本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域中疫苗的制備方法，特別是涉及一種用BHK21-C13傳代細(xì)胞制備山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液，并在制品中添加耐熱保護(hù)劑，獲得獸用耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的方法。
背景技術(shù)：
山羊痘(Goat Pox)是由山羊痘病毒(Goat Pox Virus，GPV)引起的山羊的一種高度接觸性傳染病。病羊表現(xiàn)為體溫升高、無(wú)毛或少毛部位皮膚黏膜發(fā)生丘疹或結(jié)節(jié)、水皰、內(nèi)臟痘性病變、妊娠母羊發(fā)生流產(chǎn)、死亡率較高。山羊痘是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的法定報(bào)告?zhèn)魅静。覈?guó)將其列為一類動(dòng)物疾病。
現(xiàn)預(yù)防山羊痘的疫苗主要是弱毒活疫苗，國(guó)內(nèi)、外文獻(xiàn)多有報(bào)導(dǎo)。滅活疫苗(OIE Terrestrial Manual 2010,CHAPTER 2.7.14,SHEEP POX AND GOAT POX)雖安全性好，但存在免疫保護(hù)期短的缺陷，目前仍未得到廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)有報(bào)道使用BHK21傳代細(xì)胞制備山羊痘滅活疫苗的方法(專利文獻(xiàn)CN104958760A)，而無(wú)制備弱毒活疫苗的方法。基于不同細(xì)胞，所用培養(yǎng)溫度、接毒維持液種類、pH均有所不同，現(xiàn)制備山羊痘病毒液，常規(guī)使用羊睪丸細(xì)胞時(shí)，接毒工序液維持液多用乳漢液或MEM溶液；而在專利文獻(xiàn)CN104958760A中使用BHK21細(xì)胞(Baby Hamster Syrian Kidney，乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)制備山羊痘滅活疫苗的方法中，接毒工序的維持液使用乳歐液，在病毒培養(yǎng)階段，需每日據(jù)維持液pH降低程度，用堿液進(jìn)行校正至7.1-7.4；以上提到的維持液中，均要加入1-2％或3-5％不同含量的血清，培養(yǎng)溫度37℃。因山羊痘免疫機(jī)制的影響，滅活疫苗普遍存在免疫持續(xù)期短的缺陷，因此，滅活疫苗未得到全面推廣應(yīng)用。
預(yù)防山羊痘的活疫苗多采用羔羊睪丸細(xì)胞(LT)和羔羊腎細(xì)胞(LK)等原代細(xì)胞制備,使用原代細(xì)胞的明顯不足是各生產(chǎn)山羊痘活疫苗的廠家對(duì)羊同源性外源病毒(如藍(lán)舌病毒(BTV)、羊流產(chǎn)衣原體等)的檢測(cè)技術(shù)不完善，導(dǎo)致活疫苗對(duì)孕羊存在一定的安全隱患。山羊痘病毒在原代細(xì)胞的增殖周期較長(zhǎng)，一般5-7天，培養(yǎng)山羊痘病毒需添加一定量的新生牛血清，且原代LT、LK細(xì)胞的傳代次數(shù)多為5-10代，并且采集不同批次的組織制備原代細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性也有所差別，因此，常造成產(chǎn)品質(zhì)量的不穩(wěn)定。此外，由于采集羔羊睪丸存在季節(jié)性及敏感性的差異，給山羊痘活疫苗的常規(guī)生產(chǎn)亦帶來(lái)很多困擾。尤其近年來(lái)，隨著人感染布魯氏菌病比率的增加以及病情的嚴(yán)重性，給采集羔羊睪丸的工作人員帶來(lái)一定風(fēng)險(xiǎn)?；谏鲜鲈?，迫切需要一種創(chuàng)新的山羊痘弱毒活疫苗及其制備方法。
在山羊痘弱毒活疫苗的保護(hù)方面通常需要使用保護(hù)劑。常規(guī)凍干保護(hù)劑為含5％(W/V)蔗糖的牛奶，其用于普通山羊痘弱毒活疫苗，具有不耐熱的缺點(diǎn)；常規(guī)凍干曲線(方法)(不適用于耐熱保護(hù)劑的凍干，影響凍干制品的物理性狀指標(biāo))用于普通牛奶保護(hù)劑凍干活疫苗為：A、預(yù)階段：常溫進(jìn)箱，1-2h將制品降至-42℃并維持2h；B、升華干燥階段：1-2h將制品從-42℃升至-8℃并維持10h；0.5-1h將制品從-8℃升至0℃并維持0.5-1h；C、解吸干燥階段：1-2h將制品從0℃升至28℃并維持7h，凍干結(jié)束。
耐熱保護(hù)劑用于耐熱型山羊痘弱毒活疫苗，耐熱保護(hù)劑與普通凍干保護(hù)劑的主要區(qū)別是：后者需嚴(yán)格的冷凍保存條件，疫苗稀釋后，需盡快使用，易受熱環(huán)境影響而降低疫苗效價(jià)；制品中添加耐熱保護(hù)劑，可有效緩解適當(dāng)?shù)臒岘h(huán)境對(duì)疫苗效價(jià)的損失，適當(dāng)降低了保存條件的影響。已有的耐熱保護(hù)劑配方一(專利文獻(xiàn)CN104800842A)為：海藻糖50g/L，脫脂奶粉20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明膠10g/L，精氨酸1.5g/L，維生素C 2.5g/L；配方一曾用于山羊痘羊睪丸原代細(xì)胞活疫苗，但是成本偏高，未驗(yàn)證其耐熱效果；耐熱保護(hù)劑配方二(豬偽狂犬病活疫苗耐熱保護(hù)劑及凍干工藝研究—王穎：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2014屆碩士學(xué)位論文、第三章豬偽狂犬病毒耐熱保護(hù)劑篩選、第38頁(yè))為(W/V)：蔗糖15.2％，酶解酪蛋白7.6％，明膠4.0％，海藻糖1.0％；牛血清白蛋白2.0％，精氨酸鹽酸鹽2.0％，谷氨酸鈉2％，山梨醇2.0％，其余為注射用水；配方二可用于其它病毒(如偽狂犬病毒等)的弱毒活疫苗，目前未用于山羊痘弱毒活疫苗，是否適用也尚未可知?；谏鲜鲈颍惹行枰环N成本適中的耐熱型山羊痘弱毒活疫苗，以及一種與之相適的凍干保護(hù)劑及凍干曲線(方法)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用BHK21-C13傳代細(xì)胞制備山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液(接毒階段無(wú)血清添加)的方法。
本發(fā)明所提供的用BHK21-C13傳代細(xì)胞制備山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液的方法，包括以下步驟：
1)細(xì)胞選用及傳代培養(yǎng)：
選取經(jīng)支原體、外源病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性的BHK21-C13細(xì)胞作為種細(xì)胞，使用含8-10％(V/V)新生牛血清的MEM培養(yǎng)液，將BHK21細(xì)胞貼附方瓶或轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃下，方瓶靜置培養(yǎng)，或轉(zhuǎn)瓶10-12rph(轉(zhuǎn)/小時(shí))旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)；
2)病毒培養(yǎng)：
培養(yǎng)BHK21貼壁細(xì)胞48-72小時(shí)至細(xì)胞融合度達(dá)85-95％，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，將山羊痘弱毒AV41種毒按接毒溶液總量5-10％(V/V)含量加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于37℃吸附1小時(shí)，然后棄去種毒液，加入含10-20mmol HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)的無(wú)血清DMEM作為維持液，在34-36℃下，的方瓶靜置繼續(xù)培養(yǎng)或轉(zhuǎn)瓶10-12rph(轉(zhuǎn)/小時(shí))旋轉(zhuǎn)繼續(xù)培養(yǎng)；
3)病變觀察及毒液收獲：
每日觀察細(xì)胞病變，以細(xì)胞呈現(xiàn)間質(zhì)變寬、細(xì)胞圓縮、脫落等病變特征作為觀察判斷細(xì)胞病變指標(biāo)，至細(xì)胞病變率(CPE)達(dá)85％，收獲病毒液，測(cè)定TCID50，選取病毒液每0.1mL病毒含量≥105.5TCID50的為山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液。
在上述山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液的制備方法中，所述步驟1)中的外源病毒主要包括牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、藍(lán)舌病毒(BTV)。
所述步驟2)繼續(xù)培養(yǎng)中山羊痘弱毒AV41于BHK21細(xì)胞傳代，所述步驟3)收獲病毒液的時(shí)間為接毒后繼續(xù)培養(yǎng)72-120小時(shí)。
所述步驟3)收獲的病毒液為山羊痘弱毒AV41傳代至25-28代時(shí)，效價(jià)水平為每0.1mL病毒液中病毒含量≥105.5TCID50的山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液。
用上述方法制備得到的山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的方法。
本發(fā)明所提供的制備耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的方法，是向上述山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液中添加耐熱凍干保護(hù)劑，再經(jīng)冷凍干燥，得到外觀完好、易保存的耐熱型山羊痘弱毒活疫苗。
在上述耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的制備方法中，所述耐熱凍干保護(hù)劑各成分質(zhì)量百分含量及配制如下：
甲液：
蔗糖：15％，
酶解酪蛋白：5.8％，
明膠：4.0％，
海藻糖：1.0％，
其余為：注射用水；
甲液116℃高壓滅菌20分鐘；
乙液：
牛血清白蛋白：2.0％，
精氨酸鹽酸鹽：2.0％，
谷氨酸鈉：1.0％，
山梨醇：2.0％，
其余為：注射用水；
乙液用0.2um過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌；
將甲液與乙液按體積比1：1混合后得到耐熱凍干保護(hù)劑。
所述山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液的上清液與所述耐熱凍干保護(hù)劑按體積比1：1混合。
所述冷凍干燥的凍干曲線為：
預(yù)凍階段：常溫進(jìn)凍干箱，于80min內(nèi)預(yù)凍至-42℃，維持160min；
升華干燥階段：于120min內(nèi)升溫至-5℃，維持750min,于30min內(nèi)由-5℃升溫至-3℃，維持120min；
解吸干燥階段：于190min內(nèi)，由-3℃升溫至26℃，并于26℃二次干燥維持420min。
用上述方法得到的耐熱型山羊痘弱毒活疫苗也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明提供了一種制備耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的方法。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1)本發(fā)明基于現(xiàn)有的免疫原性良好的山羊痘弱毒AV41，于異源性BHK21細(xì)胞培養(yǎng)20代以上，其效力水平可穩(wěn)定達(dá)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，不僅有效規(guī)避了原羊睪丸同源性外源病毒的污染，提高了疫苗生產(chǎn)用原材料的可控性，穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量，降低批間差異，實(shí)現(xiàn)了全年產(chǎn)量的均質(zhì)供應(yīng)，而不是以前的僅局限于采睪丸季節(jié)，并降低了活疫苗毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)(返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)低)，傳代細(xì)胞疫苗在病毒產(chǎn)量、均一性、純粹等方面都優(yōu)于原代細(xì)胞疫苗。
2)優(yōu)化了培養(yǎng)條件：在接毒工序中，優(yōu)選出一種高效增殖山羊痘病毒的無(wú)血清營(yíng)養(yǎng)液，進(jìn)行種毒含量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等條件優(yōu)化試驗(yàn)，獲得較高TCID50效價(jià)的病毒液，優(yōu)化結(jié)果：培養(yǎng)溫度優(yōu)選至34-36℃，可有效提高毒液效價(jià)，使用含緩沖能力較強(qiáng)的HEPES(10-20mmol/L)的無(wú)血清DMEM作為維持液,72-120小時(shí)收獲毒液，縮短了病變時(shí)間，且病毒培養(yǎng)階段溶液的pH始終可達(dá)7.0以上，無(wú)需中途加堿，減少了操作步驟(生產(chǎn)便捷)，采用無(wú)血清培養(yǎng)液，并可有效控制成品疫苗外源病毒感染、降低疫苗使用中因血清引起的熱反應(yīng)、提高了疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定性及安全性，降低了生產(chǎn)成本。
3)在山羊痘活疫苗的使用中，用戶更傾向于使用稀釋后存放5-6小時(shí)，仍保持較高效價(jià)的苗，因此，添加適宜的耐熱凍干保護(hù)劑，可有效提高山羊痘活疫苗的耐熱性，滿足用戶的需求。本發(fā)明向耐熱型山羊痘弱毒活疫苗病毒液中添加耐熱凍干保護(hù)劑，較普通蔗糖奶粉保護(hù)劑，可有效緩解疫苗稀釋后于室溫放置7-8小時(shí)，TCID50效價(jià)衰減，滿足了市場(chǎng)用戶在注射使用中，免疫大量羊只，無(wú)低溫儲(chǔ)存條件，便捷使用，具有較高的社會(huì)效益。
4)本發(fā)明的耐熱型山羊痘弱毒活疫苗用于對(duì)山羊痘病毒敏感的純種孕黑山羊，對(duì)于較敏感的妊娠2-4月的孕羊，仍可安全使用，無(wú)流產(chǎn)。
綜上所述，本發(fā)明的耐熱型山羊痘弱毒活疫苗不僅可確保疫苗應(yīng)有的效力水平，具有較好的耐熱保護(hù)效果，還可確保純種孕羊的安全性，可滿足市場(chǎng)用戶的需求，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
附圖說(shuō)明
圖1為BHK21傳代正常細(xì)胞和經(jīng)山羊痘病毒感染的病變細(xì)胞
具體實(shí)施方式
所述百分比濃度如無(wú)特別說(shuō)明均為質(zhì)量/質(zhì)量(W/W，單位g/100g)百分比濃度、質(zhì)量/體積(W/V，單位g/100mL)百分比濃度或體積/體積(V/V，單位mL/100mL)百分比濃度。
實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá)到具體公開(kāi)的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來(lái)源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的來(lái)源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提示替換使用。
實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1、用BHK21傳代細(xì)胞制備山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液
本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，提供了一種用BHK21傳代細(xì)胞制備山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液的方法，即用BHK21傳代細(xì)胞在接種山羊痘病毒后無(wú)血清培養(yǎng)，培養(yǎng)得到的山羊痘病毒液可達(dá)較高TCID50效價(jià)(每0.1mL病毒液中病毒含量≥104.5TCID50)。
本發(fā)明用BHK21傳代細(xì)胞制備山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液的具體方法包括以下步驟：
1、細(xì)胞選用及培養(yǎng)
以往山羊痘活疫苗制備選取常規(guī)的牛睪丸或羊睪丸等原代細(xì)胞、次代細(xì)胞作為種細(xì)胞，但無(wú)法確保其藍(lán)舌病毒等致孕羊流產(chǎn)的重要外源病毒的檢測(cè)結(jié)果為陰性。本發(fā)明選取BHK21細(xì)胞，并選取經(jīng)支原體、外源病毒等項(xiàng)目檢測(cè)，支原體、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、藍(lán)舌病毒(BTV)等外源病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性的BHK21細(xì)胞，該步檢測(cè)從源頭上控制了山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液中的外源病毒污染(存在外源病毒將影響疫苗使用的安全性)。
不同來(lái)源BHK21細(xì)胞，其山羊痘病毒AV41增殖量差異較大。本發(fā)明經(jīng)過(guò)試驗(yàn)篩選、對(duì)比檢測(cè)，優(yōu)選出山羊痘病毒AV41適應(yīng)性培養(yǎng)病毒效價(jià)較高(每0.1mL病毒液中病毒含量≥104.5TCID50)的BHK21細(xì)胞-C13(乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞，購(gòu)自歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心ECACC)作為本發(fā)明用種細(xì)胞。
使用含8-10％(V/V)新生牛血清的MEM培養(yǎng)液(購(gòu)自宜興賽爾生物科技有限公司)，按傳代細(xì)胞常規(guī)操作方法，將分散密度適宜的BHK21細(xì)胞貼附方瓶或轉(zhuǎn)瓶(細(xì)胞培養(yǎng)瓶)，置37℃培養(yǎng)，方瓶：靜置培養(yǎng)；轉(zhuǎn)瓶：10-12rph(轉(zhuǎn)/小時(shí))旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。
2、病毒培養(yǎng)
培養(yǎng)BHK21貼壁細(xì)胞48-72小時(shí)，待細(xì)胞融合度達(dá)85-95％，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，將山羊痘弱毒AV41種毒(中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供)按接毒溶液總量5-10％(V/V)含量加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶(T175規(guī)格細(xì)胞培養(yǎng)瓶接毒溶液總量100mL，15000mL(15L)轉(zhuǎn)瓶接毒溶液總量1000mL(1L))，于37℃吸附1小時(shí)。然后棄去種毒液，加入含10-20mmolHEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸，作用：保持pH穩(wěn)定，pH始終可達(dá)7.0以上)的無(wú)血清DMEM作為維持液(作用：使細(xì)胞停止繁殖，但仍保持代謝)，置34-36℃繼續(xù)培養(yǎng)，方瓶：靜置培養(yǎng)；轉(zhuǎn)瓶：10-12rph(轉(zhuǎn)/小時(shí))旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。
該步培養(yǎng)中優(yōu)選出了一種高效增殖山羊痘病毒的無(wú)血清營(yíng)養(yǎng)液，進(jìn)行種毒含量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等條件優(yōu)化試驗(yàn)以獲得較高TCID50效價(jià)的病毒液。優(yōu)化的培養(yǎng)條件中，繼續(xù)培養(yǎng)溫度優(yōu)選至34-36℃低溫(接毒培養(yǎng)溫度不宜達(dá)37℃)，可延緩BHK21細(xì)胞的凋亡速度，可有效提高山羊痘病毒液效價(jià)；使用含緩沖能力較強(qiáng)的HEPES(10-20mmol/L)的無(wú)血清DMEM作為維持液，能夠縮短培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞的病變時(shí)間有助于后續(xù)能在72-120小時(shí)收獲毒液，且保持病毒培養(yǎng)階段溶液的pH始終達(dá)7.0以上，無(wú)需中途加堿，減少了操作步驟使生產(chǎn)更便捷，且不影響細(xì)胞的最佳濃度，從而有效提高產(chǎn)量毒，提升產(chǎn)品效價(jià)水平；采用無(wú)血清培養(yǎng)液，既可避免因血清中熱源物質(zhì)影響導(dǎo)致免疫羊的體溫反應(yīng)及其它過(guò)敏反應(yīng)，有效控制成品疫苗外源病毒感染，降低疫苗使用中因血清引起的熱反應(yīng)，提高了疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定性及安全性，也可減少近年因血清質(zhì)量不穩(wěn)定引起的產(chǎn)品批間差異，還可適度降低成本。
培養(yǎng)120小時(shí)的正常細(xì)胞形態(tài)如圖1A所示，可以看出存在散在圓縮細(xì)胞，細(xì)胞無(wú)明顯空洞，屬于正常細(xì)胞。
3、病變觀察及毒液收獲
每日觀察細(xì)胞病變，病變細(xì)胞判斷指標(biāo)是出現(xiàn)間質(zhì)變寬、細(xì)胞圓縮等病變特征，如圖1B所示，存在大量典型圓縮病變細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)明顯空洞。作為對(duì)照，BHK21貼壁細(xì)胞按步驟1條件培養(yǎng)120小時(shí)(未接毒培養(yǎng))的正常細(xì)胞形態(tài)如圖1A所示，可以看出存在散在圓縮細(xì)胞，細(xì)胞無(wú)明顯空洞，屬于正常細(xì)胞。
通過(guò)觀察可知，一般接毒后繼續(xù)培養(yǎng)72-120小時(shí)，細(xì)胞病變率(CPE)可達(dá)85％及以上(該收毒標(biāo)準(zhǔn)可獲得較高效價(jià)的病毒液)，此時(shí)收獲病毒液。收獲的病毒液于-20℃冰箱保存，取樣凍融兩次，測(cè)定TCID50。
步驟3中，山羊痘弱毒AV41在BHK21細(xì)胞中傳代，通過(guò)病變收毒時(shí)間穩(wěn)定性、效檢TCID50檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性、及后期的純種孕羊安全性、本地山羊效檢結(jié)果綜合評(píng)定，以確定其傳代代次。采取本發(fā)明優(yōu)化培養(yǎng)條件，山羊痘弱毒AV41于BHK21穩(wěn)定傳代至28代的TCID50效價(jià)如表1所示，可以看出雖然山羊痘病毒對(duì)異源傳代細(xì)胞的適應(yīng)性有一定過(guò)程(較低的培養(yǎng)代次不利于疫苗用毒液的大量擴(kuò)增，且異源細(xì)胞傳代次數(shù)少，仍容易發(fā)生和同源細(xì)胞制備活疫苗相同的缺陷：即免疫羊后出現(xiàn)毒力返強(qiáng)現(xiàn)象)，但經(jīng)BHK21細(xì)胞傳代至28代的山羊痘病毒液，仍效價(jià)穩(wěn)定、符合其半成品毒液效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(每0.1mL毒液中病毒含量≥104.5TCID50，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))，表明使用BHK21細(xì)胞傳代至28代以內(nèi)的山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液可穩(wěn)定用于生產(chǎn)。
考慮到較低的培養(yǎng)代次不利于疫苗用毒液的大量擴(kuò)增，且異源細(xì)胞傳代次數(shù)少，仍容易發(fā)生和同源細(xì)胞制備活疫苗相同的缺陷：即免疫羊后出現(xiàn)毒力返強(qiáng)現(xiàn)象；而在傳代細(xì)胞代次過(guò)高時(shí)，會(huì)影響到毒液的效價(jià)及成品苗的免疫性。因此，確定合適的山羊痘病毒于BHK21細(xì)胞繁殖代次至關(guān)重要，既避免毒力返強(qiáng)，又確保其免疫原性。綜合考慮活疫苗的毒力返強(qiáng)及免疫原性，優(yōu)選使用25-28代病毒液用于生產(chǎn)，這些病毒液每0.1mL中病毒含量≥105.5TCID50，效價(jià)高于標(biāo)準(zhǔn)。
表1山羊痘毒液F1-F28 TCID50效價(jià)
實(shí)施例2、制備耐熱型山羊痘弱毒活疫苗
本發(fā)明制備耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的方法，是向?qū)嵤├?獲得的山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液中添加耐熱凍干保護(hù)劑，再經(jīng)凍干(冷凍干燥)曲線，得到外觀完好、易保存的耐熱型山羊痘弱毒活疫苗。用常規(guī)凍干曲線獲得的產(chǎn)品，外觀性狀不達(dá)標(biāo)，本發(fā)明的優(yōu)化了凍干曲線，獲得了外觀完好的產(chǎn)品。添加耐熱保護(hù)劑對(duì)冷鏈要求不嚴(yán)格：據(jù)新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，普通弱毒活疫苗必須在-15℃以下保存，而耐熱型山羊痘弱毒活疫苗于2-8℃保存即可。
本發(fā)明耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的制備方法包括以下步驟：
1、疫苗配制、分裝
取實(shí)施例1獲得的用BHK21傳代細(xì)胞培養(yǎng)25-28代(F25-F28)的山羊痘無(wú)血清弱毒活疫苗病毒液，檢測(cè)TCID50，每0.1mL病毒液中病毒含量≥105.5TCID50，于-20℃冰箱凍融2次后(目的是將細(xì)胞內(nèi)病毒充分釋放)，2500-3000rpm、4℃離心10-15min，取上清液備用。
耐熱凍干保護(hù)劑的作用是對(duì)疫苗有效成分在冷凍干燥過(guò)程及凍干后儲(chǔ)存階段實(shí)施保護(hù)以保證疫苗免疫效果。本發(fā)明用于制備耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑各成分質(zhì)量百分含量及配制方法如下，該配方是在已有配方基礎(chǔ)上，為獲得更好的產(chǎn)品外觀及耐熱保護(hù)性，適當(dāng)調(diào)整個(gè)別成分含量獲得的：
甲液：
蔗糖：15％，
酶解酪蛋白：5.8％，
明膠：4.0％，
海藻糖：1.0％，
其余為：注射用水；
甲液于116℃高壓滅菌20分鐘；
乙液：
牛血清白蛋白：2.0％，
精氨酸鹽酸鹽：2.0％，
谷氨酸鈉：1.0％，
山梨醇：2.0％，
其余為：注射用水；
乙液用0.2um過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌；
將甲液與乙液按體積比1：1混合后得到耐熱凍干保護(hù)劑。
將耐熱凍干保護(hù)劑與病毒上清液按體積比1：1混合，充分搖勻，得到耐熱型山羊痘弱毒活疫苗病毒液。
分裝時(shí)，每頭份疫苗需含山羊痘弱毒活疫苗病毒液(上清液)0.015mL，與耐熱凍干保護(hù)劑按體積比1：1混合，按3mL(100頭份)/瓶分裝。
2、疫苗凍干
對(duì)耐熱型山羊痘弱毒活疫苗病毒液進(jìn)行凍干(冷凍干燥)，得到耐熱型山羊痘弱毒活疫苗(凍干粉劑)。
使用耐熱凍干保護(hù)劑后，常規(guī)的凍干曲線得到的凍干粉劑，其外觀性狀及穩(wěn)定性不達(dá)標(biāo)。為獲得良好的產(chǎn)品外觀及保持疫苗質(zhì)量穩(wěn)定，發(fā)明人優(yōu)化凍干過(guò)程，確定了以下凍干曲線：
預(yù)凍階段：常溫進(jìn)凍干箱，于80min內(nèi)預(yù)凍至-42℃，維持160min；
升華干燥階段：于120min內(nèi)升溫至-5℃，維持750min,于30min內(nèi)由-5℃升溫至-3℃，維持120min；
解吸干燥階段：于190min內(nèi)由-3℃升溫至26℃，并于26℃二次干燥，維持420min。
實(shí)施例3、耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的檢測(cè)
選取3批實(shí)施例1獲得的用BHK21傳代細(xì)胞培養(yǎng)至F28(選用25-28代)的山羊痘病毒液，分別用實(shí)施例2的方法制備3批(批號(hào)：S001、S002、S003)耐熱型山羊痘弱毒活疫苗(規(guī)格均為100頭份/瓶)，按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》檢驗(yàn)規(guī)程文獻(xiàn)中記載的方法對(duì)3批耐熱型山羊痘弱毒活疫苗成品進(jìn)行常規(guī)項(xiàng)目檢測(cè)，并增加疫苗的純種孕羊安全性及耐熱性檢驗(yàn)，具體檢驗(yàn)項(xiàng)目及檢測(cè)結(jié)果如表2-表4所示。
耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果如表2所示，可以看出經(jīng)培養(yǎng)條件及凍干優(yōu)化后的耐熱型山羊痘弱毒活疫苗可達(dá)該產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，表明使用BHK21傳代細(xì)胞制備的耐熱型山羊痘弱毒活疫苗可進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化。
表2耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的常規(guī)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果及結(jié)論
耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的純種孕羊安全性檢測(cè)結(jié)果如表3所示，可以看出3批制品用于純種敏感孕山羊，無(wú)流產(chǎn)現(xiàn)象，表明使用BHK21傳代細(xì)胞制備的耐熱型山羊痘弱毒活疫苗可安全用于敏感的孕山羊，具有良好的安全性。
表3 3批耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的孕羊安全性檢測(cè)結(jié)果
在山羊痘弱毒活疫苗的使用中，用戶更傾向于使用稀釋后存放5-6小時(shí)，仍保持較高效價(jià)的苗，因此，添加適宜的耐熱凍干保護(hù)劑，可有效提高山羊痘弱毒活疫苗的耐熱性，滿足用戶的需求。據(jù)耐熱試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及用戶使用需求進(jìn)行通用的耐老化試驗(yàn)(37℃環(huán)境保存10天),及將耐熱型山羊痘弱毒活疫苗稀釋后，室溫條件(23-25℃)保存7-8小時(shí)，耐熱型山羊痘弱毒活疫苗與山羊痘普通凍干活疫苗(與耐熱保護(hù)劑疫苗用同批抗原，同期自行制備，制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》：山羊痘活疫苗制造及檢驗(yàn)規(guī)程)的效價(jià)衰減及對(duì)比結(jié)果如表4所示。由表4可以看出，使用耐熱保護(hù)劑的疫苗較普通蔗糖牛奶保護(hù)劑的凍干苗，耐老化試驗(yàn)及疫苗稀釋后的常溫保存試驗(yàn)，對(duì)活疫苗效力衰減均有明顯改善，表明耐熱型山羊痘弱毒活疫苗對(duì)疫苗保存條件的要求、使用均有明顯優(yōu)越性。
表4耐熱型山羊痘弱毒活疫苗與山羊痘普通凍干活疫苗的耐熱性對(duì)比結(jié)果
本發(fā)明中涉及到的優(yōu)勢(shì)，與專利文獻(xiàn)CN104958760A(一種山羊痘滅活疫苗及其制備方法)中的山羊痘滅活疫苗進(jìn)行比較，主要在免疫持續(xù)期、成本、使用的廣泛性方面，結(jié)果如表5所示，使用專利文獻(xiàn)中所述206佐劑、免疫山羊痘滅活疫苗后，保護(hù)率達(dá)80％以上的持續(xù)時(shí)間僅達(dá)6月左右，而本發(fā)明的耐熱型山羊痘弱毒活疫苗的免疫保護(hù)持續(xù)時(shí)間可達(dá)1年。另外，專利文獻(xiàn)中使用206佐劑，價(jià)格明顯高于現(xiàn)活疫苗，因其滅活苗的免疫持續(xù)期較短，目前仍未得到用戶青睞，未在市場(chǎng)上獲得廣泛使用。
表5耐熱型山羊痘弱毒活疫苗與山羊痘滅活疫苗的攻毒保護(hù)率、免疫持續(xù)期對(duì)比結(jié)果