本發(fā)明涉及一種CIK細胞制備方法，特別是涉及一種高效CIK細胞制備及檢測方法。

發(fā)明背景

過繼性免疫治療已經(jīng)成為繼手術(shù)、放療和化療等三大傳統(tǒng)治療方法后的第四種治療方法，特別是細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine-Induced Killer cells，CIK)，因其具有增殖速度快、殺瘤譜廣、殺瘤活性高、對正常骨髓造血前體細胞毒性小、對多重耐藥腫瘤細胞同樣敏感、可與傳統(tǒng)治療手段相結(jié)合等特點而得到廣泛認可，是目前發(fā)現(xiàn)的殺傷腫瘤細胞活性強，適合臨床應用的一種理想的效應細胞。

CIK細胞在正常外周血中極其少見，僅為1％～5％。CIK細胞制備技術(shù)的發(fā)現(xiàn)使其應用于臨床成為可能。CIK細胞最早由美國科學家于20世紀九十年代首次報道，他們發(fā)現(xiàn)通過多種細胞因子(IFN-γ、CD3單克隆抗體、IL-2和IL-1)的共同刺激，外周血單個核細胞可以被誘導出大量具有腫瘤殺傷活性的細胞。因該種細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，所以其既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性又具有自然殺傷細胞的非MHC限制性的雙重特性。該制備方法作為傳統(tǒng)的CIK細胞制備方法沿用至今，但獲得的CIK細胞在細胞毒活性和增殖倍數(shù)等方面并不是很理想。隨著科技的進步，無血清培養(yǎng)技術(shù)的應用以及新的細胞生長刺激物的發(fā)現(xiàn)等為CIK細胞制備方法提供了改進空間。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種高效CIK細胞制備方法，本發(fā)明的目的還在于提供該方法制備的CIK細胞檢測方法。本發(fā)明的目的旨在針對傳統(tǒng)方法所得CIK細胞存在增殖倍數(shù)低、CD3+CD56+雙陽表達率不高、制備工藝不穩(wěn)定等問題，對傳統(tǒng)的CIK細胞制備方法進行了改進。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明高效CIK細胞制備方法包括如下步驟：

(1)全血檢驗與血樣保存：用移液管將原血從采血管中轉(zhuǎn)移至離心管中，反復吹打混勻后：取出血樣用于微生物檢測、取血樣于凍存管中冷藏保存，作為檔案以備后續(xù)檢驗；

(2)血漿處理：將盛有原血的離心管放入離心機中，配平后離心，將上層血漿轉(zhuǎn)移到離心管中，蓋緊蓋子，貼封口膜，置于56℃水浴鍋中滅活，滅活后離心棄沉淀，留上清保存待用；

(3)分離單核細胞：在原血中加入等體積的生理鹽水，吹打均勻得稀釋血樣；用移液管把稀釋血樣緩緩加入到盛有FicoLL的離心管中，旋緊蓋子離心；稀釋血樣要加到FicoLL的上層，切勿打破分界面；

將上述離心好的樣品輕輕取出離心機放入生物安全柜，在光照下可以看到樣品在離心管里大致分成四層，從上到下依次為生理鹽水血漿層、單核細胞層、FicoLL層、粒細胞紅細胞層；用移液管小心將生理鹽水血漿層盡量吸棄干凈，然后沿離心管壁小心將單核細胞層吸取轉(zhuǎn)移到若干離心管中，添加生理鹽水，旋緊蓋子顛倒混勻得單核細胞稀釋液；

(4)單核細胞洗滌：將上步收集好的單核細胞稀釋液進行離心棄上清液；再重復加生理鹽水混合均勻離心棄上清液多次，最后收集得到的沉淀即為單核細胞；

(5)單核細胞培養(yǎng)。具有避免了外源潛在的病源微生物的感染，制備工藝穩(wěn)定，操作簡單；明顯提高CIK細胞增殖倍數(shù)和細胞毒活性的優(yōu)點。

作為優(yōu)化，單核細胞培養(yǎng)是：

Day0+因子1：用無血清培養(yǎng)基重懸(4)步單核細胞，加入IFN-γ因子1得細胞懸液，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，旋緊透氣瓶蓋，置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；

Day1+因子2：培養(yǎng)后，加入含CD3McAb、CD28McAb、IL-2及IL-1α的因子2置于培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；并根據(jù)需要擴增培養(yǎng)，以后擴增細胞加入培養(yǎng)基時，在新鮮的培養(yǎng)基中加入IL-2的量要加倍；

Day3+50：上步細胞培養(yǎng)三天后，在顯微鏡下觀察到：細胞體積明顯增大，形狀多呈增殖分裂狀，細胞集落出現(xiàn)、細胞數(shù)量增多、培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色時，加入新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基以滿足細胞生長的需要；

Day5+100：隨著細胞進入快速增殖期，生長迅速，需要每日顯微鏡下對細胞進行觀察，觀察指標同上步Day3，并補加新鮮已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基；

Day7BC(Bag CuLtivation)：顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，觀察指標同上步Day5；在生物安全柜中用移液管反復吹打混勻細胞，取出細胞懸液樣于離心管中，用赤蘚紅染色計算細胞密度，當細胞密度達到要求時，通過注射器連接細胞培養(yǎng)袋，將細胞培養(yǎng)瓶中的細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中，用新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基分多次洗滌培養(yǎng)瓶，將洗滌培養(yǎng)基合并至細胞培養(yǎng)袋中；

Day10+600：間隔四天后，培養(yǎng)基顏色明顯變黃，細胞數(shù)量明顯增多，補加新鮮培養(yǎng)基，操作同上步day7BC；

Day12MT(MicrobioLogicaL Tests)：細胞收獲前兩天，對培養(yǎng)體系做微生物檢測；

Day14H(Harvest)：

1)從培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)袋，置于生物安全柜中，將細胞懸液從細胞培養(yǎng)袋中轉(zhuǎn)入若干離心管中，擰緊蓋子，配平后置于離心機中離心棄上清液，用渦旋振蕩器振散細胞團塊；

2)用加入人血白蛋白的生理鹽水洗離心管多次，多次洗得細胞懸液并入另一離心管中，依此操作將離心管合并為至少兩個，離心棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊；

3)用加入人血白蛋白的生理鹽水洗離心管多次，多次洗得細胞懸液并入另一離心管中，吸取細胞樣本于離心管中進行細胞計數(shù)，向合并多次洗得細胞懸液中加入生理鹽水離心棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊；

4)加入生理鹽水并混勻，加入人血白蛋白混勻得細胞懸液；取出細胞懸液樣品進行內(nèi)毒素及微生物檢測，并留樣凍于冰箱待后續(xù)檢測，細胞懸液過細胞篩后轉(zhuǎn)入細胞轉(zhuǎn)移袋中封口，待檢測合格即為制成。

作為優(yōu)化，

Day0+因子1步：細胞接種濃度為1-3×10⁶/mL，IFN-γ工作濃度為500-1000U/mL；

Day1+因子2步：CD3McAb工作濃度為50-100ng/mL、CD28McAb工作濃度為50-100ng/mL、IL-2工作濃度為500-1000U/mL，IL-1α工作濃度為500-1000U/mL；以后擴增細胞加入培養(yǎng)基時，要在新鮮的培養(yǎng)基中按1000-2000U/mL加入IL-2；

Day7BC(Bag CuLtivation)步；細胞密度達到的要求為細胞密度達到1.0×10⁶；

Day14H(Harvest)步；4)加入適量人血白蛋白的終濃度為1％)。

作為優(yōu)化，

Day0+因子1步；重懸細胞的無血清培養(yǎng)基是50mL，培養(yǎng)瓶為T175培養(yǎng)瓶；

Day1+因子2步；培養(yǎng)后是培養(yǎng)24h后；

Day3+50步：加入新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基后，體積定量為50mL；

Day5+100步：補加新鮮已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基，體積定量為100mL；

Day7BC(Bag CuLtivation)步：反復吹打用的移液管為10mL移液管，取出細胞懸液樣于離心管中是取出約0.5mL細胞懸液于1.5mL離心管中，連接細胞培養(yǎng)袋的注射器是60mL注射器，細胞培養(yǎng)瓶是T175細胞培養(yǎng)瓶，用新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基分多次洗滌培養(yǎng)瓶是用400mL新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基分2次洗滌T175培養(yǎng)瓶；

Day10+600步：補加新鮮培養(yǎng)基是補加600mL新鮮培養(yǎng)基；

Day12MT(MicrobioLogicaL Tests)步：對培養(yǎng)體系做微生物檢測是將細胞培養(yǎng)袋放入生物安全柜中，擠壓袋子，混勻體系，打開培養(yǎng)袋取樣管蓋子，用5mL注射器抽取約1mL細胞樣本，做微生物檢測；

Day14H(Harvest)步：

1)步：離心管為250mL離心管，離心是2000rpm離心5min；

2)步：用加入人血白蛋白的生理鹽水洗離心管多次是用已加入適量人血白蛋白的25mL×3次生理鹽水洗離心管，將離心管合并為至少兩個離心棄上清是，將四個離心管并為兩個，2000rpm離心5min，棄上清；

3)步：用加入人血白蛋白的生理鹽水洗離心管多次是用已加入適量人血白蛋白的25mL×2次生理鹽水洗離心管，吸取細胞樣本于離心管中是吸取約0.5mL細胞樣本于1.5mL離心管中，加入生理鹽水離心棄上清是用生理鹽水將細胞懸液定容至250mL，2000rpm離心5min，棄上清；

4)步：加入生理鹽水并混勻是加入100mL生理鹽水混勻細胞，加入人血白蛋白是加入適量人血白蛋白使人血白蛋白終濃度為1％，取出細胞懸液樣品是取出約1.5mL細胞樣品，留樣凍于冰箱是留樣凍于-80℃冰箱，過細胞篩后轉(zhuǎn)入細胞轉(zhuǎn)移袋是過細胞篩后，通過60mL注射器連接100mL細胞轉(zhuǎn)移袋；所述細胞篩是100μm細胞篩。

作為優(yōu)化，(1)全血檢驗與血樣保存步：采血前，先根據(jù)淋巴細胞絕對值計算采血量，計算公式：采血量mL＝80/淋巴細胞絕對值，將采血管用75％酒精噴灑消毒后放入生物安全柜，顛倒混勻，開啟采血管；用移液管將原血從采血管中轉(zhuǎn)移至離心管中是用10mL移液管將血液從采血管中轉(zhuǎn)移至250mL離心管中；取出血樣用于微生物檢測、取血樣于凍存管中冷藏保存是取1mL血液于1.5mL凍存管中，保存在-80℃冰箱。

作為優(yōu)化，(2)血漿處理步：盛有血液的離心管是盛有血液的250mL離心管；配平后離心是配平后，2500rpm升10降10離心10min；滅活是滅活30min；滅活后離心是滅活后，3000rpm離心10min；留上清FicoLL保存待用是留上清FicoLL，將處理好的血漿置于4℃保存待用。

作為優(yōu)化，(3)分離單核細胞步：盛有FicoLL的離心管是分別加入15mLFicoLL的離心管，每個離心管加入稀釋血樣的量為30mL，離心是2000rpm升7降4離心20min；

4)單核細胞洗滌步：將上步收集好的單核細胞稀釋液進行離心棄上清液是將上述收集好的細胞稀釋液進行離心，1600rpm離心10min，棄上清液；混合均勻離心是混合均勻，1200rpm離心8min。

作為優(yōu)化，(3)分離單核細胞步：用移液管小心將生理鹽水血漿層盡量吸棄干凈是用10mL移液管小心將血漿層盡量吸棄干凈，吸取轉(zhuǎn)移到若干離心管中是吸取轉(zhuǎn)移到若干50mL離心管中，添加生理鹽水是等體積添加生理鹽水；

(4)單核細胞洗滌步：再重復加生理鹽水混合均勻離心棄上清液多次，最后收集得到的沉淀即為單核細胞是用生理鹽水定容到45mL，混合均勻，1200rpm離心8min；重復洗滌細胞1次，離心前吸取約0.5mL樣本，赤蘚紅染色計數(shù)，最后收集得到的沉淀即為單核細胞。

更具體包括如下步驟：

(1)全血檢驗與血樣保存：根據(jù)淋巴細胞絕對值計算采血量，計算公式：采血量(mL)＝80/淋巴細胞絕對值。將采血管用75％酒精噴灑消毒后放入生物安全柜，顛倒混勻。開啟采血管，用10mL移液管將血液從采血管中轉(zhuǎn)移至250mL離心管中，反復吹打混勻后取出約0.5mL血液到用于微生物檢測；取1mL血液于1.5mL凍存管中，保存在-80℃冰箱，作為檔案以備后續(xù)檢驗。

(2)血漿處理：將盛有血液的250mL離心管放入離心機中，配平后，2500rpm離心10min(升10降10)。離完心將上層血漿轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，蓋緊蓋子，貼封口膜，置于56℃水浴鍋中滅活30min，滅活后，3000rpm離心10min，棄沉淀，留上清。將處理好的血漿置于4℃保存待用。

(3)分離單核細胞：在原血中加入等體積的生理鹽水，吹打均勻；根據(jù)血液體積計算需要的50mL離心管的個數(shù)，離心管中分別加入15mLFicoLL；用25mL移液管把稀釋后的血樣緩緩加入到盛有FicoLL的離心管中，每管加入30mL血液，旋緊蓋子，2000rpm離心20min(升7降4)。注意血液要加到淋巴分離液的上層，切勿打破分界面。

將上述離心好的樣品輕輕取出離心機放入生物安全柜，在光照下可以看到樣品在離心管里大致分成四層，從上到下依次為生理鹽水血漿層、單核細胞層、FicoLL層、粒細胞紅細胞層。用10mL移液管小心將血漿層盡量吸棄干凈，然后沿離心管壁小心將單核細胞層吸取轉(zhuǎn)移到若干50mL離心管中，等體積添加生理鹽水，旋緊蓋子顛倒混勻。

(4)單核細胞洗滌：將上述收集好的細胞稀釋液進行離心，1600rpm離心10min，棄上清；用生理鹽水定容到45mL，混合均勻，1200rpm離心8min；重復洗滌細胞1次，離心前吸取約0.5mL樣本，赤蘚紅染色計數(shù)。最后收集得到的沉淀即為單核細胞。

(5)單核細胞培養(yǎng)：

Day0+因子1：用50mL無血清培養(yǎng)基重懸細胞，一般情況下細胞接種濃度為1-3×10⁶/mL。向離心管中加入因子1(IFN-γ工作濃度為500-1000U/mL)，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到T175的培養(yǎng)瓶中，旋緊瓶蓋(透氣蓋)，置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

Day1+因子2：培養(yǎng)24h后，加入因子2(由CD3McAb、CD28McAb、IL-2及IL-1α等配制而成，CD3McAb工作濃度為50-100ng/mL、CD28McAb工作濃度為50-100ng/mL、IL-2工作濃度為500-1000U/mL，IL-1α工作濃度為500-1000U/mL)。以后擴增細胞加入培養(yǎng)基時，要在新鮮的培養(yǎng)基中按1000-2000U/mL加入IL-2。

Day3+50：細胞培養(yǎng)三天后，在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，觀察的指標包括：細胞形態(tài)變化(體積、形狀等)、數(shù)量(集落)變化、培養(yǎng)基顏色變化等；一般情況下細胞體積明顯增大，形狀多呈增殖分裂狀，細胞集落出現(xiàn)、細胞數(shù)量增多、培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色，因為隨著細胞數(shù)量的增多，其代謝產(chǎn)物也會增多，會導致培養(yǎng)體系PH的變化而引起培養(yǎng)基顏色改變，這種情況下，要給培養(yǎng)體系加入新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基以滿足細胞生長的需要，體積定量為50mL。

Day5+100：隨著細胞進入快速增殖期，生長迅速，需要每日對細胞進行觀察，觀察指標同Day3，并補加新鮮已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基，體積定量為100mL

Day7BC(Bag CuLtivation)：顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，觀察指標同Day5；在生物安全柜中用10mL移液管反復吹打混勻細胞，取出約0.5mL細胞懸液于1.5mL離心管中，用赤蘚紅染色計算細胞密度，當細胞密度達到1.0×10⁶時，通過60mL注射器連接細胞培養(yǎng)袋，將T175細胞培養(yǎng)瓶中的細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中，用400mL新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基分2次洗滌T175培養(yǎng)瓶，將洗滌培養(yǎng)基合并至細胞培養(yǎng)袋中

Day10+600：間隔四天后，一般情況下培養(yǎng)基顏色明顯變黃，細胞數(shù)量明顯增多，補加600mL新鮮培養(yǎng)基，操作同day7BC。

Day12MT(MicrobioLogicaL Tests)：細胞收獲前兩天，要對培養(yǎng)體系做微生物檢測。將細胞培養(yǎng)袋放入生物安全柜中，擠壓袋子，混勻體系，打開培養(yǎng)袋取樣管蓋子，用5mL注射器抽取約1mL細胞樣本，做微生物檢測

Day14H(Harvest)：

1)從培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)袋，置于生物安全柜中，將細胞懸液從細胞培養(yǎng)袋中轉(zhuǎn)入若干250mL離心管中，擰緊蓋子，配平后置于離心機中，2000rpm離心5min，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊；

2)用25mL×3次生理鹽水(已加入適量人血白蛋白)洗離心管，細胞懸液并入另一離心管中，共75mL；依此操作，將四個離心管并為兩個，2000rpm離心5min，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊；

3)用50mL×2次生理鹽水(已加入適量人血白蛋白)洗離心管，合并細胞懸液，共100mL，吸取約0.5mL細胞樣本于1.，5mL離心管中，交予質(zhì)量人員進行細胞計數(shù)，用生理鹽水將細胞懸液定容至250mL，2000rpm離心5min，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊；

4)加入100mL生理鹽水混勻細胞，加入適量人血白蛋白(終濃度為1％)；取出約1.5mL細胞樣品，交給質(zhì)量部進行內(nèi)毒素及微生物檢測，并留樣凍于-80℃冰箱待后續(xù)檢測，細胞懸液過100μm的細胞篩后，通過60mL注射器連接100mL細胞轉(zhuǎn)移袋，將細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞轉(zhuǎn)移袋中，用封管熱合器封口，待出廠檢測。

本發(fā)明制備方法制取的單核細胞檢測方法包括：

(1)細胞數(shù)量與活性檢測：將Day14-4)步中制取的細胞樣本混勻，取細胞懸液用赤蘚紅染色，經(jīng)血球計數(shù)板進行多次計數(shù)，根據(jù)平均值算出細胞的數(shù)量與活性，細胞數(shù)量要求3-6×10⁹，細胞活性要求≥95％；

(2)細胞無菌檢測：將Day14-4)步中制取的細胞樣本混勻，取適量分別接種到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和大豆酪蛋白流體培養(yǎng)基中，置于37℃生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，兩日后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基仍為澄清則說明結(jié)果為陰性；

除此之外，還對全血、第一次細胞接種、Day7BC及Day710+600步、細胞收獲前兩天Day12MT、出廠時分別做一次血平板檢測，用這兩種方法監(jiān)控細胞有無細菌污染；

(3)支原體檢測：用支原體檢測試劑盒進行檢測；

(4)內(nèi)毒素檢測：用鱟試劑凝膠法對細胞樣本進行檢測，內(nèi)毒素標準≤0.25EU；

(5)細胞表型檢測：根據(jù)每種抗體1x 10⁶個細胞計算需要的細胞數(shù)，需要陰性對照管，生理鹽水洗滌細胞，標記抗體，去除未標記的抗體，流式細胞儀進行檢測，將檢測結(jié)果用相關(guān)軟件進行分析，CD3+CD56+所占的比例≥30％。

作為優(yōu)化，(1)細胞數(shù)量與活性檢測中：取細胞懸液用赤蘚紅染色是取20μL細胞懸液用20μL赤蘚紅染色；

(2)細胞無菌檢測中：兩日后觀察結(jié)果是48-72h后觀察結(jié)果；

(3)支原體檢測：用支原體檢測試劑盒進行檢測是將Day12MT步中制取的細胞樣本混勻，取適量用于支原體檢測；

(4)內(nèi)毒素檢測步驟如下：

1)標準品處理：向內(nèi)毒素檢測標準品加入BET水進行稀釋，按照鱟試劑規(guī)格稀釋成2λ的液體備用；

2)鱟試劑處理：設(shè)置一組陰性對照一組陽性對照，加上Day14-4)步中制取的細胞樣本，每組兩支，加入0.1mLBET水溶解，陽性對照組加入0.1mL 2λ的標準品，陰性對照組加入0.1mLBET水；

3)放在37℃培養(yǎng)箱中30min-60min，觀察結(jié)果，陽性對照凝結(jié)，陰性對照和供試品組不凝結(jié)則說明供試品內(nèi)毒素合格；

(5)細胞表型檢測：去除未標記的抗體是在4℃孵育30min，生理鹽水清洗1-2次，去除未標記的抗體。

更具體是：

(1)細胞數(shù)量與活性檢測：將Day14-4操作中取的細胞樣本混勻，取20μL細胞懸液用20μL赤蘚紅染色，經(jīng)血球計數(shù)板進行多次計數(shù)，根據(jù)平均值算出細胞的數(shù)量與活性，細胞數(shù)量要求3-6×10⁹，細胞活性要求≥95％。

(2)細胞無菌檢測：將Day14-4操作中取的細胞樣本混勻，取適量分別接種到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和大豆酪蛋白流體培養(yǎng)基中，置于37℃生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，48-72h后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基仍為澄清則說明結(jié)果為陰性。

除此之外，還需要對全血、第一次細胞接種、BC及+600操作、細胞收獲前兩天(Day12MT)、出廠時分別做一次血平板檢測。用這兩種方法可以監(jiān)控細胞有無細菌污染。

(3)支原體檢測：支原體個體小，較一般細菌更難檢測，本公司用支原體檢測試劑盒進行檢測。方法是將Day12MT操作中取的細胞樣本混勻，取適量用于支原體檢測。

(4)內(nèi)毒素檢測：用鱟試劑凝膠法對細胞樣本進行檢測。內(nèi)毒素標準≤0.25EU。操作如下：

1)標準品處理：向內(nèi)毒素檢測標準品加入BET水進行稀釋，按照鱟試劑規(guī)格稀釋成2λ的液體備用；

2)鱟試劑處理：設(shè)置一組陰性對照一組陽性對照，加上Day14-4操作中取的細胞樣本，每組兩支，加入0.1mLBET水溶解，陽性對照組加入0.1mL 2λ的標準品，陰性對照組加入0.1mLBET水。

3)放在37℃培養(yǎng)箱中30min-60min，觀察結(jié)果，陽性對照凝結(jié)，陰性對照和供試品組不凝結(jié)則說明供試品內(nèi)毒素合格。

(5)細胞表型檢測：根據(jù)每種抗體1x 10⁶個細胞計算需要的細胞數(shù)，需要陰性對照管，生理鹽水洗滌細胞，標記抗體，在4℃孵育30min，生理鹽水清洗1-2次，去除未標記的抗體，流式細胞儀進行檢測，將檢測結(jié)果用相關(guān)軟件進行分析，CD3+CD56+所占的比例≥30％。

該方法采血量少，不使用單采機，對患者免疫系統(tǒng)沒有破化；全程采用無血清培養(yǎng)，避免了外源潛在的病源微生物的感染；制備工藝穩(wěn)定，操作簡單；明顯提高CIK細胞增殖倍數(shù)和細胞毒活性，擴增細胞倍數(shù)達200-1000倍以上，CD3+CD56+雙陽表達率≥30％。

本發(fā)明是：根據(jù)淋巴細胞絕對值計算采血量(采血量＝80/淋巴細胞絕對值)，無菌采集健康人或患者外周血，生理鹽水等倍稀釋后，用Ficoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞；在CIK細胞誘導過程中，先后加入因子1(IFN-γ)和因子2(CD3mAb、CD28mAb、IL-2及IL-1α)，經(jīng)過2-3周的無血清培養(yǎng)收獲細胞，制成CIK細胞制劑。

采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明高效CIK細胞制備及檢測方法具有避免了外源潛在的病源微生物的感染，制備工藝穩(wěn)定，操作簡單；明顯提高CIK細胞增殖倍數(shù)和細胞毒活性的優(yōu)點。

附圖說明

圖1是本發(fā)明高效CIK細胞制備及檢測方法的CIK細胞原代分離培養(yǎng)流程示意圖；

圖2是本發(fā)明高效CIK細胞制備及檢測方法的CIK細胞收獲操作流程示意圖。

具體實施方式

本發(fā)明高效CIK細胞制備方法包括如下步驟：

(1)全血檢驗與血樣保存：用移液管將原血從采血管中轉(zhuǎn)移至離心管中，反復吹打混勻后：取出血樣用于微生物檢測、取血樣于凍存管中冷藏保存，作為檔案以備后續(xù)檢驗；

(2)血漿處理：將盛有原血的離心管放入離心機中，配平后離心，將上層血漿轉(zhuǎn)移到離心管中，蓋緊蓋子，貼封口膜，置于56℃水浴鍋中滅活，滅活后離心棄沉淀，留上清FicoLL保存待用；

(3)分離單核細胞：在原血中加入等體積的生理鹽水，吹打均勻得稀釋血樣；用移液管把稀釋血樣緩緩加入到盛有FicoLL的離心管中，旋緊蓋子離心；稀釋血樣要加到FicoLL的上層，切勿打破分界面；

將上述離心好的樣品輕輕取出離心機放入生物安全柜，在光照下可以看到樣品在離心管里大致分成四層，從上到下依次為生理鹽水血漿層、單核細胞層、FicoLL層、粒細胞紅細胞層；用移液管小心將生理鹽水血漿層盡量吸棄干凈，然后沿離心管壁小心將單核細胞層吸取轉(zhuǎn)移到若干離心管中，添加生理鹽水，旋緊蓋子顛倒混勻得單核細胞稀釋液；

(4)單核細胞洗滌：將上步收集好的單核細胞稀釋液進行離心棄上清液；再重復加生理鹽水混合均勻離心棄上清液多次，最后收集得到的沉淀即為單核細胞；

(5)單核細胞培養(yǎng)。

具體：單核細胞培養(yǎng)是：

Day0+因子1：用無血清培養(yǎng)基重懸(4)步單核細胞，加入IFN-γ因子1得細胞懸液，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，旋緊透氣瓶蓋，置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；

Day1+因子2：培養(yǎng)后，加入含CD3McAb、CD28McAb、IL-2及IL-1α的因子2置于培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；并根據(jù)需要擴增培養(yǎng)，以后擴增細胞加入培養(yǎng)基時，在新鮮的培養(yǎng)基中加入IL-2的量要加倍；

Day3+50：上步細胞培養(yǎng)三天后，在顯微鏡下觀察到：細胞體積明顯增大，形狀多呈增殖分裂狀，細胞集落出現(xiàn)、細胞數(shù)量增多、培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色時，加入新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基以滿足細胞生長的需要；

Day5+100：隨著細胞進入快速增殖期，生長迅速，需要每日顯微鏡下對細胞進行觀察，觀察指標同上步Day3，并補加新鮮已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基；

Day7BC(Bag CuLtivation)：顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，觀察指標同上步Day5；在生物安全柜中用移液管反復吹打混勻細胞，取出細胞懸液樣于離心管中，用赤蘚紅染色計算細胞密度，當細胞密度達到要求時，通過注射器連接細胞培養(yǎng)袋，將細胞培養(yǎng)瓶中的細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中，用新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基分多次洗滌培養(yǎng)瓶，將洗滌培養(yǎng)基合并至細胞培養(yǎng)袋中；

Day10+600：間隔四天后，培養(yǎng)基顏色明顯變黃，細胞數(shù)量明顯增多，補加新鮮培養(yǎng)基，操作同上步day7BC；

Day12MT(MicrobioLogicaL Tests)：細胞收獲前兩天，對培養(yǎng)體系做微生物檢測；

Day14H(Harvest)：

1)從培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)袋，置于生物安全柜中，將細胞懸液從細胞培養(yǎng)袋中轉(zhuǎn)入若干離心管中，擰緊蓋子，配平后置于離心機中離心棄上清液，用渦旋振蕩器振散細胞團塊；

2)用加入人血白蛋白的生理鹽水洗離心管多次，多次洗得細胞懸液并入另一離心管中，依此操作將離心管合并為至少兩個，離心棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊；

3)用加入人血白蛋白的生理鹽水洗離心管多次，多次洗得細胞懸液并入另一離心管中，吸取細胞樣本于離心管中進行細胞計數(shù)，向合并多次洗得細胞懸液中加入生理鹽水離心棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊；

4)加入生理鹽水并混勻，加入人血白蛋白混勻得細胞懸液；取出細胞懸液樣品進行內(nèi)毒素及微生物檢測，并留樣凍于冰箱待后續(xù)檢測，細胞懸液過細胞篩后轉(zhuǎn)入細胞轉(zhuǎn)移袋中封口，待檢測合格即為制成。

更具體：

Day0+因子1步：細胞接種濃度為1-3×10⁶/mL，IFN-γ工作濃度為500-1000U/mL；

Day1+因子2步：CD3McAb工作濃度為50-100ng/mL、CD28McAb工作濃度為50-100ng/mL、IL-2工作濃度為500-1000U/mL，IL-1α工作濃度為500-1000U/mL；以后擴增細胞加入培養(yǎng)基時，要在新鮮的培養(yǎng)基中按1000-2000U/mL加入IL-2；

Day7BC(Bag CuLtivation)步0細胞密度達到的要求為細胞密度達到1.0×10⁶；

Day14H(Harvest)步：4)加入適量人血白蛋白的終濃度為1％)。

更具體：

Day0+因子1步：重懸細胞的無血清培養(yǎng)基是50mL，培養(yǎng)瓶為T175培養(yǎng)瓶；

Day1+因子2步：培養(yǎng)后是培養(yǎng)24h后；

Day3+50步：加入新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基后，體積定量為50mL；

Day5+100步：補加新鮮已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基，體積定量為100mL；

Day7BC(Bag CuLtivation)步：反復吹打用的移液管為10mL移液管，取出細胞懸液樣于離心管中是取出約0.5mL細胞懸液于1.5mL離心管中，連接細胞培養(yǎng)袋的注射器是60mL注射器，細胞培養(yǎng)瓶是T175細胞培養(yǎng)瓶，用新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基分多次洗滌培養(yǎng)瓶是用400mL新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基分2次洗滌T175培養(yǎng)瓶；

Day10+600步：補加新鮮培養(yǎng)基是補加600mL新鮮培養(yǎng)基；

Day12MT(MicrobioLogicaL Tests)步：對培養(yǎng)體系做微生物檢測是將細胞培養(yǎng)袋放入生物安全柜中，擠壓袋子，混勻體系，打開培養(yǎng)袋取樣管蓋子，用5mL注射器抽取約1mL細胞樣本，做微生物檢測；

Day14H(Harvest)步：

1)步：離心管為250mL離心管，離心是2000rpm離心5min；

2)步：用加入人血白蛋白的生理鹽水洗離心管多次是用已加入適量人血白蛋白的25mL×3次生理鹽水洗離心管，將離心管合并為至少兩個離心棄上清是，將四個離心管并為兩個，2000rpm離心5min，棄上清；

5)步：用加入人血白蛋白的生理鹽水洗離心管多次是用已加入適量人血白蛋白的25mL×2次生理鹽水洗離心管，吸取細胞樣本于離心管中是吸取約0.5mL細胞樣本于1.5mL離心管中，加入生理鹽水離心棄上清是用生理鹽水將細胞懸液定容至250mL，2000rpm離心5min，棄上清；

6)步：加入生理鹽水并混勻是加入100mL生理鹽水混勻細胞，加入人血白蛋白是加入適量人血白蛋白使人血白蛋白終濃度為1％，取出細胞懸液樣品是取出約1.5mL細胞樣品，留樣凍于冰箱是留樣凍于-80℃冰箱，過細胞篩后轉(zhuǎn)入細胞轉(zhuǎn)移袋是過細胞篩后，通過60mL注射器連接100mL細胞轉(zhuǎn)移袋；所述細胞篩是100μm細胞篩。

具體：(1)全血檢驗與血樣保存步：采血前，先根據(jù)淋巴細胞絕對值計算采血量，計算公式：采血量mL＝80/淋巴細胞絕對值，將采血管用75％酒精噴灑消毒后放入生物安全柜，顛倒混勻，開啟采血管；用移液管將原血從采血管中轉(zhuǎn)移至離心管中是用10mL移液管將血液從采血管中轉(zhuǎn)移至250mL離心管中；取出血樣用于微生物檢測、取血樣于凍存管中冷藏保存是取1mL血液于1.5mL凍存管中，保存在-80℃冰箱。

具體：(2)血漿處理步：盛有血液的離心管是盛有血液的250mL離心管；配平后離心是配平后，2500rpm升10降10離心10min；滅活是滅活30min；滅活后離心是滅活后，3000rpm離心10min；留上清FicoLL保存待用是留上清FicoLL，將處理好的血漿置于4℃保存待用。

具體：(3)分離單核細胞步：盛有FicoLL的離心管是分別加入15mLFicoLL的離心管，每個離心管加入稀釋血樣的量為30mL，離心是2000rpm升7降4離心20min；

4)單核細胞洗滌步：將上步收集好的單核細胞稀釋液進行離心棄上清液是將上述收集好的細胞稀釋液進行離心，1600rpm離心10min，棄上清液；混合均勻離心是混合均勻，1200rpm離心8min。

具體：(3)分離單核細胞步：用移液管小心將生理鹽水血漿層盡量吸棄干凈是用10mL移液管小心將血漿層盡量吸棄干凈，吸取轉(zhuǎn)移到若干離心管中是吸取轉(zhuǎn)移到若干50mL離心管中，添加生理鹽水是等體積添加生理鹽水；

具體：(4)單核細胞洗滌步：再重復加生理鹽水混合均勻離心棄上清液多次，最后收集得到的沉淀即為單核細胞是用生理鹽水定容到45mL，混合均勻，1200rpm離心8min；重復洗滌細胞1次，離心前吸取約0.5mL樣本，赤蘚紅染色計數(shù)，最后收集得到的沉淀即為單核細胞。

本發(fā)明制備方法制取的單核細胞檢測方法包括：

(1)細胞數(shù)量與活性檢測：將Day14-4)步中制取的細胞樣本混勻，取細胞懸液用赤蘚紅染色，經(jīng)血球計數(shù)板進行多次計數(shù)，根據(jù)平均值算出細胞的數(shù)量與活性，細胞數(shù)量要求3-6×10⁹，細胞活性要求≥95％；

(2)細胞無菌檢測：將Day14-4)步中制取的細胞樣本混勻，取適量分別接種到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和大豆酪蛋白流體培養(yǎng)基中，置于37℃生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，兩日后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基仍為澄清則說明結(jié)果為陰性；

除此之外，還對全血、第一次細胞接種、Day7BC及Day710+600步、細胞收獲前兩天Day12MT、出廠時分別做一次血平板檢測，用這兩種方法監(jiān)控細胞有無細菌污染；

(4)支原體檢測：用支原體檢測試劑盒進行檢測；

(4)內(nèi)毒素檢測：用鱟試劑凝膠法對細胞樣本進行檢測，內(nèi)毒素標準≤0.25EU；

(5)細胞表型檢測：根據(jù)每種抗體1x 10⁶個細胞計算需要的細胞數(shù)，需要陰性對照管，生理鹽水洗滌細胞，標記抗體，去除未標記的抗體，流式細胞儀進行檢測，將檢測結(jié)果用相關(guān)軟件進行分析，CD3+CD56+所占的比例≥30％。

具體：

(1)細胞數(shù)量與活性檢測中：取細胞懸液用赤蘚紅染色是取20μL細胞懸液用20μL赤蘚紅染色；

(2)細胞無菌檢測中：兩日后觀察結(jié)果是48-72h后觀察結(jié)果；

(3)支原體檢測：用支原體檢測試劑盒進行檢測是將Day12MT步中制取的細胞樣本混勻，取適量用于支原體檢測；

(4)內(nèi)毒素檢測步驟如下：

1)標準品處理：向內(nèi)毒素檢測標準品加入BET水進行稀釋，按照鱟試劑規(guī)格稀釋成2λ的液體備用；

2)鱟試劑處理：設(shè)置一組陰性對照一組陽性對照，加上Day14-4)步中制取的細胞樣本，每組兩支，加入0.1mLBET水溶解，陽性對照組加入0.1mL 2λ的標準品，陰性對照組加入0.1mLBET水；

3)放在37℃培養(yǎng)箱中30min-60min，觀察結(jié)果，陽性對照凝結(jié)，陰性對照和供試品組不凝結(jié)則說明供試品內(nèi)毒素合格；

(5)細胞表型檢測：去除未標記的抗體是在4℃孵育30min，生理鹽水清洗1-2次，去除未標記的抗體。

更具體如下：

本發(fā)明高效CIK細胞制備及檢測方法實施例一：

中衛(wèi)華醫(yī)(北京)生物科技有限公司高效CIK細胞制備及檢測SOP

一、目的：1、規(guī)定了本公司高效CIK細胞制備的標準操作規(guī)程。2、規(guī)范高效CIK細胞質(zhì)量檢測的操作，避免人為錯誤。

二、范圍：中衛(wèi)華醫(yī)細胞醫(yī)學中心實驗室。

三、權(quán)責：QA主管負責文件審核并將文交由質(zhì)量部經(jīng)理負責批準，QC負責對本操作規(guī)程進行實施。

四、主要儀器、試劑與耗材：

1主要儀器：

2主要試劑：人淋巴細胞分離液、注射用生理鹽水、淋巴細胞無血清培養(yǎng)基(Corning88-581-CM)、注射用IFN-γ、IL-2、IL-1α、CD3McAb、CD28McAb、人血白蛋白、赤蘚紅染色劑、鱟試劑檢測試劑盒、支原體檢測試劑盒、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、大豆酪蛋白流體培養(yǎng)基、APC-CD56、PE-CD8、PerCP-CD3。

3耗材：5mL注射器、50mL注射器、T175細胞培養(yǎng)瓶、50mL離心管、250mL離心管、10mL移液管、25mL移液管、肝素抗凝管、細胞轉(zhuǎn)移袋、細胞培養(yǎng)袋、100μm細胞篩網(wǎng)、滅菌進口1000μL槍頭、封口膜、

五.操作內(nèi)容：

1.生產(chǎn)前準備：潔凈室通風循環(huán)系統(tǒng)正常工作30min，進入潔凈室打開生物安全柜紫外燈設(shè)置30min，打開整個潔凈區(qū)紫外燈進行消毒滅菌。水浴鍋打開設(shè)置工作溫度為56℃。將FicoLL1.077g/mL淋巴細胞分離液、無血清培養(yǎng)基KBM 581以及IFN-γ置于冰箱外部恢復室溫。

2.人外周血單核細胞分離：

2.1分離前準備：在操作中，所需物品都需要用75％酒精消毒后才能放入生物安全柜。物品放入安全柜時要從右手進入，用完后從左手出。廢液缸放在左手邊，一般常用的物品如槍頭、移液器、移液管、剪刀、止血鉗等放在右手邊；不常用的物品可放在左手靠里的位置。操作過程中，不許左右手交叉操作，不許將手放在打開的無菌容器或培養(yǎng)瓶的上方。

2.2全血檢驗與血樣保存：根據(jù)淋巴細胞絕對值計算采血量，計算公式：采血量mL＝80/淋巴細胞絕對值。將采血管用75％酒精噴灑消毒后放入生物安全柜，顛倒混勻。開啟采血管，用10mL移液管將血液從采血管中轉(zhuǎn)移至250mL離心管中，反復吹打混勻后取出約0.5mL血液到用于微生物檢測；取1mL血液于1.5mL凍存管中，保存在-80℃冰箱，作為檔案以備后續(xù)檢驗。

2.3血漿處理：將盛有血液的250mL離心管放入離心機中，配平后，2500rpm離心10min，升10降10。離完心將上層血漿轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，蓋緊蓋子，貼封口膜，置于56℃水浴鍋中滅活30min，滅活后，3000rpm離心10min，棄沉淀，留上清。將處理好的血漿置于4℃保存待用。

2.4分離單核細胞：在原血中加入等體積的生理鹽水，吹打均勻；根據(jù)血液體積計算需要的50mL離心管的個數(shù)，離心管中分別加入15mLFicoLL；用25mL移液管把稀釋后的血樣緩緩加入到盛有FicoLL的離心管中，每管加入30mL血液，旋緊蓋子，2000rpm離心20min，升7降4。注意血液要加到淋巴分離液的上層，切勿打破分界面。

將上述離心好的樣品輕輕取出離心機放入生物安全柜，在光照下可以看到樣品在離心管里大致分成四層，從上到下依次為生理鹽水血漿層、單核細胞層、FicoLL層、粒細胞紅細胞層。用10mL移液管小心將血漿層盡量吸棄干凈，然后沿離心管壁小心將單核細胞層吸取轉(zhuǎn)移到若干50mL離心管中，等體積添加生理鹽水，旋緊蓋子顛倒混勻。

2.5單核細胞洗滌：將上述收集好的細胞稀釋液進行離心，1600rpm離心10min，棄上清；用生理鹽水定容到45mL，混合均勻，1200rpm離心8min；重復洗滌細胞1次，離心前吸取約0.5mL樣本，赤蘚紅染色計數(shù)。最后收集得到的沉淀即為單核細胞。

3.單核細胞培養(yǎng)：

Day0+因子1：用50mL無血清培養(yǎng)基重懸細胞，一般情況下細胞接種濃度為1-3×10⁶/mL。向離心管中加入因子1，IFN-γ工作濃度為500-1000U/mL，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到T175的培養(yǎng)瓶中，旋緊瓶蓋(透氣蓋)，置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

Day1+因子2：培養(yǎng)24h后，加入因子2：由CD3McAb、CD28McAb、IL-2及IL-1α等配制而成，CD3McAb工作濃度為50-100ng/mL、CD28McAb工作濃度為50-100ng/mL、IL-2工作濃度為500-1000U/mL，IL-1α工作濃度為500-1000U/mL。以后擴增細胞加入培養(yǎng)基時，要在新鮮的培養(yǎng)基中按1000-2000U/mL加入IL-2。

Day3+50：細胞培養(yǎng)三天后，在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，觀察的指標包括：細胞形態(tài)變化：體積、形狀等、數(shù)量或集落變化、培養(yǎng)基顏色變化等；一般情況下細胞體積明顯增大，形狀多呈增殖分裂狀，細胞集落出現(xiàn)、細胞數(shù)量增多、培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色，因為隨著細胞數(shù)量的增多，其代謝產(chǎn)物也會增多，會導致培養(yǎng)體系PH的變化而引起培養(yǎng)基顏色改變，這種情況下，要給培養(yǎng)體系加入新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基以滿足細胞生長的需要，體積定量為50mL。

Day5+100：隨著細胞進入快速增殖期，生長迅速，需要每日對細胞進行觀察，觀察指標同Day3，并補加新鮮已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基，體積定量為100mL

Day7BC即Bag CuLtivation：顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，觀察指標同Day5；在生物安全柜中用10mL移液管反復吹打混勻細胞，取出約0.5mL細胞懸液于1.5mL離心管中，用赤蘚紅染色計算細胞密度，當細胞密度達到1.0×10⁶時，通過60mL注射器連接細胞培養(yǎng)袋，將T175細胞培養(yǎng)瓶中的細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中，用400mL新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基分2次洗滌T175培養(yǎng)瓶，將洗滌培養(yǎng)基合并至細胞培養(yǎng)袋中。

Day10+600：間隔四天后，一般情況下培養(yǎng)基顏色明顯變黃，細胞數(shù)量明顯增多，補加600mL新鮮培養(yǎng)基，操作同day7BC。

Day12MT即MicrobioLogicaL Tests：細胞收獲前兩天，要對培養(yǎng)體系做微生物檢測。將細胞培養(yǎng)袋放入生物安全柜中，擠壓袋子，混勻體系，打開培養(yǎng)袋取樣管蓋子，用5mL注射器抽取約1mL細胞樣本，做微生物檢測。

Day14H即Harvest：

1)從培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)袋，置于生物安全柜中，將細胞懸液從細胞培養(yǎng)袋中轉(zhuǎn)入若干250mL離心管中，擰緊蓋子，配平后置于離心機中，2000rpm離心5min，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊；

2)用25mL×3次已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗離心管，細胞懸液并入另一離心管中，共75mL；依此操作，將四個離心管并為兩個，2000rpm離心5min，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊；

3)用50mL×2次已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗離心管，合并細胞懸液，共100mL，吸取約0.5mL細胞樣本于1.5mL離心管中，交予質(zhì)量人員進行細胞計數(shù)，用生理鹽水將細胞懸液定容至250mL，2000rpm離心5min，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊；

4)加入100mL生理鹽水混勻細胞，加入適量人血白蛋白使終濃度為1％；取出約1.5mL細胞樣品，交給質(zhì)量部進行內(nèi)毒素及微生物檢測，并留樣凍于-80℃冰箱待后續(xù)檢測，細胞懸液過100μm的細胞篩后，通過60mL注射器連接100mL細胞轉(zhuǎn)移袋，將細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞轉(zhuǎn)移袋中，用封管熱合器封口，待出廠檢測。

4.細胞檢測：

4.1細胞數(shù)量與活性檢測：將Day14-4)操作中取的細胞樣本混勻，取20μL細胞懸液用20μL赤蘚紅染色，經(jīng)血球計數(shù)板進行多次計數(shù)，根據(jù)平均值算出細胞的數(shù)量與活性，細胞數(shù)量要求3-6×10⁹，細胞活性要求≥95％。

4.2細胞無菌檢測：將Day14-4)操作中取的細胞樣本混勻，取適量分別接種到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和大豆酪蛋白流體培養(yǎng)基中，置于37℃生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，48-72h后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基仍為澄清則說明結(jié)果為陰性。

除此之外，還需要對全血、第一次細胞接種、BC及+600操作、細胞收獲前兩天即Day12MT時和出廠時分別做一次血平板檢測。用這兩種方法可以監(jiān)控細胞有無細菌污染。

4.3支原體檢測：支原體個體小，較一般細菌更難檢測，本公司用支原體檢測試劑盒進行檢測。方法是將Day12MT操作中取的細胞樣本混勻，取適量用于支原體檢測。

4.4內(nèi)毒素檢測：本公司用鱟試劑凝膠法對細胞樣本進行檢測。內(nèi)毒素標準≤0.25EU。操作如下：

準品處理：向內(nèi)毒素檢測標準品加入BET水進行稀釋，按照鱟試劑規(guī)格稀釋成2λ的液體備用。

鱟試劑處理：設(shè)置一組陰性對照一組陽性對照，加上Day14-4)操作中取的細胞樣本，每組兩支，加入0.1mLBET水溶解，陽性對照組加入0.1mL 2λ的標準品，陰性對照組加入0.1mLBET水。

放在37℃培養(yǎng)箱中30min-60min，觀察結(jié)果，陽性對照凝結(jié)，陰性對照和供試品組不凝結(jié)則說明供試品內(nèi)毒素合格。

4.5細胞表型檢測：

根據(jù)每種抗體1x 10⁶個細胞計算需要的細胞數(shù)，需要陰性對照管，生理鹽水洗滌細胞，標記抗體，在4℃孵育30min，生理鹽水清洗1-2次，去除未標記的抗體，流式細胞儀進行檢測，將檢測結(jié)果用相關(guān)軟件進行分析，CD3+CD56+所占的比例≥30％。

實施例二，本發(fā)明高效CIK細胞制備及檢測方法與上述實施例一的區(qū)別僅在于：4.1細胞數(shù)量與活性檢測中：細胞數(shù)量要求3-4×10⁹；4.2細胞無菌檢測中：48h后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基仍為澄清則說明結(jié)果為陰性。4.5細胞表型檢測中：生理鹽水清洗1次。

實施例二，本發(fā)明高效CIK細胞制備及檢測方法與上述實施例一的區(qū)別僅在于：4.1細胞數(shù)量與活性檢測中：細胞數(shù)量要求5-6×10⁹；4.2細胞無菌檢測中：72h后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基仍為澄清則說明結(jié)果為陰性。生理鹽水清洗2次。

以上實例，還可進一步參見后附的CIK細胞制備流程表。

本發(fā)明是根據(jù)淋巴細胞絕對值計算采血量，無菌采集健康人或患者外周血，生理鹽水稀釋后，用Ficoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞；在CIK細胞誘導過程中，先后加入因子1和因子2，經(jīng)過2-3周的無血清培養(yǎng)收獲細胞，制成CIK細胞制劑。具有制備工藝穩(wěn)定，操作簡單，明顯提高CIK細胞增殖倍數(shù)和細胞活性的優(yōu)點。附CIK細胞制備流程表如下：