技術(shù)特征：

1.用BHK21-C13傳代細胞制備山羊痘無血清弱毒活疫苗病毒液的方法，包括以下步驟：

1)細胞選用及傳代培養(yǎng)：

選取經(jīng)支原體、外源病毒檢測結(jié)果均為陰性的BHK21-C13細胞作為種細胞，使用含8-10％(V/V)新生牛血清的MEM培養(yǎng)液，將BHK21細胞貼附方瓶或轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng)瓶中，在37℃下，方瓶靜置培養(yǎng)，或轉(zhuǎn)瓶10-12rph(轉(zhuǎn)/小時)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)；

2)病毒培養(yǎng)：

培養(yǎng)BHK21貼壁細胞48-72小時至細胞融合度達85-95％，棄去細胞培養(yǎng)液，將山羊痘弱毒AV41種毒按接毒溶液總量5-10％(V/V)含量加入細胞培養(yǎng)瓶，于37℃吸附1小時，然后棄去種毒液，加入含10-20mmol HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)的無血清DMEM作為維持液，在34-36℃下，的方瓶靜置繼續(xù)培養(yǎng)或轉(zhuǎn)瓶10-12rph(轉(zhuǎn)/小時)旋轉(zhuǎn)繼續(xù)培養(yǎng)；

3)病變觀察及毒液收獲：

每日觀察細胞病變，以細胞呈現(xiàn)間質(zhì)變寬、細胞圓縮、脫落等病變特征作為觀察判斷細胞病變指標，至細胞病變率(CPE)達85％，收獲病毒液，測定TCID₅₀，選取病毒液每0.1mL病毒含量≥10^5.5TCID₅₀的為山羊痘無血清弱毒活疫苗病毒液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山羊痘無血清弱毒活疫苗病毒液的制備方法，其特征在于：所述步驟1)中的外源病毒主要包括牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、藍舌病毒(BTV)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的山羊痘無血清弱毒活疫苗病毒液的制備方法，其特征在于：步驟2)繼續(xù)培養(yǎng)中山羊痘弱毒AV41于BHK21細胞傳代，步驟3)收獲病毒液的時間為接毒后繼續(xù)培養(yǎng)72-120小時。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的山羊痘無血清弱毒活疫苗病毒液的制備方法，其特征在于：步驟3)收獲的病毒液為山羊痘弱毒AV41傳代至25-28代時，效價水平為每0.1mL病毒液中病毒含量≥10^5.5TCID₅₀的山羊痘無血清弱毒活疫苗病毒液。

5.用權(quán)利要求1-4任一所述方法制備得到的山羊痘無血清弱毒活疫苗病毒液。

6.一種制備耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的方法，是向權(quán)利要求5所述的山羊痘無血清弱毒活疫苗病毒液中添加耐熱凍干保護劑，再經(jīng)冷凍干燥，得到外觀完好、易保存的耐熱型山羊痘弱毒活疫苗。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的制備方法，其特征在于：所述耐熱凍干保護劑各成分質(zhì)量百分含量及配制如下：

甲液：

蔗糖：15％，

酶解酪蛋白：5.8％，

明膠：4.0％，

海藻糖：1.0％，

其余為：注射用水；

甲液116℃高壓滅菌20分鐘；

乙液：

牛血清白蛋白：2.0％，

精氨酸鹽酸鹽：2.0％，

谷氨酸鈉：1.0％，

山梨醇：2.0％，

其余為：注射用水；

乙液用0.2um過濾器進行過濾除菌；

將甲液與乙液按體積比1：1混合后得到耐熱凍干保護劑。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的制備方法，其特征在于：山羊痘無血清弱毒活疫苗病毒液的上清液與所述耐熱凍干保護劑按體積比1：1混合。

9.根據(jù)權(quán)利要求6或7或8所述耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的制備方法，其特征在于：所述冷凍干燥的凍干曲線為：

預凍階段：常溫進凍干箱，于80min內(nèi)預凍至-42℃，維持160min；

升華干燥階段：于120min內(nèi)升溫至-5℃，維持750min,于30min內(nèi)由-5℃升溫至-3℃，維持120min；

解吸干燥階段：于190min內(nèi)，由-3℃升溫至26℃，并于26℃二次干燥維持420min。

10.用權(quán)利要求6-9任一所述方法制備得到的耐熱型山羊痘弱毒活疫苗。