有效的示蹤細(xì)胞攝取和釋放非標(biāo)記的DNA的過(guò)程，這也是第一次利用這種自組裝的改變而導(dǎo)致的形貌和分散特性用作分析非病毒基因作為DNA載體運(yùn)載DNA進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程。

實(shí)施例8、

圖7A～7X是HepG2細(xì)胞對(duì)化合物2凝聚的FAM-DNA的不同時(shí)間的細(xì)胞攝取結(jié)果圖；

圖7A、圖7E、圖7I、圖7M、圖7Q和圖7U分別表示DAPI(DAPI通道圖)中HepG2細(xì)胞對(duì)化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h細(xì)胞攝取結(jié)果圖；

圖7B、圖7F、圖7J、圖7N、圖7R和圖7V分別表示FITC(FITC通道圖)像中HepG2細(xì)胞對(duì)化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h細(xì)胞攝取結(jié)果圖；

圖7C、圖7G、圖7K、圖7O、圖7S和圖7W分別表示DAPI+FITC(表示DAPI圖和FITC圖的合并圖)中HepG2細(xì)胞對(duì)化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h細(xì)胞攝取結(jié)果圖；

圖7D、圖7H、圖7L、圖7P、圖7T和圖7X分別表示DAPI+FITC+BF圖像中HepG2細(xì)胞對(duì)化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h細(xì)胞攝取結(jié)果圖；

(1)0.5h:少量聚集在細(xì)胞膜周圍，還未進(jìn)入細(xì)胞；

(2)1.0h：聚集在細(xì)胞膜周圍的凝聚體增多，熒光變亮，并且可以看出有少數(shù)部分已近開始進(jìn)入細(xì)胞；

(3)2.0h:明顯有很多的凝聚體進(jìn)入了細(xì)胞，基本都分布在細(xì)胞質(zhì)中，少量在細(xì)胞核周圍；

(4)4.0h：進(jìn)入細(xì)胞的凝聚體有很多都聚集在細(xì)胞核周圍，并且有些聚集體已經(jīng)進(jìn)入了細(xì)胞核；

(5)6.0h:進(jìn)入細(xì)胞的凝聚體持續(xù)增多，分布在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)，并且有少部分FAM-DNA開始從凝聚體中解離，也有很多進(jìn)入了細(xì)胞核；

(6)24h：停留在細(xì)胞內(nèi)的熒光分散形態(tài)明顯發(fā)生變化，無(wú)論是藍(lán)色還是綠色，不再有明顯的凝聚顆粒，而是均勻的分散在細(xì)胞中，表明FAM-DAN基本與凝聚體解離。

以上結(jié)果表明化合物2可以凝聚FAM-DNA形成納米顆粒，并進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞后不會(huì)只是停留于細(xì)胞質(zhì)，而且還能夠進(jìn)入細(xì)胞核。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，進(jìn)入細(xì)胞的顆粒明顯增多，并且不均勻的分布在細(xì)胞中。在到達(dá)6h后，已有部分FAM-DNA開始于凝聚顆粒解離。24h后，F(xiàn)AM-DNA基本與凝聚體解離，從而使得TPE8C的藍(lán)色熒光以及FAM-DAN的綠色熒光均勻分布在整個(gè)細(xì)胞，表明化合物2載入DNA后，還可以在細(xì)胞中順利釋放DNA，這些都是作為優(yōu)良非病毒DNA載體的必要條件。

實(shí)施例9、

向10μM化合物1、2、3和4的溶液中滴加ctDNA并測(cè)試相應(yīng)的熒光光譜；將熒光最大值與ctDNA的含量作圖即可。

圖8是ctDNA對(duì)10μM化合物1、2、3和4的熒光滴定結(jié)果；其中，X軸為ctDNA的濃度，Y軸表示熒光強(qiáng)度；

結(jié)果表明化合物1～4對(duì)ctDNA都有熒光響應(yīng)，并且隨著ctDNA含量的增加，熒光強(qiáng) 度逐漸增大；當(dāng)加入10μg/mL的ctDNA后，化合物1、2、3和4熒光增強(qiáng)倍數(shù)分別為1.6，2.0，2.4和2.1倍，這化合物1～4對(duì)ctDNA的熒光響應(yīng)性能順序?yàn)?＞4＞2＞1。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。