本發(fā)明屬于生物化學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種純化牛胎兒骨骼肌組織來源前體脂肪細胞的方法。

背景技術(shù)：

干細胞是可以維持復制和并能分化為不同類型細胞能力的一類細胞，干細胞研究對于理解細胞以及組織的發(fā)生和分化調(diào)控是非常重要的。另外，干細胞研究對于醫(yī)學領(lǐng)域同樣具有巨大的潛力。像很多其他的器官，骨骼肌包含很多細胞類型，能產(chǎn)生肌源性的衛(wèi)星細胞和脂肪組織源性的脂肪細胞，這些對畜牧業(yè)生產(chǎn)都是很重要的。眾所周知，衛(wèi)星細胞對于出生后骨骼肌的生長和成年人的骨骼肌的再生都很重要。過去近50年的對分離的衛(wèi)星細胞的研究主要集中在其增殖的激活和抑制，調(diào)控他們在體外的活性，與其它細胞如血管生成細胞間的互作，亞群間的潛力，以及在基因治療上作為載體的潛力。在肉牛生產(chǎn)中，動物的骨骼肌的生長發(fā)育和肌內(nèi)脂肪的沉積是影響牛肉產(chǎn)量和價格的最主要因素。然而，目前為止對于早期肌肉發(fā)育和肌內(nèi)脂肪發(fā)育的研究相對較少，尤其是不同細胞的干細胞發(fā)育來源，因此鑒定出用于區(qū)分不同來源的干細胞表面分子標記特征，并建立體外誘導分化模型體系對于研究家養(yǎng)動物肌肉和肌內(nèi)脂肪分化具有重要意義。

胚胎干細胞到成肌的、成脂的、成纖維的定向的分子機制仍有很大程度的不明確。然而，質(zhì)量被證實的胚胎干細胞已經(jīng)從數(shù)量有限的哺乳動物物種中分離出來。而且，1981年胚胎干細胞在從來自非人類的實驗小家鼠中分離出來。小鼠多潛能干細胞已經(jīng)被徹底的建立，將其注入到囊胚內(nèi)后將胚胎移植到雌性小鼠體內(nèi)正常生長直至出生。此外，小鼠胚胎干細胞的基因組可以通過轉(zhuǎn)基因和同源重組技術(shù)修飾后?；蚬こ碳毎芙?jīng)生殖系傳遞到后代。多潛能的人類胚胎干細胞系也已被成功建立，同樣具備分化為不同種類細胞的能力。盡管對農(nóng)業(yè)物種胚胎干細胞上投入了大量的努力，但是與鼠和人類的的努力相比尚不是很成功。這項工作的困難性可能有以下幾點，一是農(nóng)業(yè)物種和小鼠相比在胚胎植入前的發(fā)育存在物種的特異性，第二是對于農(nóng)業(yè)動物胚胎發(fā)育所需要的生長因子尚不完全明了，三是在小鼠中有效的干細胞標記是否適用于農(nóng)業(yè)動物尚不知道。然而，快速擴展的干細胞領(lǐng)域的知識，農(nóng)業(yè)物種方面胚胎干細胞的研究也將取得進展。事實上，農(nóng)業(yè)物種的胚胎干細胞發(fā)展研究中具有一個獨特的機會，因為它們可以用來開展生殖系的試驗，通過注入到胚胎內(nèi)轉(zhuǎn)移到代孕的母體內(nèi)，然而此項試驗在人類胚胎干細胞中是被禁止的。除此之外，小鼠胚胎干細胞應(yīng)該是可以的(從遺傳學角度看有這個能力去被操作)，作為衛(wèi)星細胞發(fā)展和功能研究的平臺。在將來，如果來自農(nóng)業(yè)動物的胚胎干細胞種系得到發(fā)展了，小鼠干細胞研究可能就會轉(zhuǎn)移到農(nóng)業(yè)物種骨骼肌發(fā)育的動力學應(yīng)用研究中。

在哺乳動物中，大部分骨骼肌結(jié)構(gòu)是在胎兒期生長發(fā)育期完成的。主要肌纖維開始形成是在胚胎期，次級肌纖維生成是在人妊娠中期和后期，鼠的晚期和新生兒期。肌細胞生成受一系列轉(zhuǎn)錄因子控制，包括Pax3、Pax7，Gli和四個肌源性調(diào)節(jié)因子包括MyoD,Myf-5,肌細胞生成素和MRF-4。次級肌纖維在脂肪細胞形成，纖維生成重疊部分的形成是在人，豬，牛，羊，馬，雞的妊娠中期和嚙齒動物妊娠后期。肌源性的，脂肪性的和纖維性干細胞是由胚胎干細胞分化產(chǎn)生。骨骼肌干細胞由肌源性轉(zhuǎn)換成脂肪性可能會增加肌內(nèi)脂肪沉積。一個纖維/脂肪祖母細胞可能存在骨骼肌中，對肌內(nèi)脂肪堆積就像纖維那樣在疾病方面有影響。

肌肉細胞和脂肪細胞從間充質(zhì)細胞中產(chǎn)生，間充質(zhì)細胞存在于早起發(fā)育階段，尤其在胎兒期和新生兒階段的骨骼肌中。當大部分的間充質(zhì)干細胞分化變成肌細胞時候，其中一小部分區(qū)別變成脂肪細胞——肌內(nèi)脂肪堆積的基礎(chǔ)。在細胞命運中關(guān)鍵因子是Wnt家族蛋白，這些蛋白是旁分泌生長調(diào)節(jié)劑，在細胞發(fā)展中可能存在不同的功能：Wnt信號可能引起細胞增殖，凋亡，決定細胞命運，變異，或者前體細胞維護。經(jīng)典的Wnt通路是β-連環(huán)蛋依賴性的：結(jié)合的卷曲蛋白激活成凌亂的家族蛋白，家族蛋白激活了糖原合成酶激酶3，阻止了磷酸化的β-連環(huán)蛋白隨后降解，導致β-連環(huán)蛋白的積累。沒有Wnt刺激，軸蛋白/糖原合成酶激酶3/復合阿司匹林復合物能通過GSK-3β的磷酸化作用提高β-連環(huán)蛋白的抗原降解。穩(wěn)定的β-連環(huán)蛋白進入細胞核后與轉(zhuǎn)錄因子上的T細胞因子/淋巴增強因子作用去激活特定的靶基因。在來自于骨髓的間充質(zhì)干細胞中，Wnt的信號通路的激活作用加強了肌細胞生成，抑制了脂肪生成。抑制β-連環(huán)蛋白通路會減少肌細胞的總體數(shù)量。在前體脂肪細胞中Wnt信號被高度表達，通過阻斷C/EBP和PPARγ來抑制脂肪的生成。穩(wěn)定的β-連環(huán)蛋白與成肌細胞的脂肪分化抑制和隨年齡增長的肌衛(wèi)星細胞的脂肪生成能力有關(guān)。

骨骼肌干細胞存在于所有骨骼肌中，由于位置或功能不同,可能控制不同的增生型/分化能力。出生后的骨骼肌受環(huán)境和生理信號的影響極其敏感，能夠根據(jù)所需修改成長和功能特性，例如，運動，受傷或者損傷啟動了骨骼肌的重新生成和修復，盡管骨骼肌由大量經(jīng)過有絲分裂的多核肌纖維組成。骨骼肌的可塑性很大一大部分是來自骨骼肌中存在的干細胞群，通常是衛(wèi)星細胞。大部分體外研究用的是嚙齒類動物的后背和后肢的肌肉來分離肌源性的衛(wèi)星細胞。最近的一項關(guān)于反芻和非反芻肉用動物的分離研究表明，衛(wèi)星細胞已經(jīng)描述了特定的骨骼肌分離，但還是有不足之處需要去確定，是否控制來自不同肌肉的衛(wèi)星細胞去分離。然而，大量的報道顯示脂肪細胞行為差異取決于被分離細胞所在的位置，這表明位置可能會影響不同組織細胞的活動。例如，不同的脂肪組織位點具有獨特的生長，發(fā)育和調(diào)節(jié)特征，動物依賴性的酶活。最近類似研究是使用的純化培養(yǎng)的脂肪干細胞同時在細胞和分子兩個水平進行的研究。

當需要的時候，衛(wèi)星細胞通過啟動成體終末分化程序來實現(xiàn)融合的功能。有趣的是，我們不斷發(fā)現(xiàn)新的生長因子影響衛(wèi)星細胞的增殖，這表明有可能有額外的機理待被發(fā)現(xiàn)。在肌纖維過度肥大或者修補時，衛(wèi)星細胞能夠?qū)⒑素暙I出來與現(xiàn)存的肌纖維融合。當肌纖維對于損傷無動于衷的時候，衛(wèi)星細胞彼此進行融合形成新的肌管最終取替肌纖維。當然，骨骼肌是一個動態(tài)組織由大量要素組成，包括血管，神經(jīng)和結(jié)締組織。在骨骼肌生長和再生期間，這些要素需要生長和修補，為了生長出一個徹底的功能單位肌纖維間需要相互協(xié)調(diào)。這是由以前的研究支持的，為了去恢復適當?shù)募∪夤δ苄枰婕暗郊〖毎?，血管生成和神?jīng)形成之間的合作。肌細胞和其他細胞之間合作似乎是可能的。最近，研究人員已經(jīng)提出證據(jù)來支持這個想法。為描述他們之間的相互作用，研究人員開發(fā)出了在體外共同培養(yǎng)的由微血管片段和衛(wèi)星細胞組成的模型。此體系中，懸浮在膠原蛋白凝膠上的分離的MVF在鼠SC單層培養(yǎng)基礎(chǔ)上進行培養(yǎng)。在SC的存在下，與MVF獨自培養(yǎng)相比MVF展示出了更高的血管新生指數(shù)。最近通過Christov以及其他人的數(shù)據(jù)顯示衛(wèi)星和內(nèi)皮細胞在肌肉中是緊密并列的，建議直接接觸可能是重要的意味著細胞間的交流?？傊?，這些初步的結(jié)果表明一個以前沒有被發(fā)現(xiàn)的衛(wèi)星細胞作用是啟動生成血管之前程序。

然而很多的報告記錄了出生后的肌源性衛(wèi)星細胞外在的和固有的調(diào)控，可塑性骨骼肌通過生產(chǎn)能力和對各種各樣細胞因子的響應(yīng)來進行例證。根據(jù)炎癥和細胞因子譜，骨骼肌將在分解代謝和合成代謝中做出響應(yīng)。例如，骨骼肌在感染與生存相關(guān)的支撐物過程階段中就會分解。相反，炎癥加上鍛煉最終會導致肌肉肥大。迄今為止，研究了在衛(wèi)星細胞活動上的多種類細胞因子的效果提供了混合的結(jié)果，可能與細胞類型，劑量和時間有關(guān)。

在細胞水平有兩個生理組分存在。一個是脂類代謝，指進入或者離開脂肪細胞(脂肪生成和脂肪分解)的能量流，它不需要干細胞活動。第二個是生理學組分，稱為脂肪形成，是可以識別的細胞轉(zhuǎn)變，其由紡錘形的干細胞收縮，首先形成一個缺乏脂類的前體脂肪細胞，然后形成了一個多個脂滴的脂肪細胞，最后形成成熟的脂肪細胞。鑒于很多每年發(fā)表的關(guān)于脂類代謝和脂肪生成的文章，基本不能獲得一個有效的通過外源性處理降低體內(nèi)油脂或者降低脂肪細胞分化的方法。的確，在脂肪細胞形成領(lǐng)域發(fā)表的大部分發(fā)表的文章認為，一旦前體脂肪細胞開始油脂累積，細胞將繼續(xù)向前進行終端分化成為一個參與脂類代謝的脂肪細胞。在大多動物脂肪中，具備油脂合成和儲存能力的脂肪細胞數(shù)量在出生時都沒有明確的展現(xiàn)。并且，出生后脂肪細胞生長是增生和肥大雙重效果，每種變化的效果因脂肪位置而不同。有趣的是，根據(jù)傳統(tǒng)思維應(yīng)該是更多的脂肪細胞需要在特定部位沉積，并且成纖維細胞在結(jié)締組織部分轉(zhuǎn)變成脂肪細胞。

體外研究顯示激活的過氧化物酶增生物受體(PPARγ)和CCAAT-增強子-結(jié)合蛋白(C/EBPs)都是控制脂肪細胞生成的決定性因子。他們的表達誘導了來自胚胎干細胞脂肪生成。已經(jīng)發(fā)布的與農(nóng)業(yè)動物相關(guān)的大量證據(jù)支持了這個觀點，但與人類和嚙齒動物稍有不同的調(diào)節(jié)機制。脂肪生成起始于胎兒期，反芻動物妊娠中期，豬和嚙齒動物后期。脂肪形成起始時的差異主要是由于不同物種新生動物在成熟度方面的差異。脂肪形成是通過幾個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子控制，包括PPARγ和C/EBPs。C/EBPβ和-δ首先通過脂肪形成刺激物進行誘導，接下來是通過在PPARγ和C/EBPα在表達方面的增加。C/EBPα和PPARγ彼此強迫去打開脂肪形成特定程序去促進脂肪形成。PPARγ值脂肪形成的主調(diào)節(jié)因子。PPARγ在維甲類x受體α(RXRα)和結(jié)合在一起的過氧化物酶體增生物反應(yīng)原件的合作上形成了異質(zhì)二聚體在靶基因激活上。因此，維甲酸會通過RXRα和RXRα和PPARγ的相互作用來影響脂肪形成。PPARγ是轉(zhuǎn)錄因子的一個激活配體。在不活躍狀態(tài)，PPARγ與協(xié)阻抑物聯(lián)系去壓制它的轉(zhuǎn)錄活動。結(jié)合配體導致協(xié)阻抑物代替助激活劑去支配組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活動例如cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白((CBP/p300))。組蛋白的乙酰化作用導致此處染色質(zhì)分裂和基因進行表達。脂肪酸是PPARγ的受體，與正常的脂肪酸相比，被氧化的脂肪酸似乎有更高的能力去激活PPARγ。

總之，骨骼肌組織發(fā)育是農(nóng)業(yè)動物生產(chǎn)能力的核心因素。提高骨骼肌產(chǎn)量和肌內(nèi)脂肪含量又是肉牛業(yè)生產(chǎn)中的重要研究內(nèi)容。雖然已經(jīng)開展了大量關(guān)于農(nóng)業(yè)家養(yǎng)動物干細胞的研究，但目前世界科研人員還在為建立理想的體外模型而開展大量工作。為了能夠分離和純化骨骼肌來源的成肌/成脂干細胞的，進而用來在體外建立誘導分化的模型一直是農(nóng)業(yè)動物科研人員長期開展也是迫在眉睫的工作之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種純化骨骼肌來源脂肪前體細胞的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是通過細胞表面標記分子血小板源性生長因子受體α對骨骼肌來源多潛能干細胞進行分選。

一種純化牛胎兒骨骼肌組織來源前體脂肪細胞的方法，所述方法使用的材料為，牛3月齡胎兒背最長肌組織，所用試劑為，膠原酶、胎牛血清、低糖達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基、細胞分選緩沖液、抗血小板源性生長因子受體α抗體、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、牛胰島素和油紅O。

所述方法包括以下步驟：

步驟一、細胞的分離培養(yǎng)；

步驟二、細胞培養(yǎng)；

步驟三、細胞的成脂誘導；

步驟四、油紅O；

步驟五、油紅O染色試驗結(jié)果。

所述步驟一具體包括以下步驟：

步驟(1)將牛胎兒用75％的酒精和含有雙抗的磷酸鹽緩沖液沖洗幾遍；

步驟(2)然后放置于無菌環(huán)境中小心剪破羊膜，取出胎兒，用眼科剪剪開背部皮膚，用眼科剪刀、鑷子分離出背部肌肉；

步驟(3)用鑷子取出2塊綠豆粒大小的肌肉組織放入到培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿里預(yù)先加入含有雙抗的磷酸鹽緩沖液，用磷酸鹽緩沖液洗清洗3次除去血細胞；

步驟(4)然后轉(zhuǎn)移到EP管中，加入1mL 0.1％Ⅳ型膠原酶，用眼科剪剪碎至肉糜狀；

步驟(5)將剪碎的組織放入37℃氣體恒溫搖床中消化45min，期間每15min吹打組織一次；

步驟(6)45min后用40μm的細胞過濾網(wǎng)將細胞漿過濾，400rpm離心5min，棄去上清液，加入細胞分選緩沖液懸浮細胞；

步驟(7)加入2μL抗血小板源性生長因子受體α抗體后孵育15min,，300rcf離心10min；

步驟(8)加入1mL細胞分選緩沖液后300rcf離心10min，棄上清，重復一次；

步驟(9)吸去上清后加入80μL細胞分選緩沖液，再加入20μL抗兔源免疫球蛋白微珠，混勻后4℃中孵育15min；

步驟(10)加入1mL細胞分選緩沖液后300rcf離心10min，棄上清，重復一次；

步驟(11)加入500μL細胞分選緩沖液懸浮細胞；

步驟(12)將MS分選柱至于磁力架上，將懸浮液加入到準備好的MS分選柱上，收集流下的陰性細胞，沖洗分選柱3次，每次用500μL細胞分選緩沖液，收集流下的液體與第一步合并；

步驟(13)將MS分選柱從磁力架上取下置于新的收集管中，加入1mL細胞分選緩沖液后，用活塞快速推入到分選柱中，收集流出的液體即為陽性細胞。

所述步驟二具體包括以下步驟：

當原代細胞生長聚集至70～80％的時候，吸去舊培養(yǎng)基，并用磷酸鹽緩沖液清洗2次，將0.25％胰蛋白酶加入后，放入培養(yǎng)箱中約30s，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞呈圓形時，用手輕柔敲打培養(yǎng)皿，直到圓形的細胞漂浮后，即刻加入培養(yǎng)基來終止消化反應(yīng)繼續(xù)進行，輕柔的吹打細胞，以1:3比例進行傳代培養(yǎng)，將細胞放入溫度為37℃、CO₂含量為5％的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

所述步驟三具體包括以下步驟：當細胞生長匯聚到100％時，棄掉培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液清洗2次，加入成脂細胞誘導液，生長培養(yǎng)基加0.5μM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10μg/mL胰島素、1μM地塞米松，開始進行誘導，每3d換一次液。

所述步驟四具體包括以下步驟：

步驟(a)棄掉舊培養(yǎng)基，將4％多聚甲醛加到孔板中，室溫固定細胞20min；

步驟(b)用磷酸鹽緩沖液清洗3遍；

步驟(c)加入油紅O常溫下染色10min；

步驟(d)棄掉油紅O染色液，用磷酸鹽緩沖液清洗3遍；

步驟(e)置于倒置顯微鏡下觀察細胞中脂滴的染色情況并拍照。

所述步驟五具體包括以下步驟：

在細胞誘導第10d時，對血小板源性生長因子受體α陽性細胞和血小板源性生長因子受體α陰性細胞進行油紅O染色，結(jié)果表明，前者比后者脂滴更多、更大。

有益效果

通過分子表面標記血小板源性生長因子受體α篩選純化后的陽性組的脂肪前體細胞，在誘導分化后形成了具有大量脂滴的脂肪細胞，而陰性組細胞所形成的脂滴量很少。因此，此方法對于促進脂肪前體細胞純化具有優(yōu)異的效果。

附圖說明

圖1-2分選后細胞成脂細胞誘導分化的油紅O染色結(jié)果；

其中，圖1是血小板源性生長因子受體α陰性細胞成脂分化后油紅O染色結(jié)果；

圖2是血小板源性生長因子受體α陽性細胞成脂分化后油紅O染色結(jié)果；

具體實施方式

實施例1

一種純化牛胎兒骨骼肌組織來源前體脂肪細胞的方法，所述方法使用的材料為，牛3月齡胎兒背最長肌組織，所用試劑為，膠原酶、胎牛血清、低糖達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基、細胞分選緩沖液、抗血小板源性生長因子受體α抗體、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、牛胰島素和油紅O。

所述方法包括以下步驟：

步驟一、細胞的分離培養(yǎng)；

步驟二、細胞培養(yǎng)；

步驟三、細胞的成脂誘導；

步驟四、油紅O；

步驟五、油紅O染色試驗結(jié)果。

所述步驟一具體包括以下步驟：

步驟(1)將牛胎兒用75％的酒精和含有雙抗的磷酸鹽緩沖液沖洗幾遍；

步驟(2)然后放置于無菌環(huán)境中小心剪破羊膜，取出胎兒，用眼科剪剪開背部皮膚，用眼科剪刀、鑷子分離出背部肌肉；

步驟(3)用鑷子取出2塊綠豆粒大小的肌肉組織放入到培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿里預(yù)先加入含有雙抗的磷酸鹽緩沖液，用磷酸鹽緩沖液洗清洗3次除去血細胞；

步驟(4)然后轉(zhuǎn)移到EP管中，加入1mL 0.1％Ⅳ型膠原酶，用眼科剪剪碎至肉糜狀；

步驟(5)將剪碎的組織放入37℃氣體恒溫搖床中消化45min，期間每15min吹打組織一次；

步驟(6)45min后用40μm的細胞過濾網(wǎng)將細胞漿過濾，400rpm離心5min，棄去上清液，加入細胞分選緩沖液懸浮細胞；

步驟(7)加入2μL抗血小板源性生長因子受體α抗體后孵育15min,，300rcf離心10min；

步驟(8)加入1mL細胞分選緩沖液后300rcf離心10min，棄上清，重復一次；

步驟(9)吸去上清后加入80μL細胞分選緩沖液，再加入20μL抗兔源免疫球蛋白微珠，混勻后4℃中孵育15min；

步驟(10)加入1mL細胞分選緩沖液后300rcf離心10min，棄上清，重復一次；

步驟(11)加入500μL細胞分選緩沖液懸浮細胞；

步驟(12)將MS分選柱至于磁力架上，將懸浮液加入到準備好的MS分選柱上，收集流下的陰性細胞，沖洗分選柱3次，每次用500μL細胞分選緩沖液，收集流下的液體與第一步合并；

步驟(13)將MS分選柱從磁力架上取下置于新的收集管中，加入1mL細胞分選緩沖液后，用活塞快速推入到分選柱中，收集流出的液體即為陽性細胞。

所述步驟二具體包括以下步驟：

當原代細胞生長聚集至70～80％的時候，吸去舊培養(yǎng)基，并用磷酸鹽緩沖液清洗2次，將0.25％胰蛋白酶加入后，放入培養(yǎng)箱中約30s，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞呈圓形時，用手輕柔敲打培養(yǎng)皿，直到圓形的細胞漂浮后，即刻加入培養(yǎng)基來終止消化反應(yīng)繼續(xù)進行，輕柔的吹打細胞，以1:3比例進行傳代培養(yǎng)，將細胞放入溫度為37℃、CO₂含量為5％的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

所述步驟三具體包括以下步驟：當細胞生長匯聚到100％時，棄掉培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液清洗2次，加入成脂細胞誘導液，生長培養(yǎng)基加0.5μM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10μg/mL胰島素、1μM地塞米松，開始進行誘導，每3d換一次液。

所述步驟四具體包括以下步驟：

步驟(a)棄掉舊培養(yǎng)基，將4％多聚甲醛加到孔板中，室溫固定細胞20min；

步驟(b)用磷酸鹽緩沖液清洗3遍；

步驟(c)加入油紅O常溫下染色10min；

步驟(d)棄掉油紅O染色液，用磷酸鹽緩沖液清洗3遍；

步驟(e)置于倒置顯微鏡下觀察細胞中脂滴的染色情況并拍照。

所述步驟五具體包括以下步驟：

在細胞誘導第10d時，對血小板源性生長因子受體α陽性細胞和血小板源性生長因子受體α陰性細胞進行油紅O染色，結(jié)果表明，前者比后者脂滴更多、更大。

最后應(yīng)說明的是：顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本申請所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本申請型的保護范圍之中。