一株分泌抗磺胺類抗生素單克隆抗體的雜交瘤細胞株NaN-1及其應(yīng)用，涉及雜交瘤細胞株NaN-1及其產(chǎn)生的抗磺胺類抗生素單克隆抗體，屬于食品安全免疫學(xué)檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
磺胺類抗生素（sulfonamide antibiotics, SAs）是人工合成的抗菌藥，用于臨床已近50年，它具有抗菌譜較廣、性質(zhì)穩(wěn)定、使用簡便等優(yōu)點。這類抗生素也是畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的一類抗菌藥物，其常常用于預(yù)防和治療畜禽疾病，以及作為飼料添加劑促進動物生長。但由于其對人體潛在的危害性以及致病菌耐藥性的產(chǎn)生，其在食品中的殘留問題引起了廣泛關(guān)注。近年來，各個國家加強了對SAs的監(jiān)控，分別制定了動物源性食品中SAs的最大殘留量。國際食品法典委員會、歐盟及歐美一些國家明確規(guī)定食品中SAs總含量不得超過0.1 mg/kg。
目前SAs的檢測方法主要有儀器檢測法（如高效液相色譜法，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法），酶聯(lián)免疫檢測方法（ELISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）以及膠體金免疫層析技術(shù)。由于儀器分析方法的樣品前處理繁瑣、耗時、儀器貴重、需要專業(yè)人員操作，不能實現(xiàn)大量樣品的同時檢測。ELISA是一種極為高效、靈敏的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高、操作簡便，適用于大量樣本的現(xiàn)場快速檢測。但要實現(xiàn)對磺胺類抗生素的同時檢測，制備群選性的單克隆抗體是前提。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的是提供一種抗磺胺類抗生素的群選性單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株制備的抗體能識別二十五種SAs，且具有較好的檢測靈敏度，可以用來建立SAs的免疫學(xué)檢測方法。
本發(fā)明提供一種對SAs具有較廣的識別性和較好的檢測靈敏度的單克隆抗體的制備方法。
本發(fā)明提供的一株抗磺胺類抗生素單克隆抗體雜交瘤細胞株NaN-1，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC No.12028。
抗磺胺類抗生素單克隆抗體，它由所述保藏編號為CGMCC No.12028的抗磺胺類抗生素單克隆抗體雜交瘤細胞株NaN-1所分泌產(chǎn)生。
所述抗磺胺類抗生素單克隆抗體的應(yīng)用，在磺胺類抗生素分析檢測中的應(yīng)用，用于食品安全中磺胺類抗生素的多殘留檢測。
本發(fā)明提供的NaN-1細胞株的制備基本步驟為：
1）免疫原的合成：500 mg氨基噻唑乙酸溶于7.5mL無水甲醇中，在溶液中加入400 mg二氯亞砜。反應(yīng)液回流2h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除揮發(fā)物，殘余物用飽和碳酸氫鈉溶液中和，然后用乙酸乙酯萃取后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到中間體Ⅰ，300 mg 中間體Ⅰ與 600 mg 4-乙酰氨基苯磺酰氯溶解于15mL吡啶中，在室溫下反應(yīng)3h，將反應(yīng)液濃縮得到中間體Ⅱ，134 mg中間體Ⅱ溶解在5 mL、1M 氫氧化鈉溶液中，加熱至80℃，在氮氣保護下反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后蒸發(fā)掉揮發(fā)物，殘余物用鹽酸中和，然后用乙酸乙酯萃取兩次。將得到的目標液干燥并蒸發(fā)掉有機溶劑，最后在真空下濃縮，得到目標半抗原。
半抗原是帶有羧基的產(chǎn)物，用碳二亞胺法進行偶聯(lián)。具體步驟為： 稱取 20 mg 半抗原 溶解于 5 mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入 15.1 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與 12.8 mg N-羥基琥珀酰亞胺，在室溫下活化4h；稱取50 mg 牛血清白蛋白溶解于 6 mL 碳酸鹽緩沖溶液中，將活化液滴加進蛋白溶液中，室溫反應(yīng)過夜。用0.01M 磷酸鹽緩沖溶液透析3天去除未偶聯(lián)上的半抗原，得到完全抗原，并用紫外進行表征。
包被原的合成與免疫原的合成過程類似，只需將載體蛋白換成雞卵清白蛋白。
2）小鼠的免疫：完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首次免疫與加強免疫之間間隔一個月，加強免疫之間間隔21天。最后一次直接用完全抗原（不含佐劑）沖擊免疫，通過間接ELISA檢測血清效價和抑制；
3）細胞融合和細胞株的建立：通過聚乙二醇（PEG 4000）法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接ELISA檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭ELISA法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株NaN-1；
4）雜交瘤細胞株NaN-1性質(zhì)的鑒定：通過ELISA法測定靈敏度和特異性。
本發(fā)明獲得的抗SAs單克隆抗體，對二十五種磺胺類抗生素有較好的檢測靈敏度，其中對磺胺嘧啶（sulfadiazine,SD）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine,SMR）、磺胺二甲氧嘧啶（sulfadimidine,SDM）及磺胺噻唑（sulfathizzole,STZ）的IC50分別為：4.51，1.80，1.98及0.53 μg/L。
生物材料樣品保藏：單克隆抗體雜交瘤細胞株NaN-1，巳保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，分類命名為單克隆細胞株，保藏編號為CGMCC No.12028，保藏日期2016年1月 20日。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的一株抗磺胺類抗生素單克隆抗體雜交瘤細胞株NaN-1，此細胞株分泌的單克隆抗體，可以識別二十五種磺胺類抗生素，且具有較好的檢測靈敏度，其中對磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶及磺胺噻唑的IC50分別為：4.51，1.80，1.98及 0.53μg/L可以用于食品安全中磺胺類抗生素的多殘留檢測。
附圖說明
圖1：NaN-1分泌的單克隆抗體對SD的抑制標準曲線。
具體實施方式
本發(fā)明下面的實施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
本發(fā)明通過將SAs的完全抗原免疫小鼠，通過細胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過間接ELISA和間接競爭ELISA篩選細胞上清，最終得到了對SAs有較廣的識別性和較好的靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株NaN-1。
實施例 1：雜交瘤細胞株NaN-1的制備
1、抗原的合成
500 mg氨基噻唑乙酸于溶7.5mL無水甲醇中，在溶液中加入400mg二氯亞砜。反應(yīng)液回流2h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除揮發(fā)物，殘余物用飽和碳酸氫鈉溶液中和，然后用乙酸乙酯萃取后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到中間體Ⅰ，300 mg 中間體Ⅰ與 600 mg 4-乙酰氨基苯磺酰氯溶解于15mL吡啶中，在室溫下反應(yīng)3h，將反應(yīng)液濃縮得到中間體Ⅱ，134 mg 中間體Ⅱ溶解在5 mL、1M 氫氧化鈉溶液中，加熱至80℃，在氮氣保護下反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后蒸發(fā)掉揮發(fā)物，殘余物用鹽酸中和，然后用乙酸乙酯萃取兩次。將得到的目標液干燥并蒸發(fā)掉有機溶劑，最后在真空下濃縮，得到目標半抗原。
半抗原是帶有羧基的產(chǎn)物，用碳二亞胺法進行偶聯(lián)。具體步驟為： 稱取 20 mg 半抗原 溶解于 5 mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入 15.1 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與 12.8 mg N-羥基琥珀酰亞胺，在室溫下活化4h，稱取50 mg 牛血清白蛋白溶解于 6 mL 碳酸鹽緩沖溶液中，將活化液滴加進蛋白溶液中，室溫反應(yīng)過夜。用0.01M 磷酸鹽緩沖溶液 透析3天去除未偶聯(lián)上的半抗原，得到完全抗原，并用紫外進行表征。
包被原的合成與免疫原的合成過程類似，只需將載體蛋白換成雞卵清白蛋白。
2、動物免疫
選擇健康的6～8周齡的BALB/c小鼠進行免疫。取完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首次免疫與加強免疫之間間隔一個月，加強免疫之間間隔21天。三免后7天采血，使用間接競爭ELISA方法測定小鼠血清效價和抑制，選擇效價高且能識別較多SAs的小鼠，在四免后18天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。
3、細胞融合
在沖擊免疫3天后，按照常規(guī)PEG（聚乙二醇，分子量為4000）方法進行細胞融合，具體步驟如下：（1）無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細胞篩網(wǎng)得到脾細胞懸液，并進行細胞計數(shù)；（2）收集SP2/0細胞，懸浮于RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進行細胞計數(shù)；（3）將脾細胞和SP2/0細胞按照計數(shù)比1︰10 的比例混合，離心后用50% PEG融合，時間1 min，之后按照從慢到快，加入RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4、細胞篩選與細胞株建立
在細胞融合的第3天對融合細胞進行RPMI-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640過渡培養(yǎng)液進行全換液，在第7天取細胞上清進行篩選。篩選分兩步：第一步先用間接ELISA篩選出陽性細胞孔，第二步選用SD，SMR, SDM及STZ為標準品，用間接競爭ELISA對陽性細胞進行抑制效果測定。選擇對這四種標準品均有較好抑制的細胞孔，采用有限稀釋法進行亞克隆，用同樣的方法進行檢測。重復(fù)三次，獲得細胞株NaN-1。
5、單克隆抗體的制備與鑒定
取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106雜交瘤細胞NaN-1，從第7天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于 -20℃保存。
使用間接競爭ELISA，測定單克隆抗體對二十五種SAs的IC50見表1；
表1 NaN-1分泌的單克隆抗體的交叉反應(yīng)率
說明對它們有較好的靈敏度，可用于免疫分析檢測。
6. 抗體應(yīng)用
將雜交瘤細胞株NaN-1通過體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于幾種磺胺類抗生素（SD，SMR，SDM，STZ）的ELISA添加回收試驗，具體步驟如下：
（1）包被：將包被原用0.05M pH 9.6 碳酸鹽緩沖液從2μg/mL開始倍比稀釋，100 μL/孔，37℃反應(yīng)2h；
（2）洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；
（3）封閉：拍干后，加入200 μL/孔封閉液，37℃反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用；
（4）加樣：將抗血清從1︰1000開始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，100μL/孔，37℃反應(yīng)1h；充分洗滌后，加入1︰3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，100 μL/孔，37℃反應(yīng)1h；
（5）顯色：將酶標板取出，充分洗滌后，每孔加入100 μL的TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)15min；
（6）終止和測定：每孔加入50μL終止液以終止反應(yīng)，然后用酶標儀測定各孔的OD 450值。
（7）結(jié)果判讀：以O(shè)D450值大于或等于陰性對照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所對應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELISA效價；
（8）添加回收及樣品前處理：以加入SD的添加回收試驗為例，吸取1mL牛奶于15mL離心管中，向牛奶中分別添加20ng，50ng, 100ng SD，用0.01M PBS稀釋牛奶 10倍，采用間接ELISA 進行添加回收試驗。SMR的添加回收試驗添加量分別為：1ng, 2ng, 5ng；SDM的添加量為：10ng, 20ng, 50ng；STZ的添加量為：1ng，2ng，5ng；NaN-1單克隆抗體對SD，SMR，SDM及和STZ四種藥物的添加回收實驗結(jié)果，其回收率見表2。
表2：
溶液的配置：
碳酸鹽緩沖液（CBS）：稱取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800 mL混勻，調(diào)pH值至9.6，加雙蒸水定容至1000 mL，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>
磷酸鹽緩沖液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2 g KH2PO4，2.9 g Na2HPO4?12 H2O，溶于800mL純水中，用NaOH或HCl調(diào)pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；
PBST：含0.05% 吐溫 20的PBS；
TMB顯色液：A液：Na2HPO4?12H2O 18.43g，檸檬酸 9.33g，純水定容至1000 mL；B液：60mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按體積比1︰5混合即為TMB顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。
綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明申請專利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。