本發(fā)明涉及細(xì)胞基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種定點(diǎn)整合外源基因的FRT-CHOS細(xì)胞系及其在蛋白表達(dá)的用途。

背景技術(shù)：

提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞外源基因表達(dá)水平和穩(wěn)定性，一直是生物制藥領(lǐng)域或基因工程領(lǐng)域不斷發(fā)展的需求。盡管大多數(shù)商業(yè)化表達(dá)體系尤其表達(dá)載體都有針對(duì)性的優(yōu)化設(shè)計(jì)，如選擇強(qiáng)啟動(dòng)子，帶有加壓篩選系統(tǒng)等，但獲得高表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞仍然需要耗費(fèi)巨大的精力和成本。通過(guò)常規(guī)技術(shù)引入外源基因的整合具有隨機(jī)性，插入位置不支持強(qiáng)轉(zhuǎn)錄發(fā)生，并導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平較低，即使短時(shí)的高水平表達(dá)，但也不能維持其穩(wěn)定性，并隨傳代次數(shù)增加表達(dá)水平逐漸下降。因此，外源基因插入染色體的“位置效應(yīng)”以及整合位點(diǎn)是否在高轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)等被提出是影響蛋白表達(dá)水平及其穩(wěn)定性的重要因素。只有對(duì)目的基因?qū)嵤┒ㄏ蛘先缯现粱蚪M的特定位置，才可能實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定整合和蛋白高水平表達(dá)。

外源基因定向整合方法有多種，包括同源重組技術(shù)衍生的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，依靠針對(duì)特異識(shí)別位點(diǎn)的整合酶，在基因組和外源DNA間實(shí)現(xiàn)基因置換、基因敲出及敲入等基因工程操作。由于能夠有效克服靶向性低、隨機(jī)整合以及位置效應(yīng)影響等缺點(diǎn)，定點(diǎn)整合技術(shù)在基因工程領(lǐng)域中的應(yīng)用已為外源基因靶向定點(diǎn)整合奠定了良好基礎(chǔ)。從20世紀(jì)80年代發(fā)展至今，位點(diǎn)特異性重組技術(shù)已有多種，其中最成熟的技術(shù)為FLP/FRT系統(tǒng)和Cre/loxP系統(tǒng)。FLP/FRT技術(shù)在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用開(kāi)始于20世紀(jì)90年代初期。O’Gorman等應(yīng)用FLP重組酶技術(shù)實(shí)現(xiàn)了將外源基因整合進(jìn)入預(yù)先確定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體位點(diǎn)(Science.1991Mar 15；251：1351-5.Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells)；Wiberg FC等應(yīng)用FLP/FRT技術(shù)將編碼抗體的基因整合進(jìn)入CHO細(xì)胞基因組，首先在CHO細(xì)胞基因組特定位點(diǎn)插入1個(gè)FRT位點(diǎn)，建立含有單個(gè)FLP重組酶識(shí)別位點(diǎn)的宿主細(xì)胞系，然后將同樣含有單個(gè)FRT位點(diǎn)的抗體表達(dá)載體以及FLP重組酶表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，編碼抗體的基因在FLP重組酶的作用下，定點(diǎn)整合在細(xì)胞基因組的相同位點(diǎn)，有效克服了位置效應(yīng)對(duì)抗體表達(dá)水平的影響(Biotechnol Bioeng.2006，94：396-405.Production of target-specific recombinant human polyclonal antibodies in mammalian cells.)。目前，通過(guò)FLP/FRT技術(shù)已推出系列商業(yè)化細(xì)胞系，包括Flp-In^TM-293、Flp-In^TM-CV-1、Flp-In^TM-CHO、Flp-In^TM-BHK和Flp-In^TM-3T3等，這些細(xì)胞系均可借助重組酶體系完成細(xì)胞基因組與外源DNA的位點(diǎn)特異性重組。然而，所述細(xì)胞系均為貼瓶生長(zhǎng)，作為產(chǎn)業(yè)化用途尤其在表達(dá)治療性蛋白或治療性單克隆抗體方面的運(yùn)用具有很大的局限性。中國(guó)專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)枺?00310115022.4)公開(kāi)了一種CHO/dhfr-細(xì)胞定點(diǎn)整合表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因在CHO/dhfr-細(xì)胞基因組中定點(diǎn)整合和有效表達(dá)。PCT專(zhuān)利(2012)公開(kāi)了一種染色體著陸墊(chromosomal landing pad)及其相關(guān)用途，尤其公開(kāi)了強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)位于宿主細(xì)胞的Ank2、Cpsf4、C-Mos、Nephrocystin-1/Mal基因之內(nèi)或附近的染色體著陸墊，這些染色體“著陸墊”均借助FLP/FRT技術(shù)實(shí)現(xiàn)，并成功用于外源基因的定點(diǎn)整合。中國(guó)專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)枺?01510130235.7)公開(kāi)了一種CHO細(xì)胞定點(diǎn)整合表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因在細(xì)胞染色體基因組中1q12及1q13區(qū)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合和高效表達(dá)。

作為產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，具有多種亞型或衍生細(xì)胞系，如CHO-K1，CHO-DG44以及CHO-S細(xì)胞，這些細(xì)胞各自的染色體總數(shù)以及結(jié)構(gòu)畸變不盡相同，但均已發(fā)生大的變異，多數(shù)染色體已經(jīng)發(fā)生重排(Deaven LL，Petersen DF，Chromosoma.1973，41∶129-144The chromosomes of CHO，an aneuploid Chinese hamster cell line：G-band，C-band，and autoradiographic analyses；Derouazi M et al，Biochemical and Biophysical Research Communications.2006.340∶1069-1077.Genetic characterization of CHO production host CHO-DG44and derivative recombinant cell lines)，以CHO-K1和CHO-DG44為例，僅有少數(shù)染色體保留了其正常結(jié)構(gòu)，本發(fā)明人在前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)在CHO細(xì)胞實(shí)施電轉(zhuǎn)染外源基因發(fā)現(xiàn)，除了整合至1號(hào)染色體1q13區(qū)的外源基因能高效穩(wěn)定表達(dá)外，1號(hào)染色體的1p12區(qū)也可以實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。本發(fā)明由此設(shè)計(jì)在懸浮生長(zhǎng)的CHO-S細(xì)胞基因組中插入FRT位點(diǎn)，從中篩選出整合在不同染色體上的單個(gè)FLP重組酶識(shí)別位點(diǎn)的細(xì)胞，其能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白的高效表達(dá)，由此產(chǎn)生的本發(fā)明可接受任何含有同樣單個(gè)FRT位點(diǎn)的蛋白或抗體表達(dá)載體，并用于后續(xù)產(chǎn)業(yè)化表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基因工程FRT-CHOS細(xì)胞系及其用途，包括：

(1)懸浮培養(yǎng)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，優(yōu)選CHO-S細(xì)胞系；

(2)應(yīng)用FLP/FRT技術(shù)將含F(xiàn)RT識(shí)別標(biāo)簽載體通過(guò)電轉(zhuǎn)染方式插入懸浮培養(yǎng)的CHO-S細(xì)胞基因組；

(3)逐步提高博來(lái)霉素濃度加壓選擇Zeocin抗性克隆，獲得FRT隨機(jī)整合的混合細(xì)胞；

(4)經(jīng)有限稀釋進(jìn)行細(xì)胞亞克隆，結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)篩選單個(gè)穩(wěn)定整合FRT位點(diǎn)在1p12區(qū)的FRT-CHOS55細(xì)胞作為本發(fā)明FRT-CHOS細(xì)胞；

(5)應(yīng)用Flp重組酶技術(shù)，在細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)使外源基因插入本發(fā)明FRT-CHOS55細(xì)胞FRT識(shí)別位點(diǎn)，通過(guò)共轉(zhuǎn)染表達(dá)Flp重組酶的質(zhì)粒以及表達(dá)目的蛋白的質(zhì)粒pFRT-GIA，使Flp重組酶在瞬時(shí)表達(dá)的同時(shí)，促使pFRT-GIA特異性在FRT位點(diǎn)實(shí)施同源重組，實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)整合。

附圖說(shuō)明

圖1 UCOE-dhfr質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 UCOE-GIA質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

圖3 pBAT-FIp質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

圖4 工程細(xì)胞系FRT-CHOS55定點(diǎn)整合的熒光原位雜交鑒定

圖5 工程細(xì)胞系外源蛋白表達(dá)水平比較(D：天)

圖6 工程細(xì)胞系外源蛋白表達(dá)穩(wěn)定性比較(p：代次)

具體實(shí)施方式

提供以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非對(duì)本發(fā)明有任何限制。

實(shí)施例1FRT識(shí)別位點(diǎn)在CHO細(xì)胞染色體的定位篩選

1、細(xì)胞培養(yǎng)

CHO-S細(xì)胞系，在CD FortiCHO^TM Medium培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺及抗結(jié)團(tuán)劑(Anti-Clumping Agent)，在5％CO2，37℃，130rpm/min的細(xì)胞搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。

2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及細(xì)胞初步篩選

參照無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒試劑盒說(shuō)明書(shū)(DP117，天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒pFRT/lacZeo，利用ScaI限制性?xún)?nèi)切酶將pFRT/lacZeo質(zhì)粒進(jìn)行線(xiàn)性化處理，酶切產(chǎn)物回收后，采用Lonza Cell Line KitV試劑盒并參照說(shuō)明書(shū)(VCA-1003，LONZA)進(jìn)行pFRT/lacZeo質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的細(xì)胞置于搖瓶培養(yǎng)至48h，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞活率和細(xì)胞數(shù)。轉(zhuǎn)染后進(jìn)行逐級(jí)加壓篩選：博來(lái)霉素(Zeocin)濃度為50μg/mL，100μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，750μg/mL和1000μg/mL，逐漸加壓，獲得初篩細(xì)胞。

3、單克隆細(xì)胞篩選

將初篩細(xì)胞轉(zhuǎn)入半固體培養(yǎng)基，半固體接種方法步驟同前，挑取獲得的單克隆細(xì)胞系通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中l(wèi)acZ基因產(chǎn)物β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行初步篩選，β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)方法參照試劑盒(β-Gal Assay Kit，K1455-01，Thermo)提供的說(shuō)明進(jìn)行。經(jīng)連續(xù)2次半固體培養(yǎng)基篩選，挑取數(shù)個(gè)單克隆細(xì)胞系，根據(jù)β-半乳糖苷酶活性高低進(jìn)行篩選的單克隆細(xì)胞系；并通過(guò)對(duì)單克隆細(xì)胞系提取基因組DNA，利用特異引物L(fēng)acZF和LacZR通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因，確認(rèn)目的載體整合至基因組中。細(xì)胞系用于后續(xù)研究。

4、單克隆細(xì)胞染色體熒光原位雜交

a)染色體制片

優(yōu)選15個(gè)高表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的單克隆細(xì)胞系分別擴(kuò)大培養(yǎng)，加入秋水仙素(終濃度為0.5μg/m1)孵育2h；取15ml離心管收集細(xì)胞，1000rpm離心5min，去上清；用37℃預(yù)熱的KC1(0.075mol/L)溶液1ml重懸細(xì)胞，補(bǔ)加7ml KC1(0.075mol/L)溶液，37℃水浴低滲處理20min；加入2ml固定液(甲醇：冰乙醇(v∶v)＝3∶1)，輕輕吹打混勻后放置10min，1000rpm離心10min，去上清；加入1 mL固定液重懸細(xì)胞，加3mL固定液混勻，室溫放置10min，200g離心10min，去上清留約0.5mL體積；重懸細(xì)胞。取預(yù)冷的玻片，用玻璃吸管滴片(每片滴加40-50μL的細(xì)胞懸液)，室溫放置24h。

b)探針制備

取20μg pFRT/lacZeo質(zhì)粒，利用HindIII和Bpu10I限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切處理，37℃條件反應(yīng)過(guò)夜，切膠回收小目的片段，用于探針標(biāo)記模板，該小片段與整合的質(zhì)?；パa(bǔ)，將小片段利用非放射性生物素進(jìn)行標(biāo)記，具體標(biāo)記操作步驟按照Random Primed DNA Labeling Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，獲得FRT探針。

c)熒光原位雜交

將室溫放置24h的玻片分別在變性液(2×SSC/70％甲酰胺)中75℃變性2min，依次置入70％、90％、100％冰乙醇中各2-5min脫水，室溫干燥；探針用雜交液稀釋至終濃度10ng/μL，78℃變性8min，37℃復(fù)性45min，加在變性處理后的樣本玻片上，封片，37℃濕盒中雜交過(guò)夜；去除封片，43℃水浴，2×SSC/50％甲酰胺15min；用2×SSC/0.01％Tween 20洗片三次，室溫5min，2×SSC洗片兩次，室溫5min；玻片室溫晾干后，暗室滴加30μL鏈霉親和素-FITC，蓋上蓋玻片，37℃暗處溫浴1h，去除蓋玻片。用2×SSC/0.01％Tween 20洗片三次，室溫5min，2×SSC洗片兩次，室溫5min；依次置入70％、90％、100％冰乙醇中各5min脫水，暗處室溫?fù)]干；加入自配含DAPI的抗淬滅液復(fù)染，覆蓋玻片(乙醇預(yù)先處理)，10min后在熒光顯微鏡下觀(guān)察。

原位雜交分析結(jié)果顯示，外源標(biāo)簽隨機(jī)插入CHO細(xì)胞基因組中，共計(jì)獲得14個(gè)整合位點(diǎn)不同的單克隆細(xì)胞系(見(jiàn)表1)，選擇其中1株β-Gal活性最高的細(xì)胞系和1株活性最低的對(duì)照細(xì)胞株用于同源重組，分別為FRT插入位點(diǎn)在1p12的FRT-CHOS55細(xì)胞系以及FRT插入位點(diǎn)在Z8的FRT-CHOS6細(xì)胞系。

表1 FRT外源標(biāo)簽插入位點(diǎn)

實(shí)施例2外源基因同源重組及蛋白表達(dá)

1、表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

a)UCOE-dhfr表達(dá)載體構(gòu)建

UCOE-dhfr載體通過(guò)人工改造獲得，其可用于外源基因定點(diǎn)整合及蛋白表達(dá)。利用特異引物P1和P2通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得基因片段。PCR反應(yīng)體系1(總體積50μl)：5×Buffer 10μl、dNTP 2μl、引物1μl(P1和P2)、模板為UCOE載體1μl、Phusion酶0.5μl，最后用雙蒸水補(bǔ)至50μl；反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性60s，1個(gè)循環(huán)，98℃10s、55℃30s、72℃50s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃7min。基因產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得基因片段命名為genel。利用特異引物P3和P4通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得基因片段DHFR。PCR反應(yīng)體系1(總體積50μ1)：5×Buffer 10μl、dNTP 2μl、引物1μl(P1和P2)、模板為pCHO1.0載體1μl、Phusion酶0.5μl，最后用雙蒸水補(bǔ)至50μl；反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性60s，1個(gè)循環(huán)，98℃10s、55℃30s、72℃50s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃7min。基因產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得基因片段命名為gene2。利用特異引物P1和P4通過(guò)拼接PCR方法擴(kuò)增獲得基因片段。PCR反應(yīng)體系1(總體積50μl)：5×Buffer 10μl、dNTP 2μl、引物1μl(P1和P2)、模板為pCHO1.0載體1μl、Phusion酶0.5μl，最后用雙蒸水補(bǔ)至50μl；反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性60s，1個(gè)循環(huán)，98℃10s、55℃30s、72℃50s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃7min?；虍a(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得基因片段命名為gene3。Gene3包含了mPKG啟動(dòng)子、FRT位點(diǎn)和DHFR基因序列。將gene3和UCOE載體分別利用SalI和DraIII雙酶切處理，前者利用產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行基因片段回收，后者利用膠回收試劑盒回收載體大片段，連接，構(gòu)建UCOE-dhfr載體，轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，提取質(zhì)粒酶切及序列分析，結(jié)果UCOE-dhfr載體構(gòu)建成功(圖1)。

引物如下所示：

P1：5-AGAGTCGACCCTAGGGATATCTTAATTAACTGCAGGCATGCAAGCTGGC-3

P2：5-CTTCGGAATAGGAACTTCGGTAAGCTGGTCGAAAGGCC-3

P3：5-GAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATGGTTCGACCATTG-3

P4：5-ATGCACCAGGTGTTAGTCTTTCTTCTCGTAGAC-3

b)UCOE-GIA質(zhì)粒構(gòu)建

UCOE-GIA載體通過(guò)人工改造獲得，其在UCOE-dhfr載體中插入外源目的基因，用于外源基因定點(diǎn)整合及蛋白表達(dá)。全基因合成方法獲得目的基因片段，獲得基因片段命名為GIA。UCOE-dhfr和GIA分別進(jìn)過(guò)AvrII和PacI酶切處理。在T4連接酶的作用下，將基因片段UCOE-dhfr、GIA基因片段連接。連接反應(yīng)體系如下：在1.5ml EP管中加入如下成分UCOE-dhfr0.5μl，GIA 7.5μl，10×T4Buffer1μl，T4DNA ligase1μl，混勻后在室溫(20℃左右)下反應(yīng)4h以上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于2YT平板培養(yǎng)基上37℃靜止過(guò)夜，平板編號(hào)UCOE-GIA。從UCOE-GIA平板中各挑取數(shù)個(gè)重組單菌落經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后做為PCR模板，分別進(jìn)行PCR篩選鑒定。菌液PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(總體積20μL)：2×Taq HS 10μL、菌液模板2μL、上下游引物各1μL(終濃度0.3μmol/L)，最后用雙蒸水補(bǔ)至20μL；反應(yīng)條件：95℃2min，一個(gè)循環(huán)；94℃60s、53℃60s、72℃120s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃5min。通過(guò)菌落PCR鑒定正確的菌落接種后提取再進(jìn)行酶切鑒定。首先進(jìn)行重組菌的質(zhì)粒提取，然后進(jìn)行酶切分析，將通過(guò)菌落PCR、酶切鑒定及測(cè)序鑒定獲得正確UCOE-GIA質(zhì)粒(圖2)。

2、pBAT-Flp質(zhì)粒構(gòu)建

pBAT-Flp載體通過(guò)人工改造獲得，用于特異性表達(dá)FLP重組酶。利用特異引物P5和P6通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得基因片段。PCR反應(yīng)體系(總體積50μl)：5×Buffer 10μl、dNTP 2μl、引物1μl(P1和P2)、模板為pOG44載體1μl、Phusion酶0.5μl，最后用雙蒸水補(bǔ)至50μl；反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性60s，1個(gè)循環(huán)，98℃10s、55℃30s、72℃50s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃7min。基因產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得基因片段命名為Flp。將Flp和pCI-neo載體分別利用NheI和SalI雙酶切處理，前者利用產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行基因片段回收，后者利用膠回收試劑盒回收載體大片段，連接，構(gòu)建pBAT-Flp載體，轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，提取質(zhì)粒酶切及序列分析，結(jié)果pBAT-Flp載體構(gòu)建成功(圖3)。

引物如下所示：

P5：5-GCCGCTAGCATGCCACAATTTGATATATTATG-3

P6：5-GCCGTCGACTTATATGCGTCTATTTATG-3

3、質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染

質(zhì)粒pBAT-Flp含有FLP重組酶表達(dá)元件，通過(guò)與特定質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，可實(shí)現(xiàn)特定質(zhì)粒在基因組中FRT位點(diǎn)的定點(diǎn)整合。采用已篩選的FRT整合工程細(xì)胞系FRT-CHOS55和FRT-CHOS6進(jìn)行檢測(cè)，按照Lonza Cell Line Kit V試劑盒說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行UCOE-GIA和pBAT-Flp質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細(xì)胞分別置于搖瓶培養(yǎng)(37℃、5％CO2、130rpm/min)至48h，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞活率和細(xì)胞數(shù)。

轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行加壓篩選：即MTX濃度從100nM起逐漸加至200nM、500nM、700nM、和1000nM，并獲得初篩細(xì)胞，再經(jīng)有限稀釋法進(jìn)行單克隆細(xì)胞篩選，獲得單克隆細(xì)胞系FRT-CHOS55-GIA和FRT-CHOS6-GIA。

4、同源重組鑒定

a)熒光原位雜交

i.染色體制片

單克隆細(xì)胞系染色體制備方法參照實(shí)施例1中實(shí)驗(yàn)4a操作。

ii.探針制備

以UCOE-GIA質(zhì)粒，利用AvrII和PacI限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切處理，37℃條件反應(yīng)過(guò)夜，切膠回收小片段用于探針標(biāo)記，該小片段與整合的質(zhì)?；パa(bǔ)，將小片段利用非放射性生物素進(jìn)行標(biāo)記，具體標(biāo)記操作步驟按照Random Primed DNA Labeling Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，獲得探針。

iii.熒光原位雜交

熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)方法參照實(shí)施例1中實(shí)驗(yàn)4c操作。

原位雜交分析結(jié)果顯示，F(xiàn)RT-CHOS55-GIA細(xì)胞系目的基因特異性整合至1號(hào)染色體1p12處，F(xiàn)RT-CHOS6-GIA細(xì)胞系目的基因特異性整合至Z8號(hào)染色體Z8p1處(圖4)，說(shuō)明目的基因與細(xì)胞系的FRT位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)整合。

b)外源蛋白表達(dá)

篩選陽(yáng)性克隆細(xì)胞從96孔板擴(kuò)至24孔板生長(zhǎng)，然后擴(kuò)至6孔板生長(zhǎng)，之后擴(kuò)至50mL搖瓶生長(zhǎng)。分別收集培養(yǎng)3天、5天、7天、9天、11天細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心除去細(xì)胞碎片，上清液進(jìn)行蛋白鑒定與蛋白濃度檢測(cè)。Western blot檢測(cè)結(jié)果GIA蛋白分子量大小符合理論值，表明GIA蛋白正確表達(dá)。蛋白濃度檢測(cè)結(jié)果顯示，工程細(xì)胞系能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白高水平表達(dá)，篩選獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRT-CHOS55-GIA細(xì)胞系其11天細(xì)胞培養(yǎng)上清表達(dá)量達(dá)到1.23g/L。

同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)染的2個(gè)細(xì)胞系(包括FRT插入位點(diǎn)在1p12的FRT-CHOS55-GIAD單克隆細(xì)胞系、FRT插入位點(diǎn)在Z8p1的FRT-CHOS6-GIAD單克隆細(xì)胞系)及其對(duì)應(yīng)的pool細(xì)胞(包括FRT-CHOS55-GIA-pool細(xì)胞系、FRT-CHOS6-GIA-pool細(xì)胞系)的外源蛋白表達(dá)水平進(jìn)行比較，分別收集培養(yǎng)3天、5天、7天、9天、11天細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心除去細(xì)胞碎片，上清液進(jìn)行蛋白鑒定與蛋白濃度檢測(cè)。蛋白濃度檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)FRT-CHOS55細(xì)胞系能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白高水平表達(dá)，而FRT-CHOS6工程細(xì)胞系其外源蛋白水平表達(dá)較低(圖5)。

5、外源蛋白表達(dá)穩(wěn)定性考察

單克隆細(xì)胞系FRT-CHOS55-GIAD和FRT-CHOS6-GIAD經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，分別考察了多代次的細(xì)胞分泌外源蛋白表達(dá)水平，通過(guò)對(duì)10代、20代、30代、50代、70代和100代細(xì)胞的外源蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)后，F(xiàn)RT-CHOS55-GIAD工程細(xì)胞系能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白穩(wěn)定表達(dá)，100代次的表達(dá)量與0代相比下降幅度為20％左右，說(shuō)明單克隆細(xì)胞系FRT-CHOS55-GIAD外源蛋白表達(dá)穩(wěn)定性較好，說(shuō)明工程細(xì)胞系FRT-CHOS55可用于高效穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的應(yīng)用；而FRT-CHOS6-GIAD工程細(xì)胞系其外源蛋白表達(dá)穩(wěn)定性較差，100代次的表達(dá)量與0代相比下降幅度接近40％(圖6)。