本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一類含有1-甲基-2-硝基-5-亞甲基咪唑的4-苯胺基喹唑啉類衍生物及其在腫瘤治療領(lǐng)域的用途。

背景技術(shù)：

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一類在細(xì)胞信息傳遞中發(fā)揮重要作用的激酶。EGFR的過表達(dá)與包括非小細(xì)胞型肺癌、結(jié)腸癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來，以EGFR作為治療靶點(diǎn)，兩類藥物得到迅速發(fā)展，即單克隆抗體和小分子抑制劑。小分子抑制劑中，代表性的藥物為4-苯胺基喹唑啉衍生物，它們在腫瘤的治療中發(fā)揮了巨大的作用（W. Cheng, et al., Curr. Med. Chem., 2014, 21, 4374-4404；R. Roskoski, Pharmacol. Res., 2014, 79, 34-74）。

另外，實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展使其不可避免的產(chǎn)生了低氧環(huán)境，針對腫瘤低氧環(huán)境，大量的生物還原性藥物得到開發(fā)，2-硝基咪唑類衍生物便是其中的一種。在正常組織中，由于氧分充足，2-硝基咪唑可以穩(wěn)定的存在，而在腫瘤組織中，在低氧環(huán)境及還原酶的雙重作用下，2-硝基咪唑被還原活化，對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用（L. J. O’Connor, Org. Chem. Front., 2015, 2,1026-1029）。將2-硝基咪唑類似物引入到4-苯胺基喹唑啉類化合物中，得到的新分子在正常組織中以原藥形式存在，不具有生理活性。在腫瘤組織中，低氧環(huán)境使分子中的2-硝基咪唑基團(tuán)被還原活化，對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，同時(shí)，還原活化后的分子釋放出4-苯胺基喹唑啉類原藥，再次對腫瘤產(chǎn)生靶向抑制作用。因此，含有2-硝基咪唑的4-苯胺基喹唑啉類衍生物具有雙重抗腫瘤的作用（J.X. Duan, et al.，J. Med. Chem.，2008, 51, 2412–2420）。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種對腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制作用的喹唑啉類衍生物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述喹唑啉類衍生物在醫(yī)藥學(xué)中的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供的喹唑啉類衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽，具有如下結(jié)構(gòu)通式：

，

其中，R₁為或-(CH₂)_nR₆，n=2、3、4、5或6，R₆為嗎啉基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基或二甲胺基；

R₂為或氫；

R₃、R₄和R₅各自獨(dú)立地選自氫、氯、氟、溴、乙炔基或三氟甲基。

本發(fā)明所述的喹唑啉類衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽，可以選自下述化合物之一：

N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺；

N-(3-溴苯基)-7-甲氧基-6-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺；

N-(3-乙炔基苯基)-7-甲氧基-6-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺；

N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲氧基]-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]喹唑啉-4-胺；

N-(3-溴苯基)-7-甲氧基-6-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲氧基]-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]喹唑啉-4-胺；

N-(3-乙炔基苯基)-7-甲氧基-6-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲氧基]-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]喹唑啉-4-胺；

N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-6-(3-嗎啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺；

N-(3-溴苯基)-7-甲氧基-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-6-(3-嗎啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺；

N-(3-乙炔基苯基)-7-甲氧基-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-6-(3-嗎啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺。

上述的喹唑啉類衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。

上述的喹唑啉類衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù)防和治療肺癌藥物或結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明與現(xiàn)有的EGFR類小分子抑制劑相比，具有更強(qiáng)的靶向性以及雙重抗腫瘤作用。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。

實(shí)施例1：4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（1）

參照文獻(xiàn)方法（W. Cheng，et al.，Eur. J. Med. Chem.，2015，89，826-834）制得。具體如下：將1.0 g 4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉加入10 mL甲醇中，再加入濃氨水（25%）0.5 mL，室溫反應(yīng)3 h。處理：抽濾，濾餅用冷的甲醇淋洗，收集，干燥，得白色固體。收率：> 95%。熔點(diǎn)：> 250℃。ESI-MS m/z: 320 [M+H]⁺。

實(shí)施例2：4-(3-溴苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（2）

制備方法參照實(shí)施例1，其中，用4-(3-溴苯胺基)-6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉替代4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉，得白色固體。收率：> 95%。熔點(diǎn)：111 -113℃。ESI-MS m/z: 346 [M+H]⁺。

實(shí)施例3：4-(3-乙炔苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（3）

制備方法參照實(shí)施例1，其中，用4-(3-乙炔苯胺基)-6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉替代4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉，得白色固體，收率：93%。熔點(diǎn)：238 - 240℃。ESI-MS m/z: 292 [M+H]⁺。

實(shí)施例4：4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-(3-嗎啉基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉（4）

參照文獻(xiàn)方法（W. Cheng，et al.，Eur. J. Med. Chem.，2015，89，826-834）制得。具體為：將64mg（0.20mmol）4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（1）與50mg（0.24mmol）4-(3-溴丙基)嗎啉加入3mL二甲基甲酰胺（DMF）中，再加入14mg（0.10 mmol）K₂CO₃，反應(yīng)體系于70℃反應(yīng)12h。處理：減壓濃縮，濃縮物用飽和食鹽水和二氯甲烷（體積比1:1）萃取，收集有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，濃縮，柱色譜分離（V_二氯甲烷：V_甲醇= 100：3），得白色固體。收率：78%。熔點(diǎn)：193-195℃。ESI-MS m/z: 447 [M+H]⁺。

實(shí)施例5：4-(3-溴苯胺基)-6-(3-嗎啉基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉（5）

制備方法參照實(shí)施例4，其中，用4-(3-溴苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（2）替代4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（1），得白色固體，收率：81%。熔點(diǎn)：203 - 205℃。ESI-MS m/z: 475 [M+H]⁺。

實(shí)施例6：4-(3-乙炔基苯胺基)-6-(3-嗎啉基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉（6）

制備方法參照實(shí)施例4，其中，用4-(3-乙炔苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（3）替代4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（1），得白色固體，收率：84%。熔點(diǎn)：167 - 169℃。ESI-MS m/z: 419 [M+H]⁺。

實(shí)施例7：1-甲基-2-硝基-5-羥甲基咪唑（7）

參照文獻(xiàn)（L.J. O’Connor, Org. Chem. Front., 2015, 2, 1026-1029）制得。熔點(diǎn)：136-138℃。ESI-MS m/z: 158 [M+H]⁺。

實(shí)施例8：1-甲基-2-硝基-5-氯甲基咪唑（8）

參照文獻(xiàn)（L.J. O’Connor, Org. Chem. Front., 2015, 2, 1026-1029）制得。熔點(diǎn)：121-123℃。ESI-MS m/z: 176 [M+H]⁺。

實(shí)施例9：N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺（Ia）

將4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（1）（64mg，0.2mmol）、1-甲基-2-硝基-5-羥甲基咪唑（7）（32mg，0.2mmol）和三苯基磷（105mg，0.4mmol）溶于DMF（3mL）中，冰浴下加入N,N-二異丙基乙胺（DIEA，52mg，0.4mmol），待加入完畢，常溫反應(yīng)5h。處理：減壓去除DMF，殘余物用水和二氯甲烷（體積比1:1）萃取，收集有機(jī)相，柱色譜分離，得白色固體，收率59%，熔點(diǎn)：178-180℃。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.71 (s, 1H), 7.69 (dd, J = 6.5, 2.7 Hz, 1H), 7.47 – 7.35 (m, 1H), 7.28 (s, 2H), 7.09 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 6.61 (s, 1H), 5.40 (s, 2H), 4.75 (s, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.82 (s, 3H)。ESI-MS m/z: 459 [M+H]⁺。

實(shí)施例10：N-(3-溴苯基)-7-甲氧基-6-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺（Ib）

制備方法參照實(shí)施例9，其中，將4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（1）更換為4-(3-溴苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（2）。得白色固體，收率：62%，熔點(diǎn)：151-153℃。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.55 (s, 1H), 10.20 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.66 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.35 – 7.22 (m, 3H), 7.10 (s, 1H), 5.49 (s, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.90 (s, 3H)。ESI-MS m/z: 487 [M+H]⁺。

實(shí)施例11：N-(3-乙炔基苯基)-7-甲氧基-6-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺（Ic）

制備方法參照實(shí)施例9，其中，將4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（1）更換為4-(3-乙炔苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（3）。得白色固體，收率：53%，熔點(diǎn)：184-186℃。¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.55 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.84 (s, 2H), 7.39 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.23-7.18 (m, 2H), 5.27 (s, 2H), 4.20 (s, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.88 (s, 3H)。ESI-MS m/z: 431 [M+H]⁺。

實(shí)施例12：N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲氧基]-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]喹唑啉-4-胺（Id）

將4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（1）（64mg，0.2mmol）和1-甲基-2-硝基-5-氯甲基咪唑（8）（74mg，0.42mmol）溶于DMF（3mL）中，再加入碳酸鉀（28mg，0.2mmol），室溫反應(yīng)過夜（12h）。處理：減壓去除溶劑，殘余物用水和二氯甲烷（體積比1:1）萃取，收集有機(jī)相，柱色譜分離，得黃色固體，收率41%，熔點(diǎn)：79-81℃。¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.07 (s, 1H), 9.00 (s, 1H), 8.08 (dd, J = 6.8, 2.5 Hz, 1H), 7.82 (m, 1H), 7.59 (m, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.22 (s, 1H), 6.05 (s, 2H), 5.63 (s, 2H), 4.03 (s, 3H), 3.99 (s, 3H), 3.98 (s, 3H)。ESI-MS m/z: 598 [M+H]⁺。

實(shí)施例13：N-(3-溴苯基)-7-甲氧基-6-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲氧基]-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]喹唑啉-4-胺（Ie）

制備方法參照實(shí)施例12，其中，將4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（1）更換為4-(3-溴苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（2）。得黃色固體，收率：45%，熔點(diǎn)：64-66℃。¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.71 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.95-7.78 (m, 2H), 7.46 (s, 1H), 7.39-7.15 (m, 3H), 6.63 (s, 1H), 5.43 (s, 2H), 4.77 (s, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.85 (s, 3H)。ESI-MS m/z: 626 [M+H]⁺。

實(shí)施例14：N-(3-乙炔基苯基)-7-甲氧基-6-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲氧基]-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]喹唑啉-4-胺（If）

制備方法同實(shí)施例12，將4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（1）更換為4-(3-乙炔苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉（3）。得黃色固體，收率：47%，熔點(diǎn)：73-75℃。¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.72 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.44 – 7.36 (m, 2H), 7.34 – 7.29 (m, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.46 (s, 2H), 4.61 (s, 2H), 4.28 (s, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.81 (s, 3H)。ESI-MS m/z: 570 [M+H]⁺。

實(shí)施例15：N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-6-(3-嗎啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺（Ig）

將4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-(3-嗎啉基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉（4）（90mg，0.2mmol）和1-甲基-2-硝基-5-氯甲基咪唑（8）（74mg，0.42mmol）溶于DMF（3mL）中，再加入碳酸鉀（28mg，0.2mmol），室溫反應(yīng)過夜（12h）。處理：減壓去除溶劑，殘余物用水和二氯甲烷（體積比1:1）萃取，收集有機(jī)相，柱色譜分離，得黃色固體，收率31%，熔點(diǎn)：48-50℃。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.67 (s, 1H), 7.19 – 7.13 (m, 2H), 7.10 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.89 – 6.84 (m, 1H), 6.29 (s, 1H), 5.26 (s, 2H), 4.04 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.73 – 3.60 (m, 4H), 3.53 – 3.42 (m, 2H), 2.48 – 2.28 (m, 6H), 1.85 – 1.74 (m, 2H)。ESI-MS m/z: 586 [M+H]⁺。

實(shí)施例16：N-(3-溴苯基)-7-甲氧基-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-6-(3-嗎啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺（Ih）

制備方法參照實(shí)施例15，其中，將4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-(3-嗎啉基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉（4）更換為4-(3-溴苯胺基)-6-(3-嗎啉基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉（5）。得黃色固體，收率：29%，熔點(diǎn)：55-57℃。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.74 (s, 1H), 7.46 – 7.40 (m, 1H), 7.36 – 7.32 (m, 1H), 7.28 – 7.24 (m, 1H), 7.22 (s, 1H), 7.02 – 6.95 (m, 2H), 6.39 (s, 1H), 5.35 (s, 2H), 4.09 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 3.86 – 3.71 (m, 4H), 3.58 – 3.45 (m, 2H), 2.62 – 2.42 (m, 6H), 1.94 – 1.81 (m, 2H)。ESI-MS m/z: 614 [M+H]⁺。

實(shí)施例17：N-(3-乙炔基苯基)-7-甲氧基-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-6-(3-嗎啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺（Ii）

制備方法參照實(shí)施例15，其中，將4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-(3-嗎啉基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉（4）更換為4-(3-乙炔基苯胺基)-6-(3-嗎啉基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉（6）。得黃色固體，收率：27%，熔點(diǎn)：52-54℃。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.72 (s, 1H), 7.43-7.38 (m, 1H), 7.33 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.31-7.29 (m, 1H), 7.20 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 7.04-7.01 (m, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.37 (s, 1H), 5.35 (s, 2H), 4.73 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.80 -3.68 (m, 4H), 3.50-3.45 (m, 2H), 2.63-2.31 (m, 6H), 1.91-1.76 (m, 2H)。ESI-MS m/z: 558 [M+H]⁺。

應(yīng)用試驗(yàn)：所得化合物在常氧（20% O₂）和低氧（1% O₂）條件下對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和人肺癌細(xì)胞株H460的抑制率。

實(shí)驗(yàn)方法：

（1）細(xì)胞株：選用人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、人肺癌細(xì)胞株H460；

（2）將對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，吹打成單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板；H460細(xì)胞、HT-29細(xì)胞均5×10³細(xì)胞/孔。每孔加入含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基至總體積為200μL，分別放在20% O₂、1% O₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；

（3）待細(xì)胞貼壁后，加入50μM的受試化合物在常氧培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)72h；

（4）采用SRB法測定藥物對細(xì)胞增殖能力的百分抑制率；

（5）酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長：490 nm），并記錄結(jié)果。按下述公式計(jì)算抑制率：抑制率（%）=（OD對照－OD給藥）/ OD對照× 100%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1所示。從化合物在常氧和低氧條件下對HT-29細(xì)胞和H460細(xì)胞的抑制率可以看出，實(shí)施例9至17化合物在低氧條件下的抑制率明顯高于常氧，說明化合物在低氧條件下能被還原活化，發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤活性。

表1. 化合物（50μM）在低氧和常氧狀態(tài)下對HT-29和H460細(xì)胞的抑制率