本發(fā)明屬于養(yǎng)殖業(yè)環(huán)境資源利用領(lǐng)域，涉及一種酶菌聯(lián)合降解羽毛的方法。

背景技術(shù)：

近年來，全國每年的家禽屠宰量已經(jīng)突破了100億只，年產(chǎn)廢棄物達(dá)400萬噸。其中，有近100萬噸的羽毛被當(dāng)作廢棄物處理，羽毛資源沒有得到充分應(yīng)用。隨著家禽養(yǎng)殖業(yè)飛速發(fā)展，飼料蛋白資源開始出現(xiàn)嚴(yán)重的短缺，進(jìn)口大豆、魚粉等蛋白來源的成本不斷攀升，加大了養(yǎng)殖企業(yè)的生產(chǎn)負(fù)擔(dān)。因此，尋找一種新的資源無害化飼料蛋白來源成為重中之重。

羽毛中蛋白含量較高，富含多種氨基酸，如亮氨酸、纈氨酸和賴氨酸等多種必須氨基酸，還含有鈣、磷等微量元素及生長因子。（張大雷等，2003）因此，羽毛在作為動物飼料蛋白和氨基酸來源方面具有極大的應(yīng)用潛力。隨著對角蛋白的研究越發(fā)深入，角蛋白的加工利用狀況有所進(jìn)展。

目前已有的雞毛處理方法有三大類：（1）物理加工：加壓、加熱膨脹法；（2）化學(xué)水解：酸堿處理、氧化處理、電化學(xué)還原處理、銅氨溶液處理及金屬鹽處理；（3）生物降解：角蛋白酶降解角蛋白。（胡新華，1997）。目前，大規(guī)模加工羽毛角蛋白的方法主要是化學(xué)水解法、高溫加熱法和高溫膨化法。高溫膨化工藝操作相對簡單，產(chǎn)品適用范圍廣，但仍然存在耗能大、成本高等缺點，實際應(yīng)用不多。（郭素華，1991）而生物降解法是利用微生物發(fā)酵或添加蛋白酶酶解，能耗、污染相對較少，微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶系能夠促進(jìn)羽毛角蛋白分解為更多的小肽和游離氨基酸，并且減少了熱敏性氨基酸的損失。(汪國和等，2010)

使用微生物發(fā)酵雞毛的方法可以改變角蛋白的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)雞毛角蛋白的降解。另外微生物發(fā)酵產(chǎn)品中富含對動物機體有益的微生物本身就是對蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的補充。目前利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)角蛋白飼料主要有厭氧固體發(fā)酵和液體深層發(fā)酵，但是不管使用哪種方法，單一的菌株是不能完全降解雞毛。(汪國和等，2010)因而用單一的菌株處理羽毛廢棄物是達(dá)不到廢棄雞毛最大化利用。

角蛋白酶是一種可專一降解角蛋白的蛋白酶類。角蛋白酶的底物范圍一般比較廣泛，除角蛋白外，它還可水解多種可溶性和不溶性蛋白質(zhì)底物。（Tsuboi R, et al.1989）(Ray TL, et al.1990）。由于角蛋白酶在溶解狀態(tài)下可發(fā)生自身水解，這一特點使得角蛋白酶的酶活下降，因此單一使用角蛋白酶處理羽毛效果不理想，且成本較高，不適宜用來大規(guī)模降解和處理羽毛及其他類似養(yǎng)殖廢棄物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種酶菌聯(lián)合降解羽毛的方法。

本發(fā)明綜合蠟樣芽孢桿菌YSQ08（Bacillus cereus）發(fā)酵過程和角蛋白酶酶解過程的優(yōu)缺點，提出酶菌聯(lián)合降解雞毛，以實現(xiàn)雞毛的無害化、資源化、合理化應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種酶菌聯(lián)合降解羽毛的方法，所述方法步驟如下：

S1. 配置發(fā)酵緩沖液，將羽毛加入到發(fā)酵緩沖液，得到含羽毛的發(fā)酵緩沖液；

S2. 將菌種活化培養(yǎng)，得到活化后的菌液；

S3.將S2中活化后的菌液加入到S1中含羽毛的發(fā)酵緩沖液中進(jìn)行一次發(fā)酵；

S4.待S3中發(fā)酵反應(yīng)16~48h后，加入角蛋白酶進(jìn)行二次發(fā)酵培養(yǎng)24~56h；

S5.將S4中二次發(fā)酵后的液體離心后，取上清液得發(fā)酵液；

S1中，羽毛質(zhì)量占發(fā)酵緩沖液質(zhì)量的1~10%，所述發(fā)酵緩沖液的pH值為6~10；

S2中，菌種為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus ）YSQ08，于2012 年09 月03 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號為CCTCC No. M2012322；

S3中，將S2中活化后的菌液按2~6%的加入量加入含羽毛的發(fā)酵緩沖液；

S4中，以S3中一次發(fā)酵后物質(zhì)量計，角蛋白酶的添加量為1000~5000U/g；所述角蛋白酶的酶活為10⁵~10⁶U/g。

優(yōu)選地，S3中，將S2中活化后的菌液按3%加入含羽毛的發(fā)酵緩沖液；S4中，以S3中一次發(fā)酵后物質(zhì)量計，角蛋白酶的添加量為2000U/g，S1中，羽毛質(zhì)量占發(fā)酵緩沖液質(zhì)量的2.5%。

優(yōu)選地，S4中，待S3中發(fā)酵反應(yīng)24h后，加入角蛋白酶進(jìn)行二次發(fā)酵培養(yǎng)48h。

優(yōu)選地，所述羽毛為雞毛，發(fā)酵緩沖液的pH值為9。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵緩沖液組成為：0.1~1.0g/L氯化鈉，0.01~1.0g/L氯化鈣，0.1 ~1.0g /L氯化鎂，1.0~5.0g/L磷酸氫二鉀，0.1~2.0g/L磷酸二氫鉀。

優(yōu)選地，S3和S4中發(fā)酵溫度為36~42℃。

更優(yōu)選地，S3和S4中發(fā)酵溫度為40℃。

優(yōu)選地，S2中，菌種活化培養(yǎng)步驟如下：

S21.采用平板劃線培養(yǎng)的方法，將蠟樣芽孢桿菌YSQ08（Bacillus cereus）進(jìn)行活化，挑取單菌落，置于LB肉湯培養(yǎng)基中，搖床37℃，200r/min培養(yǎng)24h；

S22.將S21中所得液體以2%的菌液加入量加入到S1中含羽毛的發(fā)酵緩沖液中，72h后，劃線倒置培養(yǎng)14h，挑取單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，搖床37℃，200r/min培養(yǎng)14h；

S23. 將S22中誘導(dǎo)好的液體以2%的添加量加入到LB肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行擴大培養(yǎng)3~5次。

優(yōu)選地，LB肉湯培養(yǎng)基的制備為：將胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g混合，加蒸餾水定容至1000mL，pH為7.0，121℃高壓滅菌20min。

優(yōu)選地，S21中，所述蠟樣芽孢桿菌YSQ08菌株的種齡為8~20h。

根據(jù)本發(fā)明提供的方法，蠟樣芽孢桿菌YSQ08（Bacillus cereus）在24h~72h內(nèi)將雞毛降解成短肽或絮狀物，雞毛的梗部也能得到部分降解。加入角蛋白酶后，這些短肽、絮狀物、部分降解的梗部得到充分地酶解，72h內(nèi)能將雞毛得到徹底降解。游離氨基酸含量約為150~230mg/L，降解率約為70.00~82.00%，相較于單獨的酶解氨基酸含量提高了16.20~69.07%，降解率提高了14.54~30.80%；較于單獨的菌解，氨基酸含量提高了400.65~628.42%，降解率提高了128.23~160.64%。相比其他的雞毛微生物發(fā)酵方案，雞毛徹底降解的時間提高48h以上。采用酶菌聯(lián)合降解的方式，雞毛中的蛋白質(zhì)和氨基酸得到充分保留。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：

本發(fā)明綜合蠟樣芽孢桿菌YSQ08（Bacillus cereus）發(fā)酵過程和角蛋白酶酶解過程的優(yōu)缺點，能夠充分利用廢棄物羽毛，且獲得良好的飼料添加劑來源，所述方法操作簡單，實現(xiàn)了羽毛的無害化、資源化及合理化應(yīng)用，在養(yǎng)殖業(yè)廢棄物利用和飼料添加劑領(lǐng)域具備廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為菌株種齡對降解率的影響對比圖。

圖2為蠟樣芽孢桿菌YSQ08的生長曲線圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例和附圖來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。

以下實施例中采用的LB肉湯培養(yǎng)基制備為：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g混合，加蒸餾水定容至1000mL，pH7.0，121℃高壓滅菌20min。

發(fā)酵緩沖液的制備：0.5000 g 氯化鈉，0.0600 g 無水氯化鈣，0.1000 g 氯化鎂，1.4 000g 磷酸氫二鉀，0.7000 g 磷酸二氫鉀，pH調(diào)至7.0，蒸餾水定容至1000mL。

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus ）YSQ08，于2012 年09 月03 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號為CCTCC No. M2012322。

實施例1：

（1）采用平板劃線培養(yǎng)的方法，將蠟樣芽孢桿菌YSQ08（Bacillus cereus）進(jìn)行活化，挑取單菌落，置于LB肉湯培養(yǎng)基中，搖床37℃，200r/min培養(yǎng)24h。培養(yǎng)好后的液體菌液測定吸光度，挑選OD600值最高的一瓶作下一次活化，如此反復(fù)多次。菌株生長曲線如下圖2：

采用誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法，將活化好的菌液以2%加入到含羽毛的發(fā)酵液中.72h后，劃線倒置培養(yǎng)14h，挑取單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，搖床37℃，200r/min培養(yǎng)14h。

將誘導(dǎo)好的蠟樣芽孢桿菌YSQ08（Bacillus cereus）以添加量為2%加入到LB肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行擴大培養(yǎng)3次,，得到活化后的菌液。

針對實施例1中菌株種齡對降解率的影響見圖1。

（2）在雞毛質(zhì)量含量為2.5%的pH為9的發(fā)酵緩沖液中加入（1）中誘導(dǎo)培養(yǎng)好的3%的活化后的菌液?；罨蟮木禾砑訒r間為震蕩后的0.5h，在活化后的菌液發(fā)酵后24h后加入角蛋白酶，添加量為2000U/g，所述角蛋白酶的酶活為10⁵~10⁶U/g。保持發(fā)酵溫度為40℃，發(fā)酵時間為72h（在發(fā)酵后24h后加入膠蛋白酶，再發(fā)酵48h）。

（3）將錐形瓶中的液體均勻傾倒于兩個100mL離心管中，配平后對置于離心機中，3000r離心10min。留取上層清液，用少量的蒸餾水清洗濾渣，再一次配平3000r離心10min。兩次離心得到的上層清液即發(fā)酵液。

實施例2：制備過程同實施例1，不同的是（2）中，在雞毛質(zhì)量含量為2.5%的pH為9的發(fā)酵緩沖液中加入（1）中誘導(dǎo)培養(yǎng)好的2%活化后的菌液。

實施例3：制備過程同實施例1，不同的是（2）中，在雞毛質(zhì)量含量為2.5%的pH為9的發(fā)酵緩沖液中加入（1）中誘導(dǎo)培養(yǎng)好的6%活化后的菌液。

實施例4：制備過程同實施例1，不同的是（2）中，角蛋白酶添加時間為15h。

實施例5：制備過程同實施例1，不同的是（2）中，角蛋白酶添加時間為30h。

實施例6：制備過程同實施例1，不同的是角蛋白酶添加時間為24h，酶活為5000U/g。

對比例1：制備方法和過程同實施例1，不同的是，步驟（2）中在雞毛質(zhì)量含量為2.5%的pH為9的發(fā)酵緩沖液中先角蛋白酶，然后再加入（1）中誘導(dǎo)培養(yǎng)好的3%的活化后的菌液。角蛋白酶添加時間為震蕩后的0.5h，活化后的菌液添加時間為24h，添加量為2000U/g。

對比例2：制備方法和過程同實施例1，不同的是，活化后的菌液添加時間為震蕩后的0.5h，并在加入活化后的菌液同時加入角蛋白酶。

對比例3：制備方法和過程同實施例1，不同的是，不經(jīng)過（1）中菌株降解處理。

對比例4：制備方法和過程同實施例1，不同的是，不經(jīng)過（2）中加入角蛋白酶處理。

數(shù)據(jù)驗證：

氨基酸含量的計算如下：

將實施例和對比例中兩次離心得到的濾液置250mL容量瓶中，充分混勻后，量取20mL到250mL燒杯中，加入60mL蒸餾水，開動磁力攪拌器1min。用0.05mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到8.20。加入含量為37%~40%甲醛溶液10mL，用0.05mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到9.20，記錄0.05mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量為V₁。加入80mL蒸餾水于250mL燒杯中，重復(fù)上述操作，記錄0.05mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量為V₀。溶液中氨基酸含量，單位g/100ml=10⁴mg/L。

降解率的計算如下：

m₁為初始羽毛質(zhì)量，取得發(fā)酵液后，加入少量的蒸餾水于離心管中，震蕩均勻。將濾渣倒入質(zhì)量為m₀的濾紙上，使用抽濾裝置過濾，將濾渣放入到105℃的烘箱2h，然后濾入到干燥器中，待溫度冷卻后，稱其質(zhì)量為m₂。降解率。

將實施例和對比例的氨基酸含量和降解率進(jìn)行測試，數(shù)據(jù)列表詳見表1：

表1：

從表1中可以看出，對比例1先加角蛋白酶后加蠟樣芽孢桿菌YSQ08活化后的菌液處理羽毛、對比例2中角蛋白酶蠟樣芽孢桿菌YSQ08活化后的菌液同時加入處理羽毛、實施例1中先加蠟樣芽孢桿菌YSQ08后加角蛋白酶處理羽毛，三種方式對比發(fā)現(xiàn)，實施例1的處理效果更優(yōu)。原因可能是先加入角蛋白酶時，酶處理羽毛時間過長，受外界因素影響變大，影響了角蛋白酶酶活；同時蠟樣芽孢桿菌YSQ08處理羽毛的時間變短，也影響氨基酸態(tài)氮含量。而同時酶菌方案中，沒有較好的發(fā)揮出蠟樣芽孢桿菌YSQ08的活化作用，因此選擇先加入蠟樣芽孢桿菌YSQ08活化后的菌液然后再加入角蛋白酶處理羽毛的方式更好。

經(jīng)過對比例4中處理發(fā)現(xiàn)，單純的菌解其獲得的氨基酸含量和降解率較低，推測與角蛋白酶相比，單純的蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus ）YSQ08產(chǎn)角蛋白酶和酶活較低。

同時，實施例1、4和5之間的對比發(fā)現(xiàn)，恰當(dāng)?shù)慕堑鞍酌讣尤霑r間，對于氨基酸含量和降解率影響較大， 實施例1~3對比發(fā)現(xiàn)，恰當(dāng)?shù)幕罨簼舛炔拍塬@得較好的同角蛋白酶處理效果，而實施例6可以看出，角蛋白酶的酶活并非越高越好，綜上，只有在恰當(dāng)?shù)幕罨蟮木簼舛?、角蛋白酶加入量、角蛋白酶酶活性和角蛋白酶加入時間的組合才能獲得本發(fā)明最優(yōu)的效果。