本發(fā)明涉及藥物化學和藥物治療學領(lǐng)域，具體涉及單獨或組合用于治療和/或預(yù)防炎癥性和炎癥相關(guān)性疾病方面如自身免疫性疾病(風濕、類風濕性關(guān)節(jié)炎，強直性脊柱炎，紅斑狼瘡、克羅恩病、銀屑病、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、葡萄膜炎等)、感染性疾病(膿毒癥、敗血癥等)、神經(jīng)退行性疾病(多發(fā)性硬化、老年性癡呆、帕金森病等)、痛風、移植免疫排斥反應(yīng)及動脈粥樣硬化和腫瘤治療中的應(yīng)用。更具體涉及新的一系列下式所示的金剛烷磺酰胺類化合物及其制備方法和藥物學上可接受的鹽或藥物學上可接受的溶劑化物。
背景技術(shù)：
：炎癥反應(yīng)是機體對各種炎性刺激引起組織損害而產(chǎn)生的一種基本病理過程，也是機體對損傷或感染產(chǎn)生的一種重要的防御反應(yīng)，可幫助機體清除有害物質(zhì)，將損傷局限化，啟動愈合過程對組織進行修復(fù)，從而發(fā)揮保護作用。但過度和持久的炎癥反應(yīng)，使抗炎和促炎反應(yīng)失衡，反而加重組織細胞損傷，最終可引起器官功能障礙。炎癥反應(yīng)是一種常見和多發(fā)的病理過程，多種疾病均與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，如感染性疾病、自身免疫性疾病、痛風、神經(jīng)退行性疾病、動脈粥樣硬化、腫瘤等，尤其感染性疾病導(dǎo)致的膿毒血癥和自身免疫性疾病中的類風濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎等均為炎癥反應(yīng)的過度活化或持久存在。因此，抗炎藥物也是臨床治療中僅次于抗感染藥物的第二大類藥物。尤其在抗類風濕藥物市場，evaluatepharma公司報道抗風濕藥物按銷售額已排在第二大治療領(lǐng)域，全球收入在2013年即達到411億美元，且在未來5年仍將保持強勁增長。據(jù)估計，1986年全球非甾體抗炎藥處方量已達1億張，非處方用藥更為普遍，且有逐年增加趨勢，僅塞來昔布2013年銷售就達27億美元。而甾體類抗炎藥糖皮質(zhì)激素類在我國醫(yī)院門診處方使用率雖各家報道不一，但均在12％以上；有研究也報道某醫(yī)院2014年4月住院患者糖皮質(zhì)激素應(yīng)用病歷占該月總出院病歷數(shù)的21.8％。但這兩類藥物都有其相應(yīng)的各種不良反應(yīng)。甾體類抗炎藥對機體作用復(fù)雜，在產(chǎn)生強大抗炎作用的同時會造成機體防御功能的下降，誘發(fā)或加重感染，長期使用可引起人體物質(zhì)代謝和水鹽代謝紊亂、誘發(fā)加重消化性潰瘍、引起骨質(zhì)疏松等，甚至產(chǎn)生嚴重的并發(fā)癥。非甾體類抗炎藥亦有胃腸道損傷出血、肝腎功能損傷、心血管不良事件發(fā)生率增加等不良反應(yīng)。因此，尋找抗炎作用強、不良反應(yīng)小的抗炎新藥成為國內(nèi)外學者研究的熱點。近年推出的治療類風濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病的生物制劑如humira(阿達木單抗)、enbrel(依那西普)等已成為全球最暢銷藥物，在取得顯著臨床療效的同時，也獲得較大的利潤，如humira2015年銷售額達140億美元，但該類藥物價格昂貴(humira在美國賣1840美元/支(40mg)，國內(nèi)最高零售價為7900元/支，每2周注射1支)對醫(yī)保和患者均是較重的負擔。而近年輝瑞推出的首個治療類風濕關(guān)節(jié)炎的口服JAK抑制劑xeljanz(托法替尼)，在2015年的9個月中銷售即達3.51億美元，但該藥在價格上也依然昂貴，在美國的價格為3374美元/月(5mg/片，每日2次)。我們研究發(fā)現(xiàn)金剛烷磺酰胺類化合物可以用于炎癥反應(yīng)，作用機制可能涉及多個靶點，我們研究顯示金剛烷磺酰胺類化合物可顯著抑制培養(yǎng)的巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞增殖和產(chǎn)生炎癥因子；同時對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷有明顯保護作用使炎癥反應(yīng)減輕，損傷減輕；也使佛氏佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀和關(guān)節(jié)損傷減輕、大鼠棉球肉芽腫重量減輕、小鼠二甲苯致炎耳廓腫脹度減輕。而且，毒性試驗顯示在有效劑量40倍劑量時未見小鼠出現(xiàn)死亡和器官損傷。以上結(jié)果說明我們發(fā)現(xiàn)的金剛烷磺酰胺類化合物有顯著的抗炎作用，且毒性低。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是下式所示的金剛烷磺酰胺類化合物及其制備與抗炎作用、免疫抑制作用及在炎癥性和炎癥相關(guān)性疾病方面的治療應(yīng)用如自身免疫性疾病(風濕、類風濕性關(guān)節(jié)炎，強直性脊柱炎，紅斑狼瘡、克羅恩病、銀屑病、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、葡萄膜炎等)、感染性疾病(膿毒癥、敗血癥等)、神經(jīng)退行性疾病(多發(fā)性硬化、老年性癡呆、帕金森病等)、痛風、移植免疫排斥反應(yīng)及動脈粥樣硬化和腫瘤治療中的應(yīng)用。在上式結(jié)構(gòu)中，其中A可取代在金剛烷環(huán)的2、3、4位上，A可以為H，X(F、Cl、Br、I)，OH，OR，NH2，NHR，NR2，CHO，COR，COOH，COOR，CONH2，CONHR，CONR2，COOCOR等常用有機基團；B可以是H，R，Ar等常用有機基團；C可以是R，Ar等常用有機基團。進一步，A具體可以是OH，NH2，COR，COOH，CONH2等，B具體可以是(CH2)nCONH2，(CH2)nCONHR，(CH2)nCONR2等(n為1，2，3，4等)，C具體可以是Me，Et，n-Pr，i-Pr，n-Bu，i-Bu，s-Bu，t-Bu，Ph，Bn等。更進一步，A更具體是OH，NH2，COOH等，B更具體是CH2CONH2，CH2CONHR，CH2CONR2等，C更具體是Me，Et，Ph等。一個具體的金剛烷磺酰胺類化合物實例CQMUH-011可描述為，但并不是局限于該實例，其中A取代在金剛烷環(huán)的3位上，A是OH，B是C是關(guān)于金剛烷磺酰胺類化合物的制備方法，應(yīng)該是本專業(yè)技術(shù)人員所具有的專業(yè)知識能夠完成的。這里提出一個制備方法實例，但并不是局限于該實例。以鹽酸金剛烷胺為起始原料，用混酸及氫氧化鉀為試劑，對金剛烷胺環(huán)的3位進行羥基化，得到金剛烷氨醇；金剛烷氨醇再與鹵代B反應(yīng)，制備得到氨基B取代的金剛烷氨醇，然后繼續(xù)與對甲苯磺酰氯反應(yīng)，制備得到目標金剛烷磺酰胺類化合物。以及本專業(yè)技術(shù)人員所具有的專業(yè)知識能夠完成的其它相應(yīng)的可替代的制備方法。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)上述的金剛烷磺酰胺類化合物可以用于炎癥反應(yīng)，作用機制可能涉及多個靶點，本發(fā)明研究顯示金剛烷磺酰胺類化合物可顯著抑制培養(yǎng)的巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞增殖和產(chǎn)生炎癥因子；同時對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷有明顯保護作用使炎癥反應(yīng)減輕，損傷減輕；也使佛氏佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀和關(guān)節(jié)損傷減輕、大鼠棉球肉芽腫重量減輕、小鼠二甲苯致炎耳廓腫脹度減輕。而且，毒性試驗顯示在有效劑量40倍劑量時未見小鼠出現(xiàn)死亡和器官損傷。以上結(jié)果說明我們發(fā)現(xiàn)的金剛烷磺酰胺類化合物有顯著的抗炎作用，且毒性低。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的金剛烷磺酰胺類化合物具有抗炎作用、免疫抑制作用及在炎癥性和炎癥相關(guān)性疾病方面的治療用途如自身免疫性疾病(風濕、類風濕性關(guān)節(jié)炎，強直性脊柱炎，紅斑狼瘡、克羅恩病、銀屑病、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、葡萄膜炎等)、感染性疾病(膿毒癥、敗血癥等)、神經(jīng)退行性疾病(多發(fā)性硬化、老年性癡呆、帕金森病等)、痛風、移植免疫排斥反應(yīng)及動脈粥樣硬化和腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一目的，在于提供一種藥物及其組合物其特征在于，含有有效量的上述金剛烷磺酰胺類化合物，以及藥學上可接受的載體或賦形劑等制成的各種劑型及其組合物。附圖說明圖1是CQMUH-011對LPS刺激小膠質(zhì)細胞增殖的影響圖(CQMUH-011作用48h的IC50值為：1.305×10-8mol/L-1)圖2是不同濃度CQMUH-011對LPS刺激巨噬細胞RAW264.7增值的影響圖圖3是不同濃度CQMUH-011對LPS刺激巨噬細胞RAW264.7分泌TNF-α和IL-1β的影響圖圖4是CQMUH011對LPS致肺損傷肺組織病理變化的影響圖(HE染色，×200倍)(A：Normal組，B：LPS組，C：DXM+LPS組，D：CQMUH-011+LPS組)圖5是CQMUH-011對LPS致肺損傷小鼠肺的濕/干比重的影響圖圖6是CQMUH-011對LPS致肺損傷小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-6的影響圖圖7是CQMUH-011對LPS致肺損傷小鼠肺組織中MDA含量和MPO活力的影響圖圖8是CQMUH011對弗氏佐劑致關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理變化的影響圖(HE染色，×40倍)(A：Normal組；B：AAModel組；C：DXM+Model組；D：CQMUH-011+Model組)圖9是CQMUH-011對弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠足圍腫脹度的影響圖圖10是CQMUH-011對弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠足圍腫脹度的影響(14d)圖(A：Normal組；B：AAModel組；C：DXM+Model組；D：CQMUH-011+Model組)圖11是CQMUH-011對弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-6的影響圖圖12是CQMUH-011對弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血清中MDA含量和MPO活力的影響圖圖13是CQMUH-011對大鼠棉球肉芽腫干重的影響圖圖14是CQMUH-011對棉球肉芽腫大鼠血清中NO和MDA及MPO的影響圖圖15是CQMUH-011對二甲苯致小鼠耳腫脹度的影響圖具體實施方式通過下列的具體實施例可進一步理解本發(fā)明，但它們不構(gòu)成對本
發(fā)明內(nèi)容的限制。在本發(fā)明的上述前提下對本發(fā)明屬于本專業(yè)技術(shù)人員的專業(yè)知識可獲得的延伸擴展內(nèi)容應(yīng)該都在本發(fā)明要求保護的范圍中。實施例1金剛烷磺酰胺類化合物CQMUH-011的合成：38ml的98％濃硫酸與4ml的65％濃硝酸在冰浴下混合冷卻，向該混酸中分次加入3.75克鹽酸金剛烷胺，冰浴下攪拌反應(yīng)3小時；加入碎冰60克，攪拌0.5小時；再加入氫氧化鉀固體，調(diào)節(jié)pH至12-13，冰浴下攪拌反應(yīng)2小時；抽濾，濾液用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8-9，濃縮至干；加入80ml無水乙醇回流1小時，放冷，抽濾，濾液濃縮至干；再加入10ml混合液(丙酮∶乙酸乙酯＝3∶1)回流1小時，冰浴下放置，得3-氨基金剛烷醇固體3克，熔點大于256℃。將3克3-氨基金剛烷醇、0.25克碘化鉀、10克碳酸鉀加入到30ml四氫呋喃中攪拌升溫至40℃，保持該溫度下緩慢滴加3克N-氯乙?；?2-氰基四氫吡咯(即氯代B)溶解在30ml四氫呋喃的溶液，約1.5小時滴完。滴畢，保溫40℃反應(yīng)1小時后，升溫至回流反應(yīng)2小時?；亓鹘Y(jié)束，趁熱過濾，濾餅用少量四氫呋喃洗滌，合并濾液，濃縮至油狀物。油狀物加入適量丁酮溶解，放置析晶，過濾，干燥得氨基B取代的金剛烷氨醇固體4克，熔點147-149℃。HPLC歸一化法測定純度為98.1％，IR、NMR等結(jié)構(gòu)表征符合要求的結(jié)構(gòu)。在反應(yīng)瓶中加入1克上述氨基B取代的金剛烷氨醇、適量對甲苯磺酰氯、適量吡啶和20ml四氫呋喃，攪拌并且慢慢升溫至回流，反應(yīng)20小時。反應(yīng)完后，向反應(yīng)液中加入20ml5％的碳酸鈉溶液，再加入40ml乙酸乙酯，倒入分液漏斗中，收集有機層。水層再用50ml的乙酸乙酯分兩次萃取。合并有機層，飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，干燥完后旋蒸除去有機溶劑得白色固體粗品。用柱層析純化，再用丙酮重結(jié)晶得到金剛烷磺酰胺類化合物CQMUH-011固體，熔點192-195℃。HPLC歸一化法測定純度為95.1％，IR、NMR等結(jié)構(gòu)表征符合要求的結(jié)構(gòu)。實施例2金剛烷磺酰胺類化合物CQMUH-011的體外細胞實驗在培養(yǎng)的原代小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞RAW264.7中加入不同濃度的CQMUH-011，觀察LPS刺激后CQMUH-011對培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞增殖和炎癥因子產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示CQMUH-011對LPS刺激引起的小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞增殖、炎癥因子產(chǎn)生有明顯抑制作用(見圖1.圖2.圖3.表1)表1.CQMUH-011對小膠質(zhì)細胞TNF-α和IL-1β產(chǎn)生的影響TNF-α(pg/mL)IL-1β(pg/mL)空白組93.2±3.6129.5±4.1LPS組(10μg·ml-1)1154.32±40.8＊1271.8±36.1＊藥物組(1×10-6mol/L)450.2±21.8#346.2±21.8#(3×10-7mol/L)451.3±26.1#379.2±22.3#(1×10-7mol/L)478.3±30.8#406.3±33.2#(3×10-8mol/L)491.3±34.3#409.3±31.9#(1×10-8mol/L)512.7±34.1#412.3±31.1#實施例3金剛烷磺酰胺類化合物CQMUH-011的體內(nèi)抗炎實驗一、CQMUH-011對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺損傷的保護作用目的：評價CQMUH-011對膿毒癥的抑制作用。給藥方案與實驗步驟：取Balb/c雄性小鼠，稱重并編號。隨機分為正常組、脂多糖(LPS)組、地塞米松(DXM)+LPS組和CQMUH-011+LPS組，每組10只小鼠。LPS組小鼠腹腔注射LPS(20mg/kg)，正常組小鼠腹腔注射給予等劑量的生理鹽水，各組小鼠均于建模前2小時分別給予生理鹽水、生理鹽水、地塞米松溶液(1.5mg/kg)、新藥CQMUH-011溶液(457μg/kg)(所有溶液均含有4％1，2-丙二醇)。于建模后6小時各組選一半的小鼠摘眼球取血，分離血清(3000r，4℃，離心10min)，按試劑盒操作測TNF-α和IL-6值；剩下的小鼠12小時后摘眼球取血，并將其部分右肺切取下來用4％多聚甲醛固定，剩下的右肺進行肺濕干重檢測，部分左肺用冷生理鹽水勻漿用于丙二醛(MDA)和髓過氧化物酶(MPO)檢測，剩下的左肺保存于-80℃?zhèn)溆谩?.組織觀察：4％多聚甲醛固定的標本用石蠟包埋，切片，HE染色后光學顯微鏡下觀察其形態(tài)學改變。2.肺的W/D值測定：取小鼠剩下的右肺，用吸水紙輕輕吸干表面液體并用萬分之一天平稱重，記錄各樣本讀數(shù)。然后用錫箔紙包裹，于60℃干燥箱中干燥72h，取出再次稱重，并記錄。計算肺組織干濕重的變化比率作為評價肺水腫程度的指標。3.炎癥因子檢測：分離的血清用相應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA)進行TNF-α及IL-6水平測定。具體操作方法如下：(1)從冰箱中取出試劑盒，室溫平衡20min后從鋁箔袋中取出所需板條，其余放回自封袋4℃保存。(2)向標準品孔中加入不同濃度標準品50μL；樣品孔中加入樣品10μL及樣品稀釋液40μL。(3)標準品孔及樣品孔加入HRP標記的抗體100μL，封住反應(yīng)孔，37℃孵育60min。(4)棄去液體，洗板5次。(5)加入底物A和B各50μL，37℃避光孵育15min。(6)加入終止液50μL，15min內(nèi)于450nm波長測定各孔OD值。由OD值和標準曲線可以得到相應(yīng)炎癥因子濃度。4.MDA含量測定：將10％組織勻漿離心取上清液，然后參照相應(yīng)的檢測試劑盒說明書操作進行測定，最后根據(jù)試劑盒計算方法算出。具體操作如下：(1)肺組織勻漿液蛋白含量測定，按照說明書操作，步驟如下：將該上清液用生理鹽水按1∶9稀釋成1％組織勻漿，待測。表2肺組織蛋白測定操作流程肺組織勻漿上清液蛋白含量的計算公式：蛋白質(zhì)含量(μg/ml)＝(測定管OD值-空白管OD值)×標準品濃度(563μg/ml)×樣本測試前稀釋倍數(shù)/(標準管OD值-空白管OD值)(2)肺組織勻漿液中MDA含量的檢測，按照MDA檢測試劑盒說明書進行操作，步驟如下：工作液I的配置：試劑一∶試劑二應(yīng)用液∶試劑三應(yīng)用液＝a∶3∶1，按需配制，配好后當天使用。工作液I的配置：試劑一∶試劑二應(yīng)用液∶試劑三應(yīng)用液＝a∶3∶1，按需配制，配好后當天使用。表3.肺組織MDA測定操作流程空白管標準管測定管對照管10nmol/ml標準品(ml)a無水乙醇(ml)a測定樣品(ml)aa工作液I(ml)4.0ml4.0ml4.0ml工作液II(ml)4.0ml漩渦混勻器混勻，95℃水浴40分鐘，取出后流水冷卻，3500-4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清液，532nm處，測各管吸光度值。肺組織勻漿上清液MDA含量計算公式：MDA含量(nmol/mgprot)＝(測定管OD值-對照管OD值)/(標準管OD值-標準空白管OD值)×標準品濃度(10nmol/ml)/樣本蛋白含量(mgprot/ml)5.MPO活性檢測：取未離心的10％肺組織勻漿液，按1∶1的比例加入試劑二，混勻后得到5％的肺組織勻漿。將5％的肺組織勻漿液與三號試劑按9∶1比例充分混勻，37℃水浴中水浴15min，取出后按說明書操作，步驟如下：表4.肺組織MPO測定操作流程MPO活力(U/g組織)＝(測定管OD值-對照管OD值)/11.3×取樣量(g)實驗結(jié)果：CQMUH-011能明顯減輕LPS所致的小鼠肺損傷，降低肺濕/干比重，使小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-6，小鼠肺組織中MDA含量和MPO活力均降低(見圖4，圖5，圖6，圖7)，新藥CQMUH-O11對LPS所致(膿毒癥)小鼠的急性肺損傷具有一定的保護作用。二、CQMUH-011對弗氏完全佐劑所致大鼠關(guān)節(jié)炎的保護作用目的：評價CQMUH-011對免疫性炎癥的保護作用。給藥方案與實驗方法：選用體重180±20g雄性SD大鼠，隨機分組，分別為正常組、AA模型組、地塞米松+AA組及CQMUH-011(300μg/kg)+AA組，除正常組外，其他各組大鼠右后足跖皮內(nèi)注射0.1mlFCA致炎。于致炎前2小時，每組給予相應(yīng)藥物，即正常組和AA模型組給予生理鹽水，地塞米松+AA組給予地塞米松溶液，CQMUH-011+AA組給予CQMUH-011溶液(所有溶液均含有4％1，2-丙二醇)。致炎后18小時，測量各組大鼠右后足腫脹度及體重變化；致炎一周后開始給藥，連續(xù)7天，觀察各組大鼠右后足腫脹度及體重變化；致炎21天后再次給藥，連續(xù)7天，觀察各組大鼠右后足腫脹度及體重變化。致炎28天后，大鼠行摘眼球手術(shù)取血獲取血清進行炎癥因子檢測并取下其右后足踝關(guān)節(jié)于10％多聚甲醛中固定。1.踝關(guān)節(jié)病理切片觀察：10％多聚甲醛固定的標本用8％硝酸脫鈣后，經(jīng)石蠟包埋，切片，HE染色后光學顯微鏡下觀察其形態(tài)學改變。2.大鼠右后足腫脹度測定：于致炎前、致炎后18h、7d、14d、21d及28d用皮尺測量每只大鼠右后足同一部位的圍度。3.大鼠血清中TNF-α和IL-6測定：分別用相應(yīng)ELISA試劑盒檢測，具體操作步驟如下(1)準備工作：將試劑盒放置室溫，多余酶標條放回冰箱。標準品溶液制備：每瓶標準品加入標準品稀釋液1mL，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒以助溶解，其濃度為200pg/mL(貯液)。先將其稀釋為100pg/mL(標準曲線最高濃度)后，再準備7個稀釋標準品的EP管，每個EP管中加入500μL的標準品稀釋液，依次倍比稀釋成100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL、3.12pg/mL、1.56pg/mL，標準品稀釋液(0pg/mL)作為空白孔。備用。(2)樣本檢測：1)加樣：分別設(shè)標準孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標準孔7孔，依次加入100μl不同濃度的標準品(如上所示)?？瞻卓准?00μL標準品稀釋液，余孔加待測樣品100μL，酶標板加上覆膜，37℃溫育2小時。2)棄去液體，甩干，不用洗滌。3)每孔加檢測溶液A工作液100μL(臨用前配制)，酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時。4)棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，甩干酶標板內(nèi)的液體，墊上吸水紙用力拍打幾下，重復(fù)洗滌3次。最后一次洗滌后要將孔內(nèi)液體完全甩干。5)每孔加檢測溶液B工作液100μL(臨用前配制)，酶標板加上覆膜，37℃溫育30分鐘。6)棄去液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。7)每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色(反應(yīng)時間15-25分鐘)。8)每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度。由OD值和標準曲線可以得到相應(yīng)炎癥因子濃度。4.大鼠血清中MDA含量測定：根據(jù)該試劑盒步驟操作，具體操作同第一部分。5.大鼠血清中MPO活力測定：根據(jù)該試劑盒步驟操作，具體操作如下取大鼠血清按1∶1的比例加入試劑二，充分混勻?；靹蚝笕芤号c三號試劑按9∶1比例加入并充分混勻，37℃水浴中水浴15min，取出后按說明書操作，步驟如下：表5.大鼠血清中MPO活力測定操作步驟MPO活力(U/L)＝(測定管OD值-對照管OD值)/11.3×取樣量(L)實驗結(jié)果：CQMUH-011對弗氏佐劑所致大鼠關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)病理損傷有保護作用，降低關(guān)節(jié)炎大鼠足圍腫脹度、血清中炎癥因子(TNF-α和IL-6)和MDA水平及MPO活性(見圖8，圖9，圖10，圖11)，新藥CQMUH-011對免疫性關(guān)節(jié)炎具有抑制(治療)作用。三、CQMUH-011對大鼠棉球肉芽腫的抑制作用目的：評價CQMUH-011對亞急性炎癥的抑制作用給藥方案及實驗方法：選用體重150±10g雄性SD大鼠，稱重并編號，隨機分組，分別為正常組、模型組、地塞米松組及CQMUH-011(300μg/kg)組。除正常組外，其他各組大鼠在麻醉狀態(tài)下，在其左、右蹊部各剪一小口，以血管鉗擴充皮下組織，每側(cè)埋入一滅菌棉球(重量10±1mg)，而后縫合。于術(shù)前2小時給藥，即正常組和模型組給予生理鹽水，地塞米松組給予地塞米松溶液，CQMUH-011組給予該新藥溶液(所有藥品均含有4％1，2-丙二醇)；之后每天給藥一次，連續(xù)7天，第8天處死動物，獲取全血，分離血清(3000r，4℃，離心10min)，并取出棉球，剔盡脂肪組織，待用。1.大鼠棉球肉芽腫重量測定：將取得的棉球用錫箔紙包裹，于60℃烘箱箱中干燥48h，取出干棉球稱重，減去棉球本身重量，即為肉芽腫重量，并以mg/100g體重表示。2.大鼠血清中NO測定：根據(jù)該試劑盒步驟操作，具體操作如下(1)取出試劑盒，使GriessReagentI和GriessReagentII恢復(fù)至室溫。(2)不同濃度標準品制備：用生理鹽水將標準品稀釋成9個濃度，分別為0、1、2、5、10、20、40、60、100μM。(3)按50μl/孔，在96孔板中加入標準品及待測樣品。(4)按50μl/孔，在各孔中加入室溫GriessReagentI。(5)按50μl/孔，在各孔中加入室溫GriessReagentII。(6)540nm波長測定吸光度。由吸光度和標準曲線可以得到NO濃度。3.大鼠血清中MDA含量測定：根據(jù)該試劑盒步驟操作，具體操作同第一部分。4.大鼠血清中MPO活力測定：根據(jù)該試劑盒步驟操作，具體操作同第二部分。實驗結(jié)果：CQMUH-011可明顯降低大鼠棉球肉芽腫干重，降低肉芽腫大鼠血清中NO和MDA水平及MPO的活性(見圖12，圖13)，新藥CQMUH-011對亞急性炎癥具有一定的抑制作用。四、CQMUH-011對小鼠耳二甲苯致炎的保護作用目的：評價CQMUH-011對急性炎癥的抑制作用給藥方案及實驗方法：取體重25g左右雄性小鼠，隨機分組，分別為正常組、模型組、地塞米松組及CQMUH-011(457μg/kg)組，每組10只，除正常組外，其他各組均滴二甲苯0.03～0.05ml于鼠右耳，左耳不作處理。于致炎前2小時每組分別給予相應(yīng)藥物，即正常組和模型組給予生理鹽水，地塞米松組給予地塞米松溶液，CQMUH-011組給予該新藥溶液。致炎2小時后，將小鼠處死，沿耳廊基線剪下兩耳，用直徑5mm的打孔器分別在左、右耳同一部位打下圓形耳片，稱重，求左、右耳片重量之差，作為腫脹度。實驗結(jié)果：CQMUH-011可明顯降低二甲苯所致的小鼠耳腫脹，使耳腫脹度降低(見圖14)。新藥CQMUH-011對急性炎癥具有一定的抑制作用。五、急性毒性實驗給予小鼠治療劑量(小鼠457μg/kg)的10倍(4570μg/kg)、20倍(9142μg/kg)、40倍劑量(18284μg/kg)的CQMUH-011腹腔注射，觀察2周，僅用藥40倍的小鼠在用藥后2小時內(nèi)出現(xiàn)嗜睡，后恢復(fù)正常。全部小鼠2周內(nèi)無死亡，精神活動正常，病理解剖各器官無異常。當前第1頁1 2 3