本發(fā)明涉及一種人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層的分離培養(yǎng)方法，具體涉及人類RPE細(xì)胞的分離培養(yǎng)，屬于生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：RPE細(xì)胞層是位于視網(wǎng)膜外部的連續(xù)單層細(xì)胞，因其鋪路石狀的形態(tài)和胞質(zhì)內(nèi)豐富的黑色素而得名。它們?cè)谝暰W(wǎng)膜細(xì)胞的維持和自我更新上發(fā)揮重要的功能，如：吞噬消化脫落的光感受器細(xì)胞的OS；促進(jìn)視循環(huán)中重要的介質(zhì)11-順視黃醛的再生；調(diào)節(jié)眼內(nèi)的免疫反應(yīng)；參與形成視網(wǎng)膜-血管屏障等。RPE細(xì)胞的這一生理功能異常被認(rèn)為與相關(guān)眼科疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如RPE細(xì)胞屏障功能異常則易導(dǎo)致Best卵黃樣黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(Bestvitelliformmaculardystrophy，BVMD)和成人卵黃樣黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(adult-onsetitelliformmaculardystrophy，AVMD)。RPE基底膜與Bruch’smembrane之間的連接或功能異常被認(rèn)為與年齡相關(guān)性黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration，AMD)和Sorsby’s眼底營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)生相關(guān)。AMD主要表現(xiàn)為RPE細(xì)胞層對(duì)視細(xì)胞外節(jié)盤膜吞噬消化能力下降，結(jié)果使未被完全消化的盤膜殘余小體潴留于基底部細(xì)胞原漿中，并向細(xì)胞外排除沉積于Bruch膜，形成玻璃膜疣。AMD分為干性和濕性兩種，其中，干性AMD更為常見(jiàn)，是由于RPE細(xì)胞進(jìn)行性營(yíng)養(yǎng)不良造成的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管和光受體缺失的一種疾病。濕性AMD的典型特征是由脈絡(luò)膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)生成，從而造成嚴(yán)重的視力喪失。除了細(xì)胞替代治療，目前尚無(wú)逆轉(zhuǎn)這一退行性過(guò)程并回復(fù)視力的有效辦法。RPE細(xì)胞治療AMD的試驗(yàn)顯示通過(guò)在視網(wǎng)膜下腔移植正常RPE細(xì)胞，能夠延緩進(jìn)行性的視覺(jué)功能喪失。RPE細(xì)胞移植在RPE細(xì)胞遺傳缺陷動(dòng)物模型和AMD病人上的試驗(yàn)，都顯示能夠延緩視網(wǎng)膜的退行性病變，改善視覺(jué)功能。RPE細(xì)胞在視網(wǎng)膜下腔的自體移植比較穩(wěn)定，且具有長(zhǎng)期的療效，但是自體RPE細(xì)胞來(lái)源及適量的有限性限制了該方法在臨床上的廣泛應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服原有分離方法不足之處，提供一種簡(jiǎn)單易操作的人類RPE細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，為體外培養(yǎng)、擴(kuò)增RPE細(xì)胞，治療AMD等RPE細(xì)胞損傷疾病提供了新來(lái)源。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，一種人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層的分離培養(yǎng)方法，具體步驟為：(1)緩沖液浸泡清洗：將待處理的眼球放入加有青霉素-鏈霉素的DPBS緩沖液浸泡中浸泡4～6min；將浸泡完畢的眼球用DPBS緩沖液清洗1～3次，每次8～12s；(2)分離：對(duì)步驟(1)所得眼球分離角膜和虹膜，去除晶狀體和玻璃體，輕輕擠壓，使眼杯展開(kāi)，去除神經(jīng)層；(3)酶溶液浸泡清洗：將步驟(2)所得視杯轉(zhuǎn)移到1～3mL分離酶溶液(1X)中浸泡，在37℃下消化20～30min；(4)清洗：將步驟(3)所得視杯轉(zhuǎn)移到DPBS緩沖液中，從視杯中揭下RPE細(xì)胞層，并將RPE細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到5～10mL的DPBS緩沖液中，1800～2200rpm離心5～10min；(5)消化：離心結(jié)束后吸除上清，加入1～2mL質(zhì)量濃度為0.25％的TE緩沖液，在37℃下消化5～10min；(6)培養(yǎng)重懸：在步驟(5)所得消化后的RPE細(xì)胞中加入4～8mLRPE培養(yǎng)基，1800-2200rpm離心5～10min，吸除上清再用2～4mLRPE培養(yǎng)基重懸，然后接種到cell-start基質(zhì)膠包被的六孔板的一孔中；培養(yǎng)至第三天換液，然后每隔兩天換液一次，直到細(xì)胞達(dá)到覆蓋90％時(shí)傳代。進(jìn)一步的，步驟(1)所述加有青霉素-鏈霉素的DPBS緩沖液配置過(guò)程如下：取500mL的DPBS緩沖液，添加10mL的青霉素-鏈霉素，充分混合。進(jìn)一步的，步驟(6)所述RPE培養(yǎng)基配方如下：500mL的αMEM培養(yǎng)基，5mL的N1添加劑，5mL的谷氨酰胺，5mL的非必須氨基酸，150mg的牛磺酸，15μg氫化可的松，0.010μg的三碘甲狀腺原氨酸，50mL的人血小板裂解液，充分混合。進(jìn)一步的，氫化可的松和三碘甲狀腺原氨酸在配置RPE培養(yǎng)基時(shí)首先溶解在DPBS中，并保存在-20℃下。進(jìn)一步的，步驟(6)所述傳代具體為將所得RPE細(xì)胞由P0到P1傳代，方法為：取6孔板，采用1×DPBS緩沖液清洗，6孔板每孔加1～2mL質(zhì)量濃度為0.25％的TE緩沖液，培養(yǎng)箱中37℃孵育5～10min，然后加入5～10mLRPE培養(yǎng)基，收集RPE細(xì)胞至15mL離心管，細(xì)胞計(jì)數(shù)，1800～2200rpm離心5～10min，吸除上清，加RPE培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，6孔板中每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞。進(jìn)一步的，步驟(1)中所述的眼球?yàn)?2～18周的人類眼球。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的對(duì)人類RPE細(xì)胞層分離培養(yǎng)方法步驟簡(jiǎn)單易操作；在細(xì)胞分離的過(guò)程中能最大限度的保存RPE細(xì)胞層的完整性；在細(xì)胞分離過(guò)程中能完整的將RPE細(xì)胞層與脈絡(luò)層分離開(kāi)，獲得的細(xì)胞純度高；后續(xù)培養(yǎng)中細(xì)胞純度高、均一性高、增殖能力出色、能更早的分化成具有典型形態(tài)的細(xì)胞；為體外培養(yǎng)、擴(kuò)增RPE細(xì)胞，治療AMD等RPE細(xì)胞損傷提供了新來(lái)源。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1分離酶處理后分離結(jié)果示意圖。圖2為實(shí)施例2未經(jīng)分離酶處理后分離結(jié)果示意圖。圖3為分離酶處理后培養(yǎng)細(xì)胞示意圖(10d)。圖4為未經(jīng)分離酶處理培養(yǎng)細(xì)胞示意圖(10d)。具體實(shí)施方式為了使本領(lǐng)域的人員更好的了解本發(fā)明，并使本發(fā)明的上述優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例中的青霉素-鏈霉素、谷氨酰胺、非必須氨基酸購(gòu)自LIFETECHOLOGISE公司；DPBS緩沖液購(gòu)自GIBCO公司；DispaseⅡ購(gòu)自ROCHE羅氏公司；TE緩沖液購(gòu)自INVITROGEN公司；cell-start基質(zhì)膠、αMEM培養(yǎng)基、N1添加劑、?；撬?、氫化可的松、三碘甲狀腺原氨酸購(gòu)自SIGMA公司；人血小板裂解液購(gòu)自HELIOS公司。實(shí)施例1按照表1中的配方配置RPE培養(yǎng)基。表1組分含量α修飾低限基本培養(yǎng)基(MEM，αmodification)500mlN1添加劑(N1supplement)5ml谷氨酰胺(Glutamine)5ml非必須氨基酸(Nonessentialaminoacids)5ml牛磺酸(Taurine)150mg氫化可的松(Hydrocortisone)15ug三碘甲狀腺原氨酸(Triiodo-thyronin)0.010ug人血小板裂解液(HPL)50ml按照以下步驟分離培養(yǎng)人類RPE細(xì)胞：(1)緩沖液浸泡清洗：取12周的人類眼球，用加有青霉素-鏈霉素的DPBS緩沖液清洗眼球1次，6min，用DPBS緩沖液清洗2次，每次12s；所述加有青霉素-鏈霉素的DPBS緩沖液配置過(guò)程如下：取500mL的DPBS緩沖液，添加10mL的青霉素-鏈霉素，充分混合。(2)分離：在角膜邊緣2mm處切一小口，仔細(xì)的分離角膜和虹膜，取出晶狀體和玻璃體，剝離神經(jīng)層，輕輕擠壓視杯，將視杯平鋪；(3)酶溶液浸泡清洗：將視杯放入1mL分離酶溶液中，在37℃下浸泡25min；(4)清洗：將步驟(3)所得視杯從分離酶分離液中取出，轉(zhuǎn)移到1×DPBS緩沖液中，從視杯中揭下RPE細(xì)胞層，對(duì)所得RPE細(xì)胞層進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1所示；隨后將RPE細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到10mL的DPBS緩沖液中，2200rpm離心10min；(5)消化：離心結(jié)束后吸除上清，加入2mL質(zhì)量濃度為0.25％的TE緩沖液，在37℃下消化10min；(6)培養(yǎng)重懸：用移液器輕輕吹打步驟(5)所得RPE細(xì)胞層，將RPE細(xì)胞層吹散；在RPE細(xì)胞中加入8mLRPE培養(yǎng)基，2200rpm離心10min，吸除上清，再用4mLRPE培養(yǎng)基重懸，然后接種到cell-start(基質(zhì)膠)包被的六孔板的一個(gè)孔中；培養(yǎng)過(guò)夜，第三天換液，每周換液兩次，直到細(xì)胞達(dá)到覆蓋80％～90％時(shí)傳代，對(duì)其進(jìn)行觀察，具體結(jié)果如圖3所示，經(jīng)過(guò)分離酶處理的細(xì)胞生長(zhǎng)快，雜細(xì)胞少，純度高。氫化可的松和三碘甲狀腺原氨酸在配置RPE培養(yǎng)基時(shí)首先溶解在DPBS中，并保存在-20℃下。步驟(6)所述傳代具體為將所得RPE細(xì)胞由P0到P1傳代，方法為：取出RPE細(xì)胞，用1×DPBS緩沖液清洗，6孔板每孔加2mL質(zhì)量濃度為0.25％的TE緩沖液，培養(yǎng)箱中37℃孵育10min，然后加入10mLRPE培養(yǎng)基，收集RPE細(xì)胞至15mL離心管，細(xì)胞計(jì)數(shù)，2200rpm離心10min，吸除上清，加RPE培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，6孔板中每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞。實(shí)施例2RPE培養(yǎng)基配置同實(shí)施例1。具體步驟為：(1)緩沖液浸泡清洗：將18周的人類眼球，放入加有青霉素-鏈霉素的DPBS緩沖液浸泡中浸泡6min；將浸泡完畢的眼球用DPBS緩沖液清洗1次，每次12s；所述加有青霉素-鏈霉素的DPBS緩沖液配置過(guò)程如下：取500mL的DPBS緩沖液，添加10mL的青霉素-鏈霉素，充分混合。(2)分離：對(duì)步驟(1)所得眼球在角膜邊緣2mm處切一小口，仔細(xì)的分離角膜和虹膜，去除晶狀體和玻璃體，輕輕擠壓，使眼杯展開(kāi)，去除神經(jīng)層；(3)清洗：從視杯中揭下RPE細(xì)胞層，對(duì)所得RPE細(xì)胞層進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖2所示；將RPE細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到10mL的DPBS緩沖液中，2200rpm離心10min；(4)消化：離心結(jié)束后吸除上清，加入2mL質(zhì)量濃度為0.25％的TE緩沖液，在37℃下消化10min；(5)培養(yǎng)重懸：用移液器輕輕吹打步驟(4)所得RPE細(xì)胞層，將RPE細(xì)胞層吹散；在RPE細(xì)胞中加入10mLRPE培養(yǎng)基，2200rpm離心10min，吸除上清再用4mLRPE培養(yǎng)基重懸，然后接種到cell-start基質(zhì)膠包被的六孔板的一孔中；培養(yǎng)至第三天換液，然后每隔兩天換液一次，直到細(xì)胞達(dá)到覆蓋90％時(shí)傳代。氫化可的松和三碘甲狀腺原氨酸在配置RPE培養(yǎng)基時(shí)首先溶解在DPBS中，并保存在-20℃下。步驟(5)所述傳代具體為將所得人類RPE細(xì)胞由P0到P1傳代，方法為：取出RPE細(xì)胞，用1×DPBS緩沖液清洗，6孔板每孔加2mL質(zhì)量濃度為0.25％的TE緩沖液，培養(yǎng)箱中37℃孵育10min，然后加入10mLRPE培養(yǎng)基，收集RPE細(xì)胞至15mL離心管，細(xì)胞計(jì)數(shù)，2200rpm離心10min，吸除上清，加RPE培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，6孔板中每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞。對(duì)比實(shí)施例1取18周的人類眼球進(jìn)行分離培養(yǎng)人類RPE細(xì)胞，除未經(jīng)過(guò)分離酶溶液處理以外，同實(shí)施例1，對(duì)所得的RPE細(xì)胞培養(yǎng)操作同步。經(jīng)過(guò)分離酶溶液處理后RPE細(xì)胞分離結(jié)果示意圖如圖1所示，分離后RPE細(xì)胞層完整性高，純度較高，雜細(xì)胞較少。未經(jīng)分離酶溶液處理RPE細(xì)胞層分離結(jié)果示意圖如圖2所示，分離后RPE細(xì)胞層完整性差，純度低，雜細(xì)胞較多。經(jīng)過(guò)分離酶溶液處理后RPE細(xì)胞層培養(yǎng)后細(xì)胞如圖3所示，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，雜細(xì)胞少，純度高，能更快的形成RPE典型形態(tài)。未經(jīng)分離酶溶液處理后RPE細(xì)胞層培養(yǎng)后細(xì)胞如圖4所示，細(xì)胞增殖能力弱，雜細(xì)胞多，純度低，形成RPE典型形態(tài)能力差。在上述實(shí)施例1-2中，RPE細(xì)胞層經(jīng)過(guò)分離酶處理，其細(xì)胞層完整性、細(xì)胞純度、細(xì)胞均一性、后續(xù)細(xì)胞增殖能力均大幅度提高。以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的保護(hù)范圍并局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的即使范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求所界定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3