本發(fā)明涉及體外核酸檢測
技術領域:
,尤其涉及一種定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒。
背景技術:
:細胞色素P4502D6(CytochromeP4502D6,CYP2D6)是CYP酶系中一種非常重要的藥物代謝酶。在CYP450超家族中,CYP2是最大的家族,在人類又可分成5個亞家族,編號為A~E。CYP2D位于第22號染色體上,由CYP2D6、CYP2D7P和CYP2D8P共同組成,其中CYP2D7P和CYP2D8P是假基因,不表達。CYP2D6作為一個完整的功能基因,包含9個外顯子和8個內(nèi)含子,總長7kb左右。CYP2D6是最早發(fā)現(xiàn)的具有基因多態(tài)性的P450酶,目前,已發(fā)現(xiàn)CYP2D6有70多種突變基因,其中,超過15個譯成密碼后是無活性或非酶,另外一些分別譯成活性減少、“正?!被蚧钚栽鰪姷拿?。CYP2D6基因的主要突變方式是單個堿基的缺失或替換引起讀碼框架移位,或是大片段基因的丟失。CYP2D6酶主要分布于人體肝臟中,占肝臟酶總量的2%~9%,但卻參與20%~30%臨床常用藥物的代謝,包括抗抑郁藥、抗心律失常藥、抗精神病藥、抗腫瘤藥物等。CYP2D6的基因突變類型較多,其中CYP2D6*2、*3、*4、*5、*6、*10等位基因在高加索人中都有發(fā)現(xiàn),CYP2D6*2和*17主要存在于非洲人中,而在亞洲人群中的突變類型主要是CYP2D6*10。與野生型CYP2D6相比,*10主要是外顯子1C188→T轉換,造成Pro(脯氨酸)34→Ser(絲氨酸)取代,導致編碼的酶不穩(wěn)定,降低CYP2D6的酶活性。按基因型可將CYP2D6*10分為:在外顯子1第188位點上攜帶兩個有活性等位基因的野生型純合子C/C(CYP2D6*1/*1),攜帶兩個導致酶活性降低的等位基因的突變純合子T/T(CYP2D6*10/*10)和只含一個正常等位基因的雜合子C/T(CYP2D6*1/*10)。另一個亞洲人常見單核苷酸多態(tài)是CYP2D6外顯子9G4268→C顛換,造成了Ser(絲氨酸)486→Thr(蘇氨酸)取代,導致表達的酶活性降低。他莫昔芬是乳腺癌內(nèi)分泌治療應用最為廣泛的藥物。4-羥-N-去甲基他莫昔芬是他莫昔芬代謝的主要活性物質,能抑制激素依賴的乳腺癌細胞的擴散,其生成主要依賴于CYP2D6的酶活性。多項研究表明其中CYP2D6*10/*10基因型導致酶活性下降或者抑制酶活性,從而影響他莫昔芬的代謝,進而導致他莫昔芬的治療療效的差異。研究顯示,CYP2D6*10/*10基因型攜帶患者對他莫西芬的治療不敏感。β受體阻斷藥是臨床常用的一線抗高血壓藥物,其代表藥物有美托洛爾(Metoprolol)、普萘洛爾(Propranolol)、卡維地洛(Carvedilol)。普羅帕酮(Propafenone)為廣譜高效膜抑制性抗心律失常藥,具有膜穩(wěn)定作用及競爭性β受體阻滯作用。這些藥物大約70-80%在人體內(nèi)經(jīng)CYP2D6代謝。研究發(fā)現(xiàn),不同個體中藥物的血藥濃度最多可相差20倍,因此CYP2D6的基因多態(tài)性從這些藥的藥代動力學和藥效動力學上影響其毒副反應的發(fā)生。研究表明,在相同劑量條件下,PM(中國人群主要為CYP2D6*10/*10)患者的美托洛爾口服清除率比EM(CYP2D6*1/*1)患者低40%,代謝減慢,CYP2D6所介導代謝的美托洛爾的血藥濃度比EM患者高2~3倍,更易出現(xiàn)心率減慢、傳導阻滯、血壓降低、心力衰竭加重、外周血管痙攣導致的四肢冰冷或脈搏不能觸及、雷諾現(xiàn)象。如不根據(jù)基因型調(diào)整劑量,突變純合子患者可能發(fā)生嚴重的毒副反應。也有研究表明,CYP2D6基因型在普羅帕酮血漿濃度和效應中起著重要作用。450mg/d劑量組中具有CYP2D6*10突變純合子的病人,普羅帕酮血漿峰濃度約為野生基因型的2倍,而且室性早搏(VPC)抑制率也增加一倍。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)建議:在使用心血管類藥物如美托洛爾、普萘洛爾、卡維地洛和普羅帕酮之前需要對患者的CYP2D6基因進行檢測。精神分裂癥(Schizophrenia)是常見的精神疾病之一,發(fā)病率為1%左右。目前廣泛應用的抗精神病藥物包括傳統(tǒng)抗精神分裂癥藥物如氟哌啶醇、奮乃靜等以及非典型抗精神分裂癥藥物如氯氮平、利培酮、阿立哌唑等。臨床治療中,發(fā)現(xiàn)同樣劑量下用藥有相當一部分病人在服藥后發(fā)生椎體外系副反應、粒細胞缺乏癥或體重增加等副作用。研究表明,氟哌啶醇、阿立哌唑、利培酮、奮乃靜、硫利達嗪、氯氮平、伊潘立酮、匹莫齊特等均由CYP2D6代謝,其副反應均與此酶活性有關,而CYP2D6酶活性受其編碼基因的基因型影響。Kirchheiner等進行了薈萃分析,揭示了大約50%的常用抗精神病藥物的劑量取決于CYP2D6基因型。在一項研究中對100名住院患者連續(xù)進行CYP2D6表型的測定并給藥,在接受CYP2D6底物藥物治療的患者中具有PM表型的患者人群中不良反應的發(fā)生率最高。而且在一項有關美國精神病治療的研究中顯示,CYP2D6多態(tài)性對患者的治療費用有很大的影響。因此,對于接受單一或多重由CYP2D6代謝的藥物進行治療的患者來說,基因型測定可以幫助臨床醫(yī)生在已知待選藥物的代謝的基礎上進行適當?shù)倪x擇,從而避免不良的藥物—藥物相互作用。通過恰當?shù)膭┝空{(diào)節(jié)來防止不良反應的發(fā)生,更好地進行個體化藥物治療。焦磷酸測序(Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測序(即,確定DNA中核苷酸的順序)方法,屬于新一代DNA序列分析技術,具備同時對大量樣品進行測序分析的能力,并具有高通量、特異性高、快速、直觀及低成本的優(yōu)點。其基本原理為,由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應,在每一輪測序反應中,只加入一種dNTP,若該dNTP與模板配對,聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(PPi),PPi可最終轉化為可見光信號,并由PyrogramTM轉化為一個峰值,每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數(shù)目成正比;然后加入下一種dNTP,繼續(xù)DNA鏈的合成;最后通過分析岀峰值的情況,達到測定DNA序列的目的。不過,現(xiàn)有技術中還沒有利用焦磷酸測序技術檢測CYP2D6基因分型的產(chǎn)品。目前,在現(xiàn)有技術中,尤其是在醫(yī)院內(nèi),采用有“金標準”之稱的PCR-直接測序法對CYP2D6基因進行檢測,但該方法的敏感性不高,只能檢測出突變細胞比率在10-20%以上的腫瘤組織及外周血,對于突變細胞比率小于10%的腫瘤組織及外周血,常規(guī)PCR-直接測序法幾乎無能為力;此外,該方法還存在成本高、檢測周期長及操作繁瑣的缺點。技術實現(xiàn)要素:為了解決上述方法檢測CYP2D6基因分型過程中存在敏感性不高、檢測周期長、操作繁瑣及成本高的技術問題,本發(fā)明提供一種敏感性高、特異性強、檢測周期短、操作簡單并有效滿足臨床檢驗要求的定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒。本發(fā)明提供了一種定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序引物對,所述CYP2D6基因檢測的多態(tài)性位點為CYP2D6C188T和/或CYP2D6G4268C,所述引物對包括:(1)對于CYP2D6C188T等位基因,擴增引物為:CYP2D6C188T正向擴增引物:5’-GCCGTGATAGTGGCCATCTT-3’(SEQIDNO.1);CYP2D6C188T反向擴增引物:5’-TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCT-3’(SEQIDNO.2);CYP2D6C188T測序引物:5’-GGCAGGGGGCCTGGT-3’(SEQIDNO.3);其中,所述CYP2D6C188T正向擴增引物的5’端進行生物素標記;(2)對于CYP2D6G4268C等位基因,擴增引物為:CYP2D6G4268C正向擴增引物:5’-CATGGTGTCTTTGCTTTCCT-3’(SEQIDNO.4);CYP2D6G4268C反向擴增引物:5’-GGCACAGCACAAAGCTCAT-3’(SEQIDNO.5);CYP2D6G4268C測序引物:5’-CTCATAGGGGGATGG-3’(SEQIDNO.6);其中,所述CYP2D6G4268C正向擴增引物的5’端進行生物素標記。本發(fā)明還提供了一種定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序試劑盒,所述CYP2D6基因檢測的多態(tài)性位點為CYP2D6C188T和/或CYP2D6G4268C,所述試劑盒包括:(1)對于CYP2D6C188T等位基因,CYP2D6C188T正向擴增引物:5’-GCCGTGATAGTGGCCATCTT-3’;PCR反應液1,所述PCR反應液1含有CYP2D6C188T反向擴增引物:5’-TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCT-3’;CYP2D6C188T測序引物:5’-GGCAGGGGGCCTGGT-3’;其中,所述CYP2D6C188T正向擴增引物的5’端進行生物素標記;(2)對于CYP2D6G4268C等位基因,CYP2D6G4268C正向擴增引物:5’-CATGGTGTCTTTGCTTTCCT-3’;PCR反應液2,所述PCR反應液2含有CYP2D6G4268C反向擴增引物:5’-GGCACAGCACAAAGCTCAT-3’;CYP2D6G4268C測序引物:5’-CTCATAGGGGGATGG-3’;其中,所述CYP2D6G4268C正向擴增引物的5’端進行生物素標記。在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實施例中,所述試劑盒還包括:CYP2D6C188T陽性對照品1,其為插有SEQIDNO.8所示核苷酸序列的CYP2D6C188T野生純合子質粒;SEQIDNO.8:5’-TGCCCCTGGCCGTGATAGTGGCCATCTTCCTGCTCCTGGTGGACCTGATGCACCGGCGCCAACGCTGGGCTGCACGCTACCCACCAGGCCCCCTGCCACTGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGT-3’;CYP2D6C188T陽性對照品2,其為所述CYP2D6C188T野生純合子質粒與插有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的CYP2D6C188T突變純合子質粒組成的質?;旌衔?;CYP2D6C188T陽性對照品3,其為插有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的CYP2D6C188T突變純合子質粒;SEQIDNO.9:5’-TGCCCCTGGCCGTGATAGTGGCCATCTTCCTGCTCCTGGTGGACCTGATGCACCGGCGCCAACGCTGGGCTGCACGCTACTCACCAGGCCCCCTGCCACTGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGT-3’;CYP2D6G4268C陽性對照品1,其為插有SEQIDNO.10所示核苷酸序列的CYP2D6G4268C野生純合子質粒;SEQIDNO.10:5’-AGTCTTGCAGGGGTATCACCCAGGAGCCAGGCTCACTGACGCCCCTCCCCTCCCCACAGGCCGCCGTGCATGCCTCGGGGAGCCCCTGGCCCGCATGGAGCTCTTCCTCTTCTTCACCTCCCTGCTGCAGCACTTCAGCTTCTCGGTGCCCACTGGACAGCCCCGGCCCAGCCACCATGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGAGCCCATCCCCCTATGAGCTTTGTGCTGTGCCCCGCTAGAATGGGGTACCTAGTCCCCAGCCTGCTCCCTAGCCAG-3’;CYP2D6G4268C陽性對照品2,其為所述CYP2D6G4268C野生純合子質粒與插有SEQIDNO.11所示核苷酸序列的CYP2D6G4268C突變純合子質粒組成的質?;旌衔?;CYP2D6G4268C陽性對照品3,其為插有SEQIDNO.11所示核苷酸序列的CYP2D6G4268C突變純合子質粒;SEQIDNO.11:5’-AGTCTTGCAGGGGTATCACCCAGGAGCCAGGCTCACTGACGCCCCTCCCCTCCCCACAGGCCGCCGTGCATGCCTCGGGGAGCCCCTGGCCCGCATGGAGCTCTTCCTCTTCTTCACCTCCCTGCTGCAGCACTTCAGCTTCTCGGTGCCCACTGGACAGCCCCGGCCCAGCCACCATGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGACCCCATCCCCCTATGAGCTTTGTGCTGTGCCCCGCTAGAATGGGGTACCTAGTCCCCAGCCTGCTCCCTAGCCAG-3’;其中,質粒載體為pMD18-T質粒;所述CYP2D6C188T陽性對照品2中所述CYP2D6C188T突變純合子質粒和所述CYP2D6C188T野生純合子質粒的數(shù)量比為1:1;所述CYP2D6G4268C陽性對照品2中所述CYP2D6G4268C突變純合子質粒和所述CYP2D6G4268C野生純合子質粒的數(shù)量比為1:1。在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實施例中,所述試劑盒還包括:質控品(controloligo)和空白對照品,所述質控品的序列為:TAYGGTTTGCA(SEQIDNO.7);所述空白對照品為超純水;質控品的序列是由QIAGEN設計合成的一段寡聚核苷酸鏈,用于檢測PyroMarkQ24測序儀的各項性能指標。所述的PCR反應液1和PCR反應液2中其他組分為常規(guī)的10xPCRBuffer、dNTPS和H2O,各組分按常規(guī)體積比配置(10xPCRBuffer、dNTPs、H2O和反應液中引物的體積比為5:3:37.5:1)。所述試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑,如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶組成的酶混合物,由5'-磷酰硫酸和熒光素組成的底物混合物,尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。本發(fā)明還提供了如上所述的引物對在制備用于檢測CYP2D6基因分型的試劑中的應用。相較于現(xiàn)有技術,本發(fā)明提供的定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒具有以下有益效果:一、通過利用焦磷酸測序法技術設計了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑盒,使得所述試劑盒在檢測CYP2D6基因分型時,具有定性準確,靈敏度高及特異性強的優(yōu)點;此外,還具有樣品處理簡單、測序步驟簡單、測序速度快、半個小時完成一次上機反應、直接給出檢測位點頻率分析及結果直觀的優(yōu)點;二、通過利用焦磷酸測序法技術設計了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑盒,使得所述試劑盒在檢測CYP2D6基因分型時,可實時監(jiān)測反應進程、反應時間短、PCR產(chǎn)物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序、操作簡便及高通量樣品檢測,并比金標準方法,即毛細管電泳測序法靈敏度更高,更適合用于突變分析及臨床檢驗;三、通過在所述試劑盒中設置了空白對照品、陽性對照品和質控品,使得所述試劑盒在檢測CYP2D6基因分型時,可以更好的確保檢測結果的準確性。附圖說明圖1為臨床樣品CYP2D6C188T野生型的焦磷酸測序圖;圖2為臨床樣品CYP2D6C188T突變雜合型的焦磷酸測序圖;圖3為臨床樣品CYP2D6C188T突變純合型的焦磷酸測序圖;圖4為臨床CYP2D6C188T空白對照品的焦磷酸測序圖;圖5至圖7為CYP2D6C188T多組設計引物的焦磷酸測序圖;其中圖5和圖6的測序結果不準確,圖7的測序結果真實可靠。圖8為臨床樣品CYP2D6G4268C野生型的焦磷酸測序圖;圖9為臨床樣品CYP2D6G4268C突變雜合型的焦磷酸測序圖;圖10為臨床樣品CYP2D6G4268C突變純合型的焦磷酸測序圖;圖11為臨床CYP2D6G4268C空白對照品的焦磷酸測序圖;圖12至圖14為CYP2D6G4268C多組設計引物的焦磷酸測序圖;其中圖12和圖13的測序結果不準確,圖14的測序結果真實可靠。圖15為臨床質控品controloligo的焦磷酸測序圖。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白,下面結合附圖及實施例,對本發(fā)明進行進一步的詳細說明。應當理解,此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明,并不用于限定本發(fā)明。實施例1:試劑盒的制備一、引物和探針的設計與合成針對人CYP2D6基因的多態(tài)性位點CYP2D6C188T和CYP2D6G4268C等位基因,選擇特異的突變位點,使用PyroMarkAssayDesign2.0軟件,設計引物;其中擴增引物和測序引物先經(jīng)過PAGE純化,再經(jīng)HPLC純化,其中SEQIDNO.1和SEQIDNO.4的5’端進行生物素標記。表1.突變位點與類型MutationBasechangeCYP2D6C188TACGCTAC[C/T]CACCAGCYP2D6G4268CCTGGTGA[C/G]CCCATCC擴增序列如表2:表2.特異性擴增引物及引物序列二、對照品選擇使用人工合成的一段寡聚核苷酸鏈TAYGGTTTGCAcontrololigo為質控品;DNase/RNase-Free水為空白對照品。三、PCR反應液組成表3.PCR反應液1組成原料名稱體積(μL)10xPCRBuffer5dNTP3CYP2D6C188T反向擴增引物1H2O37.5總體積46.5μL表4.PCR反應液2組成原料名稱體積(μL)10xPCRBuffer5dNTP3CYP2D6G4268C反向擴增引物1H2O37.5總體積46.5μL由于針對兩個檢測位點進行擴增,所以有2種不同的PCR反應液,分別對CYP2D6C188T和CYP2D6G4268C位點進行檢測。實施例2:試劑盒的使用一、樣品檢測溶解引物干粉(引物溶解后有效期為1個月)。按照模板數(shù)配制體系:取PCR反應液,加入溶好的引物、尿嘧啶DNA糖基化酶、TaqDNA聚合酶,分裝體系,加入樣品DNA、空白對照品或陽性對照品為模板,組成PCR反應體系。按照PCR反應程序進行PCR擴增。CYP2D6C188T和CYP2D6G4268C體系各主要成分分別如下:表5.CYP2D6C188T體系各主要成分表6.CYP2D6G4268C體系各主要成分該體系反應程序如下:表7.PCR反應程序擴增完成之后,瓊脂糖凝膠檢驗PCR結果,以進行下一步程序。二、焦磷酸測序按照焦磷酸測序標準操作規(guī)程進行測序操作,主要步驟為:樣品的制備和純化,然后將純化后的樣品加入含有退火液和測序引物的MIX中上機測序。焦磷酸測序儀試劑倉中加入運行程序相應的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、酶混合物、底物混合物。質控品controloligo自帶測序引物,最終濃度為0.2μM。三、結果判斷質控品堿基檢出率為100%;空白對照品檢出率為0。四、質控標準各類對照質控品判斷結果如下表:表8.質控品標準檢測結果對照品標準檢驗結果1質控品峰高峰型正常、序列準確2空白對照品堿基檢出率為0五、結果報告:結果如圖1、圖2、圖3、圖8、圖9及圖10所示,樣品結果的判斷標準如下:表9.報告樣品檢測結果圖1及圖8分別顯示的是臨床樣品檢測結果中CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C的野生型,圖2及圖9分別顯示的是臨床樣品檢測結果中CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C的突變雜合型,圖3及圖10分別顯示的是臨床樣品檢測結果中CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C的突變純合型,圖4、圖11及圖15分別顯示的是臨床檢測結果中CYP2D6C188T空白對照品、CYP2D6G4268C空白對照品及質控品controloligo的焦磷酸測序圖。圖5至圖7為CYP2D6C188T多組設計引物的焦磷酸測序圖;其中圖5和圖6的測序結果不準確,圖7的測序結果真實可靠。圖12至圖14為CYP2D6G4268C多組設計引物的焦磷酸測序圖;其中圖12和圖13的測序結果不準確,圖14的測序結果真實可靠。本發(fā)明提供的定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒具有以下有益效果:一、通過利用焦磷酸測序法技術設計了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑盒,使得所述試劑盒在檢測CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C位點時,具有定性準確,靈敏度高及特異性強的優(yōu)點;此外,還具有樣品處理簡單、測序步驟簡單、測序速度快、半個小時完成一次上機反應、直接給出檢測位點頻率分析及結果直觀的優(yōu)點;二、通過利用焦磷酸測序法技術設計了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑盒,使得所述試劑盒在檢測CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C位點時,可實時監(jiān)測反應進程、反應時間短、PCR產(chǎn)物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序、操作簡便及高通量樣品檢測,并比金標準方法,即毛細管電泳測序法靈敏度更高,更適合用于突變分析及臨床檢驗;三、通過在所述試劑盒中設置了空白對照品、陽性對照品和質控品,使得所述試劑盒在檢測CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C位點時,可以更好的確保檢測結果的準確性。以上所述僅為本發(fā)明的實施例,并非因此限制本發(fā)明的專利范圍,凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效流程變換,或直接或間接運用在其它相關的
技術領域:
,均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>長沙三濟生物科技有限公司<120>定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒<130>2016<160>11<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1gccgtgatagtggccatctt20<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2tcgaagcagtatggtgtgttct22<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>3ggcagggggcctggt15<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4catggtgtctttgctttcct20<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>5ggcacagcacaaagctcat19<210>6<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>6ctcatagggggatgg15<210>7<211>11<212>DNA<213>人工序列<400>7tayggtttgca11<210>8<211>175<212>DNA<213>人工序列<400>8tgcccctggccgtgatagtggccatcttcctgctcctggtggacctgatgcaccggcgcc60aacgctgggctgcacgctacccaccaggccccctgccactgcccgggctgggcaacctgc120tgcatgtggacttccagaacacaccatactgcttcgaccaggtgagggaggaggt175<210>9<211>175<212>DNA<213>人工序列<400>9tgcccctggccgtgatagtggccatcttcctgctcctggtggacctgatgcaccggcgcc60aacgctgggctgcacgctactcaccaggccccctgccactgcccgggctgggcaacctgc120tgcatgtggacttccagaacacaccatactgcttcgaccaggtgagggaggaggt175<210>10<211>275<212>DNA<213>人工序列<400>10agtcttgcaggggtatcacccaggagccaggctcactgacgcccctcccctccccacagg60ccgccgtgcatgcctcggggagcccctggcccgcatggagctcttcctcttcttcacctc120cctgctgcagcacttcagcttctcggtgcccactggacagccccggcccagccaccatgg180tgtctttgctttcctggtgagcccatccccctatgagctttgtgctgtgccccgctagaa240tggggtacctagtccccagcctgctccctagccag275<210>11<211>275<212>DNA<213>人工序列<400>11agtcttgcaggggtatcacccaggagccaggctcactgacgcccctcccctccccacagg60ccgccgtgcatgcctcggggagcccctggcccgcatggagctcttcctcttcttcacctc120cctgctgcagcacttcagcttctcggtgcccactggacagccccggcccagccaccatgg180tgtctttgctttcctggtgaccccatccccctatgagctttgtgctgtgccccgctagaa240tggggtacctagtccccagcctgctccctagccag275當前第1頁1 2 3