1.一種高效CIK細(xì)胞制備方法，其特征在于包括如下步驟：
(1)全血檢驗與血樣保存：用移液管將原血從采血管中轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打混勻后：取出血樣用于微生物檢測、取血樣于凍存管中冷藏保存，作為檔案以備后續(xù)檢驗；
(2)血漿處理：將盛有原血的離心管放入離心機(jī)中，配平后離心，將上層血漿轉(zhuǎn)移到離心管中，蓋緊蓋子，貼封口膜，置于56℃水浴鍋中滅活，滅活后離心棄沉淀，留上清保存待用；
(3)分離單核細(xì)胞：在原血中加入等體積的生理鹽水，吹打均勻得稀釋血樣；用移液管把稀釋血樣緩緩加入到盛有FicoLL的離心管中，旋緊蓋子離心；稀釋血樣要加到FicoLL的上層，切勿打破分界面；
將上述離心好的樣品輕輕取出離心機(jī)放入生物安全柜，在光照下可以看到樣品在離心管里大致分成四層，從上到下依次為生理鹽水血漿層、單核細(xì)胞層、FicoLL層、粒細(xì)胞紅細(xì)胞層；用移液管小心將生理鹽水血漿層盡量吸棄干凈，然后沿離心管壁小心將單核細(xì)胞層吸取轉(zhuǎn)移到若干離心管中，添加生理鹽水，旋緊蓋子顛倒混勻得單核細(xì)胞稀釋液；
(4)單核細(xì)胞洗滌：將上步收集好的單核細(xì)胞稀釋液進(jìn)行離心棄上清液；再重復(fù)加生理鹽水混合均勻離心棄上清液多次，最后收集得到的沉淀即為單核細(xì)胞；
(5)單核細(xì)胞培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于單核細(xì)胞培養(yǎng)是：
Day0+因子1：用無血清培養(yǎng)基重懸(4)步單核細(xì)胞，加入IFN-γ因子1得細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，旋緊透氣瓶蓋，置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；
Day1+因子2：培養(yǎng)后，加入含CD3McAb、CD28McAb、IL-2及IL-1α的因子2置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；并根據(jù)需要擴(kuò)增培養(yǎng)，以后擴(kuò)增細(xì)胞加入培養(yǎng)基時，在新鮮的培養(yǎng)基中加入IL-2的量要加倍；
Day3+50：上步細(xì)胞培養(yǎng)三天后，在顯微鏡下觀察到：細(xì)胞體積明顯增大，形狀多呈增殖分裂狀，細(xì)胞集落出現(xiàn)、細(xì)胞數(shù)量增多、培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色時，加入新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基以滿足細(xì)胞生長的需要；
Day5+100：隨著細(xì)胞進(jìn)入快速增殖期，生長迅速，需要每日顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行觀察，觀察指標(biāo)同上步Day3，并補(bǔ)加新鮮已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基；
Day7 BC：顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，觀察指標(biāo)同上步Day5；在生物安全柜中用移液管反復(fù)吹打混勻細(xì)胞，取出細(xì)胞懸液樣于離心管中，用赤蘚紅染色計算細(xì)胞密度，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到要求時，通過注射器連接細(xì)胞培養(yǎng)袋，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，用新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基分多次洗滌培養(yǎng)瓶，將洗滌培養(yǎng)基合并至細(xì)胞培養(yǎng)袋中；
Day10+600：間隔四天后，培養(yǎng)基顏色明顯變黃，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，操作同上步day7 BC；
Day12 MT：細(xì)胞收獲前兩天，對培養(yǎng)體系做微生物檢測；
Day14 H：
1)從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)袋，置于生物安全柜中，將細(xì)胞懸液從細(xì)胞培養(yǎng)袋中轉(zhuǎn)入若干離心管中，擰緊蓋子，配平后置于離心機(jī)中離心棄上清液，用渦旋振蕩器振散細(xì)胞團(tuán)塊；
2)用加入人血白蛋白的生理鹽水洗離心管多次，多次洗得細(xì)胞懸液并入另一離心管中，依此操作將離心管合并為至少兩個，離心棄上清，用渦旋振蕩器振散細(xì)胞團(tuán)塊；
3)用加入人血白蛋白的生理鹽水洗離心管多次，多次洗得細(xì)胞懸液并入另一離心管中，吸取細(xì)胞樣本于離心管中進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，向合并多次洗得細(xì)胞懸液中加入生理鹽水離心棄上清，用渦旋振蕩器振散細(xì)胞團(tuán)塊；
4)加入生理鹽水并混勻，加入人血白蛋白混勻得細(xì)胞懸液；取出細(xì)胞懸液樣品進(jìn)行內(nèi)毒素及微生物檢測，并留樣凍于冰箱待后續(xù)檢測，細(xì)胞懸液過細(xì)胞篩后轉(zhuǎn)入細(xì)胞轉(zhuǎn)移袋中封口，待檢測合格即為制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于
Day0+因子1步：細(xì)胞接種濃度為1-3×106/mL，IFN-γ工作濃度為500-1000U/mL；
Day1+因子2步：CD3McAb工作濃度為50-100ng/mL、CD28McAb工作濃度為50-100ng/mL、IL-2工作濃度為500-1000U/mL，IL-1α工作濃度為500-1000U/mL；以后擴(kuò)增細(xì)胞加入培養(yǎng)基時，要在新鮮的培養(yǎng)基中按1000-2000U/mL加入IL-2；
Day7 BC步：細(xì)胞密度達(dá)到的要求為細(xì)胞密度達(dá)到1.0×106；
Day14 H步：4)加入適量人血白蛋白的終濃度為1％)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于
Day0+因子1步：重懸細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基是50mL，培養(yǎng)瓶為T175培養(yǎng)瓶；
Day1+因子2步：培養(yǎng)后是培養(yǎng)24h后；
Day3+50步：加入新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基后，體積定量為50mL；
Day5+100步：補(bǔ)加新鮮已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基，體積定量為100mL；
Day7 BC步：反復(fù)吹打用的移液管為10mL移液管，取出細(xì)胞懸液樣于離心管中是取出約0.5mL細(xì)胞懸液于1.5mL離心管中，連接細(xì)胞培養(yǎng)袋的注射器是60mL注射器，細(xì)胞培養(yǎng)瓶是T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基分多次洗滌培養(yǎng)瓶是用400mL新鮮的已加入IL-2的無血清培養(yǎng)基分2次洗滌T175培養(yǎng)瓶；
Day10+600步：補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基是補(bǔ)加600mL新鮮培養(yǎng)基；
Day12 MT步：對培養(yǎng)體系做微生物檢測是將細(xì)胞培養(yǎng)袋放入生物安全柜中，擠壓袋子，混勻體系，打開培養(yǎng)袋取樣管蓋子，用5mL注射器抽取約1mL細(xì)胞樣本，做微生物檢測；
Day14 H步：
1)步：離心管為250mL離心管，離心是2000rpm離心5min；
2)步：用加入人血白蛋白的生理鹽水洗離心管多次是用已加入適量人血白蛋白的25mL×3次生理鹽水洗離心管，將離心管合并為至少兩個離心棄上清是，將四個離心管并為兩個，2000rpm離心5min，棄上清；
3)步：用加入人血白蛋白的生理鹽水洗離心管多次是用已加入適量人血白蛋白的25mL×2次生理鹽水洗離心管，吸取細(xì)胞樣本于離心管中是吸取約0.5mL細(xì)胞樣本于1.5mL離心管中，加入生理鹽水離心棄上清是用生理鹽水將細(xì)胞懸液定容至250mL，2000rpm離心5min，棄上清；
4)步：加入生理鹽水并混勻是加入100mL生理鹽水混勻細(xì)胞，加入人血白蛋白是加入適量人血白蛋白使人血白蛋白終濃度為1％，取出細(xì)胞懸液樣品是取出約1.5mL細(xì)胞樣品，留樣凍于冰箱是留樣凍于-80℃冰箱，過細(xì)胞篩后轉(zhuǎn)入細(xì)胞轉(zhuǎn)移袋是過細(xì)胞篩后，通過60mL注射器連接100mL細(xì)胞轉(zhuǎn)移袋；所述細(xì)胞篩是100μm細(xì)胞篩。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述制備方法，其特征在于(1)全血檢驗與血樣保存步：采血前，先根據(jù)淋巴細(xì)胞絕對值計算采血量，計算公式：采血量mL＝80/淋巴細(xì)胞絕對值，將采血管用75％酒精噴灑消毒后放入生物安全柜，顛倒混勻，開啟采血管；用移液管將原血從采血管中轉(zhuǎn)移至離心管中是用10mL移液管將血液從采血管中轉(zhuǎn)移至250mL離心管中；取出血樣用于微生物檢測、取血樣于凍存管中冷藏保存是取1mL血液于1.5mL凍存管中，保存在-80℃冰箱。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述制備方法，其特征在于(2)血漿處理步：盛有血液的離心管是盛有血液的250mL離心管；配平后離心是配平后，2500rpm升10降10離心10min；滅活是滅活30min；滅活后離心是滅活后，3000rpm離心10min；留上清FicoLL保存待用是留上清FicoLL，將處理好的血漿置于4℃保存待用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述制備方法，其特征在于(3)分離單核細(xì)胞步：盛有FicoLL的離心管是分別加入15mLFicoLL的離心管，每個離心管加入稀釋血樣的量為30mL，離心是2000rpm升7降4離心20min；
4)單核細(xì)胞洗滌步：將上步收集好的單核細(xì)胞稀釋液進(jìn)行離心棄上清液是將上述收集好的細(xì)胞稀釋液進(jìn)行離心，1600rpm離心10min，棄上清液；混合均勻離心是混合均勻，1200rpm離心8min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述制備方法，其特征在于(3)分離單核細(xì)胞步：用移液管小心將生理鹽水血漿層盡量吸棄干凈是用10mL移液管小心將血漿層盡量吸棄干凈，吸取轉(zhuǎn)移到若干離心管中是吸取轉(zhuǎn)移到若干50mL離心管中，添加生理鹽水是等體積添加生理鹽水；
(4)單核細(xì)胞洗滌步：再重復(fù)加生理鹽水混合均勻離心棄上清液多次，最后收集得到的沉淀即為單核細(xì)胞是用生理鹽水定容到45mL，混合均勻，1200rpm離心8min；重復(fù)洗滌細(xì)胞1次，離心前吸取約0.5mL樣本，赤蘚紅染色計數(shù)，最后收集得到的沉淀即為單核細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1所述制備方法制取的單核細(xì)胞檢測方法，其特征在于包括：
(1)細(xì)胞數(shù)量與活性檢測：將Day14-4)步中制取的細(xì)胞樣本混勻，取細(xì)胞懸液用赤蘚紅染色，經(jīng)血球計數(shù)板進(jìn)行多次計數(shù)，根據(jù)平均值算出細(xì)胞的數(shù)量與活性，細(xì)胞數(shù)量要求3-6×109，細(xì)胞活性要求≥95％；
(2)細(xì)胞無菌檢測：將Day14-4)步中制取的細(xì)胞樣本混勻，取適量分別接種到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和大豆酪蛋白流體培養(yǎng)基中，置于37℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，兩日后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基仍為澄清則說明結(jié)果為陰性；
除此之外，還對全血、第一次細(xì)胞接種、Day7 BC及Day710+600步、細(xì)胞收獲前兩天Day12 MT、出廠時分別做一次血平板檢測，用這兩種方法監(jiān)控細(xì)胞有無細(xì)菌污染；
(3)支原體檢測：用支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測；
(4)內(nèi)毒素檢測：用鱟試劑凝膠法對細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)≤0.25EU；
(5)細(xì)胞表型檢測：根據(jù)每種抗體1x106個細(xì)胞計算需要的細(xì)胞數(shù)，需要陰性對照管，生理鹽水洗滌細(xì)胞，標(biāo)記抗體，去除未標(biāo)記的抗體，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果用相關(guān)軟件進(jìn)行分析，CD3+CD56+所占的比例≥30％。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述檢測方法，其特征在于
(1)細(xì)胞數(shù)量與活性檢測中：取細(xì)胞懸液用赤蘚紅染色是取20μL細(xì)胞懸液用20μL赤蘚紅染色；
(2)細(xì)胞無菌檢測中：兩日后觀察結(jié)果是48-72h后觀察結(jié)果；
(3)支原體檢測：用支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測是將Day12 MT步中制取的細(xì)胞樣本混勻，取適量用于支原體檢測；
(4)內(nèi)毒素檢測步驟如下：
1)標(biāo)準(zhǔn)品處理：向內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)品加入BET水進(jìn)行稀釋，按照鱟試劑規(guī)格稀釋成2λ的液體備用；
2)鱟試劑處理：設(shè)置一組陰性對照一組陽性對照，加上Day14-4)步中制取的細(xì)胞樣本，每組兩支，加入0.1mLBET水溶解，陽性對照組加入0.1mL 2λ的標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照組加入0.1 mLBET水；
3)放在37℃培養(yǎng)箱中30min-60min，觀察結(jié)果，陽性對照凝結(jié)，陰性對照和供試品組不凝結(jié)則說明供試品內(nèi)毒素合格；
(5)細(xì)胞表型檢測：去除未標(biāo)記的抗體是在4℃孵育30min，生理鹽水清洗1-2次，去除未標(biāo)記的抗體。