本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及其制備方法。

背景技術(shù)：

2006年，Yamanaka等人應(yīng)用重編程技術(shù)將小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞，也被稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是一類能夠維持自我更新并具有多潛能分化能力的干細(xì)胞。相對(duì)于胚胎干細(xì)胞，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞由體細(xì)胞直接進(jìn)入多能干細(xì)胞的狀態(tài)，避免了倫理學(xué)爭(zhēng)議。另外，研究者得到的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以攜帶有疾病特異性基因，一方面可建立從疾病基因型到表型的體外細(xì)胞模型進(jìn)行發(fā)病機(jī)制研究，另外一方面,由于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能由疾病個(gè)體的細(xì)胞獲得，在通過分化移植到該個(gè)體的過程中因?yàn)橥葱钥杀苊饷庖吲懦夥磻?yīng)，所以有望應(yīng)用于臨床進(jìn)行細(xì)胞治療。

迄今為止，已經(jīng)使用來自皮膚(成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞)、羊水、胚外組織(胎盤和臍帶)，臍帶血，骨膜，牙組織，脂肪組織，神經(jīng)干細(xì)胞，肝細(xì)胞，羊膜來源的間質(zhì)干細(xì)胞和外周血細(xì)胞，乳腺上皮細(xì)胞，以及在人中由骨外膜和脂肪干細(xì)胞，臍帶基質(zhì)和胎盤的供體細(xì)胞獲得了人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

然而，目前的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)仍有待深入研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：目前的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)已建立皮膚(成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞)、羊水、胚外組織(胎盤和臍帶)，臍帶血，骨膜，牙組織，脂肪組織，神經(jīng)干細(xì)胞，肝細(xì)胞，羊膜來源的間質(zhì)干細(xì)胞和外周血細(xì)胞，乳腺上皮細(xì)胞，以及在人中由骨外膜和脂肪干細(xì)胞，臍帶基質(zhì)和胎盤為供體細(xì)胞的人iPSCs。但是目前缺乏來自于絨毛細(xì)胞的iPSC及制備方法。

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出了一種絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及其制備方法。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，其來源于絨毛細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，此絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞核型正常，具有誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的多能性特 征，包括表達(dá)OCT4，SOX2，Nanog，SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81多能性標(biāo)記物以及能夠在動(dòng)物模型體內(nèi)形成三胚層組織的畸胎瘤。由于原代細(xì)胞重編程得到的多能干細(xì)胞能進(jìn)一步誘導(dǎo)分化成滋養(yǎng)細(xì)胞,多能干細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞攜帶同樣的致病基因,可以通過該分化過程對(duì)疾病相關(guān)的滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行體外研究,從而建立體外細(xì)胞模型。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以為產(chǎn)前診斷疾病機(jī)制、細(xì)胞遺傳研究提供細(xì)胞疾病模型。關(guān)于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成滋養(yǎng)細(xì)胞，可以參見Ezashi,T,Telugu,BPVL,Roberts,RM.Model systems for studying trophoblast differentiation from human pluripotent stem cells.CELL AND TISSUE RESEARCH,2012,349(3):809-824。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種制備絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：(1)使多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子在絨毛細(xì)胞中表達(dá)；(2)將步驟(1)中所得到的絨毛細(xì)胞在適于去分化的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以便獲得絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。通過以上步驟，可以有效地制備絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，并且表現(xiàn)出多能干細(xì)胞的多能性特征。如前所述，該絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞核型正常，具有誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的多能性特征，包括表達(dá)Oct4，Sox2，Nanog，SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81多能性標(biāo)記物以及能夠在動(dòng)物模型體內(nèi)形成三胚層組織的畸胎瘤。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法還可以進(jìn)一步包括下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在上述步驟(1)中，所述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子包括OCT4、SOX2、SV40LT、KLF4以及microRNA302-367。OCT4、SOX2、SV40LT、KLF4是在胚胎干細(xì)胞中能高度表達(dá)并決定其“全能性”的四個(gè)基因，microRNA302-367具有促進(jìn)多能干細(xì)胞生成的作用。采用第一質(zhì)粒(攜帶人OCT4、S0X2、SV40LT、KLF4四個(gè)基因)及第二質(zhì)粒(攜帶microRNA302-367)將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)入宿主絨毛細(xì)胞，高效表達(dá)后促進(jìn)絨毛細(xì)胞向多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)變并使其具有多能性特征。第一質(zhì)粒和第二質(zhì)粒為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用質(zhì)粒，優(yōu)選PEP4作為第一質(zhì)粒，PCEP4作為第二質(zhì)粒。換句話說，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以將人OCT4、S0X2、SV40LT、KLF4四個(gè)基因構(gòu)建在同一個(gè)質(zhì)粒，例如PEP4，另外，將microRNA302-367構(gòu)建在單獨(dú)的質(zhì)粒上，例如PCEP4。由此，可以進(jìn)一步提高獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的效率。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟(1)中，優(yōu)選電轉(zhuǎn)染方式，將攜帶表達(dá)所述多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子的核酸分子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入所述絨毛細(xì)胞中。通過電轉(zhuǎn)，可以高效地將攜帶表達(dá)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子的核酸分子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入所述絨毛細(xì)胞，促進(jìn)了絨毛細(xì)胞向多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，從而具有了多能干細(xì)胞的多能性特征。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟(1)中，電轉(zhuǎn)染條件是200V電壓、電擊200微秒或300V電壓、電擊200微秒或200V電壓、電擊300微秒或300V電壓、電擊300微秒組合的任一一種，電轉(zhuǎn)染優(yōu)選200V的電壓，電擊300微秒。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過電轉(zhuǎn)染方式將核酸分子轉(zhuǎn)入絨毛細(xì)胞中的效率與電轉(zhuǎn)染的電壓和電擊時(shí)間是非常相關(guān)的。通過對(duì)各種電轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行篩選，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)優(yōu)選200V的電壓，電擊300微秒的條件組合。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果電壓過高或電擊時(shí)間超過300微秒，則會(huì)導(dǎo)致絨毛細(xì)胞的死亡率顯著增大，如果電壓過低或者電擊時(shí)間低于200微秒，則會(huì)導(dǎo)致電轉(zhuǎn)染效率顯著下降，無法滿足后續(xù)形成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的需求。優(yōu)選200V的電壓，電擊300微秒的電轉(zhuǎn)條件組合，電擊兩次可以有效提高將攜帶表達(dá)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子的核酸分子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入所述絨毛細(xì)胞的效率，促進(jìn)了絨毛細(xì)胞向多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，從而具有了多能干細(xì)胞的多能性特征。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟(2)中，將所述步驟(1)中所得到的絨毛細(xì)胞依次在絨毛細(xì)胞培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，絨毛細(xì)胞培養(yǎng)基為CHANG Amnio^TM培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為mTeSR^TM1。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)一步含有終濃度為0.5微摩爾/升的A83-01，終濃度為0.5微摩爾/升的Thiazovivin；終濃度為1微摩爾/升的PD0325901；以及終濃度為3微摩爾/升的CHIR99021。電轉(zhuǎn)后使絨毛細(xì)胞在CHANG Amnio^TM培養(yǎng)基的環(huán)境中進(jìn)行貼壁和恢復(fù)狀態(tài)，繼而在無血清的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。一方面使得電轉(zhuǎn)后的絨毛細(xì)胞恢復(fù)狀態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，另一方面，無血清培養(yǎng)基可以使得絨毛細(xì)胞處于同一細(xì)胞周期，同時(shí)可以避免血清的干擾。從而有利于絨毛細(xì)胞向多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，使得絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有多能性特征。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含有終濃度為0.5微摩爾/升的A83-01，終濃度為0.5微摩爾/升的Thiazovivin；終濃度為1微摩爾/升的PD0325901；以及終濃度為3微摩爾/升的CHIR99021時(shí)，可以顯著提高誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的形成效率，并且濃度的含量對(duì)于形成多能干細(xì)胞的效率有著顯著的影響。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，電轉(zhuǎn)后絨毛細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)20天，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，培養(yǎng)20天后可以獲得大量生長(zhǎng)典型的原始誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，克隆邊緣清晰平滑，克隆內(nèi)細(xì)胞核質(zhì)比大，細(xì)胞排列緊密均一。挑取不同位置的克隆繼續(xù)進(jìn)行維持培養(yǎng)和凍存，從而可以獲得并保存大量具有多能性的絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于機(jī)械傳代的玻璃吸管的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的絨毛細(xì)胞從轉(zhuǎn)染到誘導(dǎo)成iPSC的過程中各培養(yǎng)基成分的變 化；

圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的絨毛細(xì)胞從解凍培養(yǎng)到誘導(dǎo)成iPSC的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的改變過程；

圖4是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的傳代和凍存前后克隆細(xì)胞狀態(tài)對(duì)比圖；

圖5是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞多能性標(biāo)志物熒光免疫檢測(cè)結(jié)果；

圖6是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的核型鑒定結(jié)果；

圖7是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)多能性基因的結(jié)果；

圖8是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的畸胎瘤生成檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1試劑、實(shí)驗(yàn)工具以及實(shí)驗(yàn)材料的收集

絨毛細(xì)胞：由海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心經(jīng)無菌條件B超引導(dǎo)下抽取絨毛組織，并從中原代分離培養(yǎng)；標(biāo)本已經(jīng)捐助夫婦知情同意，并簽署知情同意書后使用。

mTeSR^TM1工作液的配制

在后續(xù)實(shí)施例中所用的iPSC培養(yǎng)基mTeSR^TM1(StemCell)為商品化生產(chǎn)的培養(yǎng)基，包括mTeSR^TM1 basal和mTeSR^TM1 supplemental，按產(chǎn)品說明書的配制方法：將mTeSR^TM1supplemental(100ml)置于4攝氏度過夜解凍，次日，在生物安全柜中，將解凍的mTeSR^TM1supplemental加入到mTeSR^TM1 basal培養(yǎng)基(400ml)中，充分混勻，分裝至50ml離心管(40ml/管)，于-20攝氏度保存，使用前將其置于4攝氏度過夜解凍，解凍的培養(yǎng)基不用時(shí)4攝氏度保存，有效期為2周。

CHANG Amnio^TM培養(yǎng)基的配制

在后續(xù)實(shí)施例中所用的的絨毛細(xì)胞培養(yǎng)基CHANG Amnio^TM(Irvine Scientific)為商品化生產(chǎn)的培養(yǎng)基，按產(chǎn)品說明書的使用方法：將CHANG Amnio^TM(100ml)置于4攝氏度過夜解凍，次日，在生物安全柜中，將解凍的CHANG Amnio^TM充分混勻，分裝至50ml離心 管(40ml/管)，于-20攝氏度保存，使用前將其置于4攝氏度過夜解凍，解凍的培養(yǎng)基不用時(shí)4攝氏度保存，有效期為2周。

細(xì)胞冷凍液的配制

按下列方法配制細(xì)胞冷凍液，所有試劑及耗材在配制及使用過程中均要求無菌，并將配好的冷凍工作液在4攝氏度保存，使用期限為1周內(nèi)。

(1)絨毛細(xì)胞冷凍液(含90％胎牛血清，10％二甲亞砜)配制：取15ml無菌試管，加入胎牛血清(FBS)9ml后，加入1ml二甲亞砜(DMSO)混勻。

(2)iPSC冷凍液(含60％mTeSR^TM1，10％DMSO，30％DFBS)配制：取15ml無菌試管，加入iPSC培養(yǎng)基mTeSR^TM1 6ml后，分別加入透析型胎牛血清(DFBS)3ml、二甲基亞砜1ml，混勻。

EDTA工作液(0.5mM)的配制

在后續(xù)實(shí)施例中所用的EDTA為商品化生產(chǎn)的消化液(購(gòu)自上海雙螺旋生物科技有限公司)，儲(chǔ)存液為0.5M EDTA(pH 8.0)，工作濃度為0.5mM。使用時(shí)將0.5M EDTA按500×的比例用DPBS(無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液，購(gòu)自life technologies)稀釋即為工作液。

Matrigel^TM工作液的配制

在后續(xù)實(shí)施例中所用的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系培養(yǎng)iPSC，所用的基質(zhì)為BD Matrigel^TM(BD公司)，按產(chǎn)品說明書的使用方法將BD Matrigel^TM(5ml)置于4攝氏度過夜解凍，次日，在生物安全柜中，將解凍的Matrigel^TM置于冰上并充分混勻，分裝至0.5ml EP管(280ul/管)制成母液，-20攝氏度保存。使用之前4攝氏度解凍，每50ml DMEM/F12中加280微升的Matrigel^TM母液混勻即為工作液。

mTeSR^TM1+4i工作液的配制

在后續(xù)實(shí)施例中所用的使用到的小分子化合物(抑制劑或誘導(dǎo)劑)包括：PD0325901、IR99021、A83-01和Thiazovivin，即4i(均購(gòu)自STEMGENT Stemolecule^TM)。其中，A83-01和Thiazovivin為粉劑，PD0325901、CHIR99021為液體。儲(chǔ)存及使用均要避光。

(1)用474.5微升DMSO(sigma公司)將A83-01溶解成50mM(儲(chǔ)存濃度為10mM，工作濃度為0.5微摩爾/升)；用321.2微升DMSO將Thiazovivin溶解成100mM(儲(chǔ)存濃度為10mM，工作濃度為0.5微摩爾/升)；同時(shí)，PD0325901儲(chǔ)存濃度為10mM，工作濃度為1微摩爾/升；CHIR99021儲(chǔ)存濃度為10mM，工作濃度為3微摩爾/升，CHIR99021。以上化合物的儲(chǔ)存液于-20攝氏度中可保存6個(gè)月。

(2)量取50ml的mTeSR^TM1培養(yǎng)基于50ml離心管中，并分別加入上述化合物配制成的工作液，其中PD0325901加5微升、CHIR99021加15微升、A83-01加2.5微升、 Thiazovivin加2.5微升，充分混勻即為mTeSR^TM1+4i工作液。用錫箔紙包緊以達(dá)到避光效果，并4攝氏度保存待用。

玻璃管制作

將3ml玻璃巴氏吸管細(xì)頭用酒精燈小火預(yù)熱，然后把要拉的部位在外火焰加熱軟化，緩慢而均勻地轉(zhuǎn)動(dòng)玻璃管，兩手用力要均勻，轉(zhuǎn)速要一致，以免玻璃管在火焰中扭曲。待燒到紅黃時(shí)彎曲到30°左右的角度才從火焰中迅速取出，順著管口方向邊拉。待冷卻后，按所需要的長(zhǎng)度截?cái)?，并將毛?xì)部分一頭用火焰封死，即可用來做純化克隆及傳代，成型玻璃管如圖1所示。

絨毛細(xì)胞(原始細(xì)胞)的獲得

在后續(xù)實(shí)施例中所采用的絨毛細(xì)胞為無菌條件經(jīng)B超引導(dǎo)穿刺取得的絨毛組織分離獲得，其分離、培養(yǎng)傳代、冷凍貯存方法如下：

(1)通風(fēng)櫥或生物安全柜在實(shí)驗(yàn)前紫外消毒30分鐘，標(biāo)記并檢查相應(yīng)的試管和樣本瓶。

(2)取2個(gè)100mm培養(yǎng)皿，在兩個(gè)培養(yǎng)皿中的一個(gè)中加入約5ml含雙抗(100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的鏈霉素)的PBS，用于后續(xù)對(duì)絨毛樣品進(jìn)行清洗。

(3)將兩個(gè)培養(yǎng)基中的另一個(gè)放在立體顯微鏡架物臺(tái)上，打開蓋子，向培養(yǎng)皿中滴三滴PBS，依次編號(hào)為液滴1、液滴2、液滴3。

(4)在一級(jí)生物安全柜中，將所有的絨毛樣品加入到步驟(2)中含有5ml雙抗的100mm培養(yǎng)皿中；在顯微鏡視野下，用預(yù)先經(jīng)過消毒的眼科鑷挑取適量的絨毛組織，分離掉明顯的母體組織和血塊。

(5)將絨毛轉(zhuǎn)移到步驟(3)中的液滴1中，如果樣品中還含有血塊或者母體組織，則繼續(xù)分離血塊和母體組織，之后取出絨毛并轉(zhuǎn)移到液滴2中觀察并繼續(xù)分離血塊和母體組織直至干凈為止，最后將絨毛在液滴3中進(jìn)行沖洗。

(6)取1ml的0.25％胰酶-EDTA，加入到在步驟(3)的培養(yǎng)皿中并做成液滴，將絨毛從液滴3取出并瀝干，并將絨毛轉(zhuǎn)到上述做好的0.25％胰酶-EDTA液滴上充分混勻，消化5min。

(7)把步驟(6)中經(jīng)過胰酶-EDTA消化的絨毛懸液轉(zhuǎn)移到干凈無菌的15mL離心管中，向離心管中加入含有2％胎牛血清(FBS)的PBS至13mL以終止胰酶-EDTA的消化，之后按照1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5min。

(8)離心后，去除離心管的上清液，向離心管中加入1.5mLPBS及0.5mL膠原蛋白酶Ⅰ(膠原蛋白酶Ⅰ的終濃度為500U)，充分混勻，置于37攝氏度水浴箱中水浴30min，其 間每隔7min要充分振蕩搖勻一次以幫助絨毛消化。

(9)肉眼觀察絨毛標(biāo)本是否已經(jīng)被消化完全，如果沒有消化完全可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，至絨毛基本消化完全為止。

(10)向上述15ml離心管中加入PBS至體積為12mL，充分混勻后按照1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，以漂洗掉殘留的膠原蛋白酶。取上清，重復(fù)步驟(10)一次。

(11)從上述15ml離心管中吸去上清保留細(xì)胞沉淀，并向剩余的細(xì)胞沉淀中添加1mL的CHANG Amnio^TM培養(yǎng)基到離心管中重懸細(xì)胞沉淀，并將所得到的重懸浮液轉(zhuǎn)移到25cm²培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)管中，補(bǔ)足培養(yǎng)基，在37攝氏度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；第3天觀察細(xì)胞是否有細(xì)菌污染，第6-7天觀察所培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)情況并更換培養(yǎng)基或傳代及凍存細(xì)胞。

傳代的操作包括：(1)吸棄舊培養(yǎng)基，用適量PBS洗滌細(xì)胞2次；(2)采用1ml 0.25％胰酶-EDTA(GIBIO公司，使用前37攝氏度預(yù)溫15min)室溫下消化1min，在消化過程中應(yīng)在解剖顯微鏡下觀察，待見到大多數(shù)細(xì)胞的偽足收起，并出現(xiàn)多數(shù)細(xì)胞呈球狀時(shí)，向培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)管中加入3ml含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液充分混勻以終止消化；(3)將細(xì)胞懸液用10ml移液管轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，按照1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清；(4)向離心管中加入5ml CHANG Amnio^TM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，將所得到的重懸浮液平均分配到兩個(gè)25cm²培養(yǎng)皿中，并在37攝氏度，5％二氧化碳的條件下培養(yǎng)。次日觀察細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)，每天更換培養(yǎng)基直至下次傳代或凍存。

絨毛細(xì)胞的凍存與解凍方法如下：

絨毛細(xì)胞采用慢凍法冷凍，待細(xì)胞密度達(dá)到80％-90％時(shí)即可冷凍，具體步驟如下：

(1)針對(duì)經(jīng)過傳代培養(yǎng)的絨毛細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)基后利用PBS洗滌細(xì)胞2次；(2)采用1ml 0.25％胰酶-EDTA(GIBIO公司，使用前37攝氏度預(yù)溫15min)室溫下消化1min，在消化過程中應(yīng)在解剖顯微鏡下觀察，待見到大多數(shù)細(xì)胞的偽足收起，并出現(xiàn)多數(shù)細(xì)胞呈球狀時(shí)，向培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)管中加入3ml含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液充分混勻以終止消化；(3)取20微升于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)；(4)將細(xì)胞懸液用10ml移液管轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，按照1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清；(5)按照1×10⁶個(gè)細(xì)胞中加入1ml含10％DMSO的FBS冷凍工作液，利用FBS冷凍工作液重懸離心后的細(xì)胞沉淀，并將重懸浮液分配至冷凍管中，每個(gè)冷凍管分配1毫升重懸浮液；(7)將冷凍管置于程序降溫盒中，在﹣80攝氏度深低溫冰箱中過夜，次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存，即完成冷凍。

解凍

可使用處在培養(yǎng)傳代過程的新鮮的絨毛細(xì)胞作為重編程誘導(dǎo)細(xì)胞用于制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，也可以解凍已經(jīng)凍存的絨毛細(xì)胞用作重編程誘導(dǎo)細(xì)胞用于制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，具體解凍方法如下：(1)從液氮中取出裝有細(xì)胞的凍存管，置于37攝氏度水浴箱中，待凍存管中尚存綠豆大小的冰塊時(shí)將凍存管取出；(2)用1ml移液槍頭將冷凍管中解凍后的細(xì)胞懸液吹打均勻并轉(zhuǎn)移至15ml離心管，加入CHANG Amnio^TM培養(yǎng)基4ml，按照1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5min；(3)離心后，從離心管中吸棄上清，加入CHANG Amnio^TM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并將所得到的重懸浮液轉(zhuǎn)移到25cm²培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基，在37攝氏度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。

誘導(dǎo)iPSC培養(yǎng)板準(zhǔn)備

iPSC的細(xì)胞培養(yǎng)板于細(xì)胞接種前準(zhǔn)備，準(zhǔn)備好的培養(yǎng)板保存于培養(yǎng)箱中，使用有效期為1周。培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備步驟如下：

(1)Matrigel^TM包被培養(yǎng)皿：在每個(gè)六孔板的孔中加入Matrigel^TM工作液1ml，37攝氏度放置0.5h，使基質(zhì)均勻包被培養(yǎng)板底。

(2)換液：iPSC接種前，吸棄培養(yǎng)板中Matrigel^TM，加入2ml CHANG Amnio^TM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中平衡至少一個(gè)小時(shí)后使用。

實(shí)施例2絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)的誘導(dǎo)

在本實(shí)施例中，采用通過電穿孔方法將包含多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子的cDNA或miRNA簇的質(zhì)粒導(dǎo)入步驟實(shí)施例1中所得到的絨毛細(xì)胞中，所采用的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子為0CT4、S0X2、SV40LT、KLF4和microRNA302-367的組合。然后，將引入含有多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子編碼核酸的絨毛細(xì)胞轉(zhuǎn)入無細(xì)胞飼養(yǎng)層、CHANG Amnio^TM培養(yǎng)基環(huán)境下培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)入無血清、無細(xì)胞飼養(yǎng)層的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中，培養(yǎng)20天后，獲得大量生長(zhǎng)典型的原始誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆，將這些克隆挑取后繼續(xù)培養(yǎng)。具體操作步驟如下：

(1)電轉(zhuǎn)前2～3天，將細(xì)胞解凍或者傳代，至轉(zhuǎn)化前使細(xì)胞密度約70％-85％。吸棄舊培養(yǎng)基，加入2ml DPBS洗滌細(xì)胞2次，吸棄DPBS；

(2)采用1ml 0.25％胰酶-EDTA(GIBIO公司，使用前37攝氏度預(yù)溫15min)室溫下消化1min，在消化過程中應(yīng)在解剖顯微鏡下觀察，待見到大多數(shù)細(xì)胞的偽足收起，并出現(xiàn)多數(shù)細(xì)胞呈球狀時(shí)，向培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)管中加入3ml含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液充分混勻以終止消化；

(3)取20微升于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)；

(4)將細(xì)胞懸液用10ml移液管轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，按照300g的轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清,用DPBS重懸細(xì)胞，達(dá)到密度為1.2x10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。取1ml加入EP管中，在300g 的轉(zhuǎn)速下離心5min，離心后收集細(xì)胞；

(5)向所收集的細(xì)胞中，加入DPBS(對(duì)于1mm電擊杯加100微升DPBS，對(duì)于2mm電擊杯加400微升DPBS)，并緩慢混勻細(xì)胞；

(6)向EP管的細(xì)胞懸液中加入包含多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子的質(zhì)粒充分混勻；

(7)將細(xì)胞-質(zhì)粒懸液轉(zhuǎn)移至電擊杯中，將電擊杯放到電擊巢中；

(8)設(shè)置多功能細(xì)胞融合儀(Eppendorf公司)程序和模式。

模式：真核細(xì)胞

電壓：200V

電擊時(shí)間：300微秒

電擊次數(shù)：2次；

(9)按下Start鍵開始電擊，電擊后將細(xì)胞繼續(xù)停留于電擊杯中10min；

(10)取出電擊杯，用移液器輕輕混勻電擊杯中的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液平分成兩份(每份細(xì)胞量約為6x10⁵)并接種到前面準(zhǔn)備的六孔板(Matrigel^TM包被培養(yǎng)皿)中，輕輕晃動(dòng)孔板，使細(xì)胞均勻分布，置于37攝氏度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(11)接種培養(yǎng)24小時(shí)后，若細(xì)胞貼壁良好，可每天換液至細(xì)胞匯合度約40％，之后，更換為2ml mTeSR^TM1或者mTeSR^TM1+4i進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

(12)更換mTeSR^TM1或者mTeSR^TM1+4i培養(yǎng)基后需隔天換液，至細(xì)胞長(zhǎng)出5～8個(gè)具有典型ES集落的致密形態(tài)的克隆后可撤去mTeSR^TM1+4i，以后每天換液(若細(xì)胞克隆較多，培養(yǎng)基可增加至3ml/孔)；而且在第25天時(shí)，證明了上述這些克隆集落為AP染色陽(yáng)性。

(13)mTeSR^TM1培養(yǎng)至20天后，ES樣集落克隆占據(jù)低倍鏡視野下的1/2，克隆邊緣清晰平滑，克隆內(nèi)細(xì)胞核質(zhì)比大，細(xì)胞排列緊密均一，我們挑取來自不同位置的6個(gè)克隆在無血清、無細(xì)胞飼養(yǎng)層的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中維持培養(yǎng)，并進(jìn)行進(jìn)一步表征驗(yàn)證。

為了方便理解，圖2中總結(jié)了在絨毛細(xì)胞從轉(zhuǎn)染到誘導(dǎo)形成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的過程中所采用的培養(yǎng)基的類型和時(shí)間。

絨毛細(xì)胞從解凍培養(yǎng)到誘導(dǎo)成iPSC的中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的改變過程如圖3所示。其中，圖3-A為絨毛細(xì)胞解凍培養(yǎng)第1天的生長(zhǎng)狀態(tài)：細(xì)胞幼嫩，死細(xì)胞和雜質(zhì)均較少；圖3-B轉(zhuǎn)染前絨毛細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)：細(xì)胞拉長(zhǎng)，密度約為70％；圖3-C為絨毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第1天的生長(zhǎng)狀態(tài)：死細(xì)胞較少，貼壁密度約為10％；圖3-D為絨毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第10天的生長(zhǎng)狀態(tài)：顯微鏡下可以看到一團(tuán)形態(tài)與周圍不一樣的細(xì)胞團(tuán)(形變的細(xì)胞克隆)，并且高倍鏡下可以觀察到有少量核質(zhì)比較大的細(xì)胞；圖3-E為絨毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第14天的生長(zhǎng)狀態(tài)：形變 的細(xì)胞克隆不斷變大，克隆邊緣清晰，細(xì)胞排列緊密，核質(zhì)比明顯增大；圖3-F為絨毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第27天時(shí)進(jìn)行的AP染色，染色結(jié)果為陽(yáng)性。

實(shí)施例3絨毛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的傳代和維持

在本實(shí)施例中，克隆純化及傳代初期采用機(jī)械法傳代iPSC。當(dāng)iPSC的克隆生長(zhǎng)直徑1mm左右，并且有一定厚度時(shí)即可傳代；具體操作步驟如下：

(1)用前面所制備的玻璃管在解剖顯微鏡下將細(xì)胞克隆切割成大小相等的細(xì)胞塊(每個(gè)細(xì)胞團(tuán)塊大小約300-600微米)。

(2)用10微升移液槍頭將這些細(xì)胞塊轉(zhuǎn)移到提前準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即完成傳代。

機(jī)械法傳代前后細(xì)胞克隆的狀態(tài)如圖4-A和圖4-A’所示，圖4-A為機(jī)械法純化前克隆的狀態(tài)：克隆中間發(fā)白的地方及周圍散開的為分化了的細(xì)胞，需要純化以獲得更均一的克??；圖4-A’為機(jī)械法純化后克隆的狀態(tài)：細(xì)胞克隆與周圍界限明顯，細(xì)胞排列緊密均一。

在本實(shí)施例中，克隆純化及傳代后期采用EDTA消化法傳代iPSC。當(dāng)iPSC的克隆生長(zhǎng)到孔皿的50％～80％，并且分化細(xì)胞少時(shí)即可傳代；具體操作步驟如下：

(1)棄掉舊培養(yǎng)基，加入0.5mM EDTA工作液消化3min(37攝氏度培養(yǎng)箱中)。

(2)吸去EDTA溶液，加入1ml mTeSR^TM1培養(yǎng)基，用移液器輕輕將細(xì)胞從孔皿上吹打下來，并轉(zhuǎn)移到提前準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，混勻充分，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即完成傳代。

消化法傳代前后細(xì)胞克隆的狀態(tài)如圖4-B和圖4-B’所示,細(xì)胞克隆界限依然明顯，細(xì)胞排列緊密均一、核質(zhì)比高。

實(shí)施例4絨毛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的的冷凍保存

在本實(shí)施例中，采用程序化凍存iPSC，當(dāng)iPSC的克隆生長(zhǎng)到孔皿的70％～90％時(shí)即可用于冷凍保存；具體操作步驟如下：

(1)棄掉舊培養(yǎng)基，加入0.5mM EDTA工作液消化3min(37攝氏度培養(yǎng)箱中)。

(2)吸去EDTA溶液，加入1ml iPSC冷凍液，用移液器輕輕將細(xì)胞從孔皿上吹打下來，混勻充分并轉(zhuǎn)移到凍存管中，做好標(biāo)記。

(3)將冷凍管置于程序降溫盒中，在﹣80攝氏度深低溫冰箱中過夜，次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存，即完成冷凍。

實(shí)施例5絨毛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的解凍

在本實(shí)施例中，采用快速解凍的方法將絨毛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞復(fù)蘇，具體步驟如下：

(1)從液氮中取出裝有細(xì)胞的凍存管，置于37攝氏度水浴箱中，待凍存管中尚存綠豆大小的冰塊時(shí)將凍存管取出。

(2)用1ml移液槍頭將冷凍管中解凍后的細(xì)胞懸液吹打均勻并轉(zhuǎn)移至15ml離心管，緩慢加入DMEM/F12培養(yǎng)基4ml，邊加邊晃動(dòng)便于充分混勻，按照1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5min。

(3)吸棄上清，加入mTeSR^TM1培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，補(bǔ)足培養(yǎng)基，放到37攝氏度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

絨毛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞程序化冷凍前和解凍培養(yǎng)后細(xì)胞克隆的狀態(tài)分別如圖4-C和圖4-C’所示。經(jīng)過程序化冷凍后解凍培養(yǎng)的絨毛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞依然保持著類似于胚胎干細(xì)胞的形態(tài)：細(xì)胞核大,有一個(gè)或幾個(gè)核仁，細(xì)胞克隆界限明顯，細(xì)胞排列緊密。由此，可見絨毛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞程序化冷凍前后細(xì)胞的形態(tài)保持不變，可以證明絨毛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以像其他類型的iPSC一樣用該方法進(jìn)行保存。

實(shí)施例6絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的鑒定

1、堿性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn)(AP染色)

在本實(shí)施例中，發(fā)明人挑取克隆后剩余的細(xì)胞克隆進(jìn)行AP染色，步驟如下：

(1)洗滌：吸棄舊培養(yǎng)基，2ml PBS洗孔板2次。

(2)固定：加入1.5ml 4％多聚甲醛，在室溫下固定2min。

(3)洗滌：棄固定液，0.5ml TBST(Tris-HCL NaCl Twwen20)洗孔板2次。

(4)平衡：加入2ml AP緩沖液，在室溫下平衡5min。

(5)染色：棄AP緩沖液，加入1.5ml AP顯色液(NBT+PICP+AP Buffer)，避光染色30min。

(6)洗滌：棄染色液，2ml PBS洗2次，加1.5ml PBS后，奧林巴斯倒置顯微鏡下觀察顯色情況并拍照記錄，結(jié)果如圖3-F所示。

已知堿性磷酸酶與細(xì)胞的分化多能性相關(guān)，因此AP染色可以反映出細(xì)胞的多能性狀態(tài)。通常，未分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能特異性地高表達(dá)堿性磷酸酶，而在分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中，堿性磷酸酶的表達(dá)量會(huì)急劇下降。通過AP染色對(duì)絨毛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示本發(fā)明獲得的絨毛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞高表達(dá)堿性磷酸酶，結(jié)果如圖3-F所示。正如圖3-F所顯示的，絨毛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆堿性磷酸酶染色結(jié)果(陽(yáng)性)。

2、免疫熒光染色

將細(xì)胞爬片置于十二孔板內(nèi)，用Matrigel^TM包被細(xì)胞爬片。將絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞傳代至此十二孔板中，生長(zhǎng)3-4天，用于免疫熒光染色，結(jié)果如圖5所示。具體步驟如下：

(1)染色前，棄舊培養(yǎng)基，1ml PBS洗滌3次，加入0.5ml 4％多聚甲醛，室溫固定 30min。

(2)棄固定液，1ml PBS洗滌3次，每次洗滌均置于搖床上搖晃5min；加入0.5ml通透液(0.2％Triton-X100在PBS中的溶液)，室溫通透30min。

(3)棄通透液，1ml PBST洗滌3次，每次洗滌均置于搖床上搖晃5min；加入0.5ml封閉液(10％山羊血清、5％BSA in PBST)，室溫封閉1小時(shí)。

(4)棄封閉液后，加0.5ml一抗(該一抗包括：兔抗Oct4IgG，Abcam，ab19857；小鼠抗SSEA4IgG，Abcam，ab16287；小鼠抗TRA-1-60IgM,Millipore，MAB4360；以及小鼠抗TRA-1-81IgM，Millipore，MAB4381)，用比十二孔板稍小的封口膜覆蓋液面，4攝氏度濕盒避光處理1小時(shí)。

(5)棄一抗，1ml PBST洗滌3次，每次洗滌均置于搖床上搖晃5min；加入0.5ml二抗(該二抗包括：山羊抗兔IgM Alexa Flour488，Invitrogen，A11008；山羊抗小鼠IgM Dylight488，GeneTex，GTX76752；以及山羊抗小鼠IgG Alexa Flour&reg 488，Abcam，ab150117)，室溫濕盒避光孵育處理1小時(shí)。

(6)棄二抗，1ml PBST洗滌3次，每次洗滌均置于搖床上搖晃5min；加入0.5ml DAPI，濕盒避光處理5min。

(7)棄DAPI染液，0.5ml PBS避光洗滌2次，每次洗滌均置于搖床上搖晃5min；加入新的PBS 0.5ml，于奧林巴斯倒置顯微鏡下觀察拍照記錄，或者用封片劑處理制成玻片觀察并保存。以便檢測(cè)解凍后經(jīng)傳代培養(yǎng)的iPSC克隆的多能性標(biāo)志物表達(dá)情況。

圖5結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所得到的絨毛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞經(jīng)過OCT-4、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81免疫熒光染色，多能性標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性表達(dá)。其中圖5(A)中表示展現(xiàn)綠色熒光的OCT-4表達(dá)于細(xì)胞表面；展現(xiàn)綠色熒光的SSEA-4表達(dá)于細(xì)胞膜表面；展現(xiàn)綠色熒光的TRA-1-60表達(dá)于細(xì)胞膜表面；展現(xiàn)綠色熒光的TRA-1-81表達(dá)于細(xì)胞膜表面；圖5(B)顯示了細(xì)胞核DAPI染色陽(yáng)性藍(lán)色。

3、核型分析

將本發(fā)明實(shí)施例中所制備的絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞傳代至在Matrigel^TM包被的六孔板上，當(dāng)六孔板兩個(gè)孔的細(xì)胞密度達(dá)70％-80％，即可用于做核型分析(結(jié)果如圖6所示)。具體操作步驟如下：

(1)吸棄舊的培養(yǎng)液，更換2mL新鮮的mTeSR^TM 1培養(yǎng)基。

(2)滴入14微升(20ug/ml)的秋水仙胺(使最終工作濃度為：0.14微克/ml)處理3h。

(3)吸棄含有秋水仙胺的培養(yǎng)基，用2mL PBS洗滌2次，用1mL 0.25％胰酶-EDTA消化細(xì)胞1min。

(4)加入1mL含10％FBS的培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞吹打下來(要求盡可能單個(gè)細(xì)胞)，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，按照1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。

(5)棄上清，留沉淀。向15ml離心管內(nèi)加入37攝氏度預(yù)溫的低滲液0.075mM KCl 8ml，用滴管反復(fù)沖打分散細(xì)胞，置于37攝氏度水浴箱中低滲處理12min。

(6)向低滲的細(xì)胞懸液內(nèi)緩慢加入2ml固定液(甲醇和乙酸按體積比3：1的比例混合)，輕輕混勻后置室溫下固定3min后，按照1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。

(7)棄上清，留沉淀。沿管壁緩慢加入8ml固定液，輕輕混勻后放37攝氏度水浴箱預(yù)固定30min，按照1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。

(8)棄上清，留下沉淀細(xì)胞，重新加固定液1ml(加固定液的量根據(jù)沉淀物的量和制片后細(xì)胞的分布情況調(diào)整)，混勻后液體成毛玻璃狀，滴冰片，每塊玻片2滴，過酒精燈干燥。

(9)將制好的玻片置90攝氏度烤箱中烘烤25min。

(10)取3個(gè)50ml立式染色缸(分別標(biāo)記為染色缸Ⅰ、II、III)，置37攝氏度水浴中預(yù)溫30min。染色缸Ⅰ加入磷酸鹽緩沖液49ml，1.25％胰酶1ml，混勻，用于細(xì)胞遺傳消化顯帶，消化時(shí)間1min 20s。染色缸Ⅱ內(nèi)加大約50ml生理鹽水，用于漂洗。染色缸Ⅲ內(nèi)加入雙蒸水45ml，染色液兩管，混勻，用于染片，染片時(shí)間4min。取出，用自來水沖洗，置烤箱中將玻片烤干，或自然晾干。奧林巴斯正置顯微鏡觀查：15-20個(gè)核型，并通過染色體自動(dòng)掃片分析系統(tǒng)(蔡司MetaSystems)掃描分析。

圖6-A顯示了原始絨毛細(xì)胞(轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞)核型鑒定結(jié)果，圖6-B顯示了絨毛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞傳代培養(yǎng)7代后的細(xì)胞的核型鑒定結(jié)果，因此圖6結(jié)果顯示為所得到的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有正常核型。

4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定iPSC和原始絨毛細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

在本實(shí)施例中，采用表1所示的引物對(duì)各標(biāo)志物基因的表達(dá)進(jìn)行分析

表1 Q-PCR所用特異性引物及其相應(yīng)的擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度

收集原始絨毛細(xì)胞(未經(jīng)過轉(zhuǎn)染)和培養(yǎng)5代以后的iPS細(xì)胞。使用RNA提取試劑盒(Magen)，按照說明書操作提取總RNA，并按照下列步驟將所得到RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA：

(1)取上述提取的RNA 10微升(100ng/微升)置于PCR管中，加入Oligo(dT)1.5微升，瞬時(shí)離心。

(2)PCR管置于80攝氏度5min后立即置于冰上5min。

(3)依次向PCR管中加入下列試劑(見表2)：ImProm-II^TM 5X反應(yīng)緩沖液6微升、MgCl₂(25mM)7.2微升、dNTP(10mM)1.5微升、RNA酶抑制劑1.5微升、逆轉(zhuǎn)錄酶0.75微升、RNase-Free Water 1.55微升，總反應(yīng)體系為30微升。

表2 逆轉(zhuǎn)錄PCR體系

(4)震蕩混勻，瞬時(shí)離心，上機(jī)。42攝氏度反應(yīng)60min，99攝氏度反應(yīng)10min，得到cDNA。

接下來，按照下列步驟進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

(1)依次向PCR管中加入下列試劑：2×MIX 10微升、上游引物(10pmol/ul)：0.15微升、 下游引物(10pmol/ul)：0.15微升、ROX:0.3微升、cDNA：1微升、H₂O：8.4微升，總反應(yīng)體系為20微升。其中，多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的特異性引物及其相應(yīng)的擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度見表1。

(2)將上述反應(yīng)體系混勻，瞬時(shí)離心，然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Agilent Mx3000P)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5攝氏度預(yù)變性，5min；95攝氏度變性，40s，60攝氏度退火，30s，72攝氏度延伸，30s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；最后再72攝氏度延伸，7min。

由此，利用實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的表達(dá)情況。結(jié)果如圖7所示。圖7結(jié)果顯示，使用本申請(qǐng)的方法獲得的iPSC多能性基因Sox2、Oct4和Nanog的表達(dá)均上調(diào)，而這些因子在原始絨毛細(xì)胞中均沒有可檢測(cè)到的表達(dá)。

實(shí)施例7畸胎瘤生成檢測(cè)

(1)將未分裝的Matrigel，按1:3用DMEM/F12稀釋。

(2)每在小鼠上注射一個(gè)部位，準(zhǔn)備一個(gè)孔的六孔板細(xì)胞，約1.5×10⁶-2×10⁶個(gè)細(xì)胞。一般一株細(xì)胞注射2只小鼠，每只小鼠注射兩個(gè)部位。

(3)將待注射細(xì)胞用Dispase消化后，用稀釋的Matrigel重懸。

(4)將重懸后的細(xì)胞立即對(duì)NOD-SCID小鼠進(jìn)行皮下或肌肉注射，并做好標(biāo)記。

(5)約4-6周后，會(huì)有畸胎瘤長(zhǎng)出。

(6)處死小鼠，取出畸胎瘤，制作切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。顯微鏡尋找觀察內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的典型細(xì)胞。結(jié)果如圖8所示，圖8結(jié)果顯示，使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法所獲得的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有體內(nèi)分化成三個(gè)胚層的能力。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。