本發(fā)明涉及一株抗重金屬鎘的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株YH2及其應(yīng)用，屬于食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鎘(cadmium，Cd)是五種劇毒重金屬之一，通過食物鏈富集作用進(jìn)入人體，危害人類健康。超量的鎘進(jìn)入人體后，會造成腎功能損害、消化道疾病及肺炎等，鎘還被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物。因此，我國《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定飲用水鎘含量不得超過5ng/mL。GB 2762-2012《食品中污染物限量》中規(guī)定糧食食品鎘含量不超過200ng/mL，果蔬類不超過50ng/mL。

據(jù)統(tǒng)計，我國土壤的鎘污染非常嚴(yán)重，大米等糧食作物鎘含量超標(biāo)情況嚴(yán)重，對人民健康、國家經(jīng)濟(jì)造成很大損害。隨著鎘超標(biāo)事件的屢有發(fā)生，重金屬鎘的檢測受到廣泛關(guān)注。

目前常用的鎘檢測方法有電感耦合等離子體質(zhì)譜法、電化學(xué)分析法、石墨爐原子吸收光譜法等儀器檢測方法，檢測耗時長、費用高，難以用于現(xiàn)場檢測。因此建立一種快速簡便的鎘化合物檢測方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法（ELISA）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現(xiàn)場快速檢測。然而得到高檢測靈敏度和高特異性的單克隆單體是免疫學(xué)檢測的前提。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種對鎘離子具有較好特異性和檢測靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株YH2。

本發(fā)明的技術(shù)方案，一株抗重金屬鎘單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株YH2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC No.12027。

重金屬鎘單克隆抗體，它由所述保藏編號為CGMCC No.12027的重金屬鎘單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株YH2分泌產(chǎn)生。

所述重金屬鎘單克隆抗體的應(yīng)用，其可用于食品安全中重金屬鎘的殘留檢測。

本發(fā)明提供的細(xì)胞株YH2的制備基本步驟為：

1）完全抗原的合成：取1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸10mg溶于1mL二甲基亞砜中形成A液；10mg牛血清蛋白溶于1mL pH9.0的10mM HBS中形成B液；取100μL A液逐滴加入B液中，調(diào)節(jié)pH9.0，攪拌24h；用超濾管離心，得到1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸-牛血清蛋白；取150μL 1mg/mL硝酸鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液逐滴加入到1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸-牛血清蛋白中，調(diào)節(jié)pH8攪拌5h；用超濾管離心，得到檢測抗原（包被原）鎘-1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸-牛血清蛋白。用雙功能螯合劑1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸將鎘離子偶聯(lián)到匙孔血藍(lán)蛋白上，制成免疫抗原。

2）小鼠的免疫：二價鎘離子免疫抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強(qiáng)免疫之間間隔一個月，三次加強(qiáng)免疫之間隔21天。最后一次用完全免疫原（不含佐劑）沖擊免疫；通過間接ELISA檢測血清效價和抑制；

3）細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立：通過聚乙二醇（PEG4000）法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接ELISA檢測陽性細(xì)胞孔，并進(jìn)一步利用間接競爭ELISA法測定陽性細(xì)胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細(xì)胞孔進(jìn)行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株YH2；

4）雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定：通過ELISA法測定靈敏度和特異性。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明獲得的抗二價鎘離子單克隆抗體細(xì)胞株YH2，對Cd²⁺-ITCBE有較好的檢測靈敏度和特異性（IC₅₀值為0.1 ng/mL）。該細(xì)胞株分泌的抗體穩(wěn)定性好：雜交瘤細(xì)胞凍存于液氮中至少保存5年，純化的抗體在-20℃冰箱中至少可存放2年；抗體特異性高，與其他金屬離子暫未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。

生物材料樣品保藏：單克隆細(xì)胞株YH2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No.12027，保藏日期2016年1月20日，分類命名為單克隆抗體。

附圖說明

圖1.YH2分泌的單克隆抗體的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

本發(fā)明下面的實施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

本發(fā)明通過用二價鎘離子免疫原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過間接ELISA和間接競爭ELISA篩選細(xì)胞上清，最終得到了對Cd²⁺-ITCBE有較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株YH2。

實施例 1：雜交瘤細(xì)胞株YH2的制備

（1）完全抗原的合成 ：取1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸（ITCBE）10mg溶于1mL二甲基亞砜中形成A液；10mg牛血清蛋白溶于1mL pH9.0的10mM HBS中形成B液；取100μL A液逐滴加入B液中，調(diào)節(jié)pH9.0，攪拌24h；用超濾管離心，得到1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸-牛血清蛋白；取150μL 1mg/mL硝酸鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液逐滴加入到1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸-牛血清蛋白中，調(diào)節(jié)pH8攪拌5h；用超濾管離心，得到檢測抗原鎘-1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸-牛血清蛋白。用雙功能螯合劑1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸將鎘離子偶聯(lián)到匙孔血藍(lán)蛋白上，制成免疫抗原。

（2）動物免疫：選擇健康的6～8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。取二價鎘離子免疫原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強(qiáng)免疫之間隔一個月，三次加強(qiáng)免疫之間隔21天。三免后7天采血，使用間接競爭ELISA方法測定小鼠血清效價和抑制，選擇效價高抑制好的小鼠，在四免后18天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。

（3）細(xì)胞融合：在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG（聚乙二醇，分子量為4000）方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下：

a、無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；

b、收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；

c、將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照計數(shù)比1︰10 的比例混合，離心后用50% PEG融合，時間1 min，之后按照從慢到快，加入RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（4）細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立：在細(xì)胞融合的第3天對融合細(xì)胞進(jìn)行RPMI-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進(jìn)行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第7天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。

篩選分兩步：第一步先用間接ELISA篩選出陽性細(xì)胞孔，第二步選用Cd²⁺-ITCBE為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競爭ELISA對陽性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測定。選擇對Cd²⁺-ITCBE標(biāo)準(zhǔn)品均有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測。重復(fù)三次，獲得細(xì)胞株YH2。

（5）單克隆抗體的制備與鑒定：取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶雜交瘤細(xì)胞YH2，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20℃保存。

使用間接競爭ELISA，測定單克隆抗體對Cd²⁺-ITCBE的IC₅₀為0.1 ng/mL，說明對Cd²⁺-ITCBE有很好的靈敏度，可用于二價鎘離子免疫分析檢測。

（6）抗體應(yīng)用：將雜交瘤細(xì)胞株YH2通過體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于水中二價鎘離子的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測，具體步驟如下：

6.1包被：將包被原（Cd²⁺-ITCBE-BSA）用0.05M pH9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋為1.0μg/mL，100μL/孔加入酶標(biāo)板，37℃反應(yīng)2h；

6.2洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；

6.3封閉：拍干后，加入200μL /孔封閉液，37℃反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用；

6.4加樣：加入Cd²⁺-ITCBE和抗體：用含0.1 mM ITCBE的10μM HBS緩沖液倍比逐級稀釋Cd²⁺，每孔加入50μL，再加入稀釋一定倍數(shù)的抗體溶液50μL，37℃反應(yīng)0.5h；充分洗滌后，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，100μL /孔，37℃反應(yīng)0.5h；

6.5顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μL的TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)15min；

6.6終止和測定：每孔加入50μL終止液以終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測定各孔的OD₄₅₀值；

6.7結(jié)果判讀：以O(shè)D₄₅₀值大于或等于陰性對照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所對應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELISA效價，計算抑制率?？贵wIC₅₀=0.1ng/mL。結(jié)果表明，制備的抗體能較好的識別Cd²⁺-ITCBE。

表1.YH2分泌的單克隆抗體的交叉反應(yīng)率

（7）溶液的配置：

碳酸鹽緩沖液（CBS）：稱取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800mL混勻，調(diào)pH值至9.6，加雙蒸水定容至1000mL，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

磷酸鹽緩沖液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9 g Na₂HPO₄·12 H₂O，溶于800mL純水中，用NaOH或HCl調(diào)pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05% 吐溫 20的PBS；

HBS緩沖液：8.00g NaCl，0.2g KCl，HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）2.386g，溶于800mL純水中，用NaOH或HCl調(diào)pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

TMB顯色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至1000mL；B液：60mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按體積比1︰5混合即為TMB顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。

綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明申請專利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)。