本發(fā)明涉及一種單克隆細(xì)胞株C4及其產(chǎn)生的群選性單克隆抗體和應(yīng)用，屬于免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
喹諾酮類是一類人工合成的以4-喹諾酮為基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥，其通過作用于細(xì)菌的脫氧核糖核酸（DNA），阻礙DNA回旋酶，造成細(xì)菌DNA的不可逆破壞而達(dá)到抗菌效果。然而，許多喹諾酮類抗生素已經(jīng)被證實(shí)對(duì)人類和動(dòng)物有一定程度的毒性影響，特別是萘啶酸已經(jīng)被證實(shí)有致癌和致突變作用，影響光敏性以及對(duì)繁殖系統(tǒng)有干擾作用。另外，因喹諾酮類抗生素的濫用而造成的抗生素殘留問題也日益威脅著環(huán)境，及人類健康。
目前，針對(duì)喹諾酮類抗生素的分析方法有儀器分析方法和免疫分析法。其中應(yīng)用最廣泛的包括高效液相色譜分析方法 (HPLC)、氣質(zhì)聯(lián)用 (GC-MS)、液質(zhì)聯(lián)用 (LC-MS)等。然而這些方法需要昂貴的儀器、專業(yè)的操作人員和復(fù)雜的樣品前處理，不適用于食品中喹諾酮類抗生素的日?？焖贆z測。隨著檢測喹諾酮類抗生素的免疫檢測技術(shù)的發(fā)展，不僅可以解決上述問題，并且具有高通量和低成本的優(yōu)勢(shì)，適于現(xiàn)場的批量檢測。建立喹諾酮類抗生素的免疫檢測技術(shù)，首先要獲得喹諾酮類抗生素的群選性單克隆抗體。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供了一種單克隆細(xì)胞株C4，其能夠產(chǎn)生同時(shí)識(shí)別21種喹諾酮類抗生素的群選性單克隆抗體，能夠用于建立喹諾酮類抗生素的免疫檢測技術(shù)。
一種單克隆細(xì)胞株C4，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 12026。
一種喹諾酮類抗生素群選性單克隆抗體，其由保藏號(hào)為 CGMCC No.12026的單克隆細(xì)胞株C4產(chǎn)生。
其進(jìn)一步特征在于：所述喹諾酮類抗生素包括諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、那氟沙星、依諾沙星、洛美沙星、左氧氟沙星、培氟沙星、萘啶酸、達(dá)氟沙星、吡啶酸、西諾沙星、堊喹酸、馬波沙星、帕珠沙星、司氟沙星、加替沙星、奧比沙星和氟羅沙星。
本發(fā)明還提供了上述喹諾酮類抗生素群選性單克隆抗體在檢測喹諾酮類抗生素總量中的應(yīng)用。
以及，上述喹諾酮類抗生素群選性單克隆抗體在制備檢測喹諾酮類抗生素的免疫工具中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果 ：由單克隆細(xì)胞株C4產(chǎn)生的群選性單克隆抗體可以同時(shí)識(shí)別21 種喹諾酮類抗生素, 包括諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、那氟沙星、依諾沙星、洛美沙星、左氧氟沙星、培氟沙星、萘啶酸、達(dá)氟沙星、吡啶酸、西諾沙星、堊喹酸、馬波沙星、帕珠沙星、司氟沙星、加替沙星、奧比沙星和氟羅沙星；且靈敏度好，半數(shù)抑制濃度（IC 50）在 0.1-50ng/mL 之間；為研制食品中喹諾酮類多殘檢測的免疫工具提供了原料，例如免疫層析試紙條。
生物保藏說明
用于保藏的雜交瘤細(xì)胞株的分類名為：單克隆細(xì)胞株C4；
保藏單位全稱：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；
保藏單位簡稱：CGMCC；
保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所；
保藏日期：2016年1月20日
保藏編號(hào)：CGMCCNo.12026。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了單克隆細(xì)胞株C4號(hào)及其分泌的抗喹諾酮類抗生素的群選性單克隆抗體。下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，實(shí)施例中如無特殊說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1 單克隆細(xì)胞株C4 號(hào)的制備
1、動(dòng)物免疫和血清篩選
選擇半抗原 1（H1）和血藍(lán)蛋白（KLH）的偶聯(lián)物（H1-KLH）作為免疫原。
首免采用完全佐劑和免疫原1：1體積混合，以皮下免疫方式免疫BALB/c小鼠，免疫間隔時(shí)間4周，五免后 7-10d，采用間接競爭酶聯(lián)免疫法測定血清的效價(jià)和抑制，選擇效價(jià)高并抑制好的小鼠進(jìn)行融合。
其中，半抗原1為那氟沙星衍生物，半抗原 1的結(jié)構(gòu)為：
。
免疫原的結(jié)構(gòu)為：
。
2、細(xì)胞融合
融合前7至10天，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基在5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)瘤細(xì)胞。融合前3天，對(duì)選出的小鼠進(jìn)行腹腔沖刺免疫，融合當(dāng)天，摘眼球取血，采用頸椎脫臼法處死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5 min 左右，采用無菌操作取出 BALB/c 小鼠的脾臟，用注射器的膠頭適度用力地在篩網(wǎng)上研磨脾臟，脾細(xì)胞漏出篩網(wǎng)得到懸液，收集，離心（1200rpm，6 min），用 RPMI-1640 培養(yǎng)基洗滌脾細(xì)胞三次，最后一次離心后，將脾細(xì)胞稀釋到一定體積后，計(jì)數(shù)，備用。
第三步，融合，將脾細(xì)胞和 SP2/0 瘤細(xì)胞按照質(zhì)量比 5-10:1 比例進(jìn)行混合，離心（1200 rpm，6 min），棄上清。融合過程大概約 7 min。第 1 min 內(nèi)，將 1 mL 的 PEG 1500 由慢到快滴加到細(xì)胞中 ；第 2 min，用手握住管底，靜置。第 3 min 和第 4 min，在 1 min 內(nèi)滴加 1 mL 的 RPMI-1640 培養(yǎng)基 ；第 5 min 和第 6 min，在 1 min 內(nèi)滴加 2 mL 的 RPMI-1640培養(yǎng)基。第 7 min，在 1 min 內(nèi)滴加 3-4 mL 的 RPMI-1640 培養(yǎng)基。然后用 RPMI-1640 培養(yǎng)基將體積增加到 15 mL。在 37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，靜置 5 min。離心（800 rpm，6 min），棄上清，在棉球上輕輕地彈散細(xì)胞，然后用 HAT 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照 200μL/ 孔注入到 96 孔細(xì)胞板。最后，置于 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、篩選和亞克隆
融合按第1天計(jì)，第4天進(jìn)行HAT培養(yǎng)基半換液，第6天進(jìn)行HAT培養(yǎng)基全換液 ；并且每天觀察 96 孔細(xì)胞板中雜交瘤細(xì)胞的生長情況。第 8 天進(jìn)行融合后細(xì)胞上清的第一次檢測。
在抗體篩選過程中，用五種代表性的標(biāo)準(zhǔn)品沙拉沙星，氟甲喹，環(huán)丙沙星，諾氟沙星，恩諾沙星篩選細(xì)胞上清。篩選細(xì)胞上清的方法仍然是間接競爭酶聯(lián)免疫法，先將細(xì)胞上清稀釋3倍，測定效價(jià)。然后再測每個(gè)陽性孔的抑制。因?yàn)榭瞻字荡笮?，?duì)抗體靈敏度的影響很大，所以，在測定細(xì)胞上清抑制時(shí)，往往需要對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行多個(gè)不同倍數(shù)的稀釋。最后根據(jù)檢測結(jié)果，選擇陽性強(qiáng)，抑制好并且生長狀態(tài)良好的細(xì)胞通過有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。第一次亞克隆以后，第 6 天就可以取細(xì)胞上清進(jìn)行測定。按照和融合后細(xì)胞檢測一樣的方法和原理，篩選亞克隆后細(xì)胞上清的效價(jià)和抑制。經(jīng)過第二、三次亞克隆以后，根據(jù)陽性率 98% 并且整塊板的抑制效果相近，選出細(xì)胞擴(kuò)培和凍存。
實(shí)施例2 群選性單克隆抗體的制備、純化
1、群選性單克隆抗體的制備
選擇健康的 BALB/c 小鼠，按照 0.6 mL/ 只小鼠的量注射無菌石蠟油。10 天后，每只小鼠腹腔注射1*106雜交瘤細(xì)胞。第6天后，每天觀察小鼠的狀態(tài)，如果小鼠的腹部明顯增大，用手觸摸有緊繃感，并且不愿活動(dòng)時(shí)，可以收集腹水 ；然后離心（6000 rpm，12 min），除去紅細(xì)胞等雜質(zhì)，分裝，-20℃凍存。
2、群選性單克隆抗體純化
采用辛酸 - 硫酸銨沉淀法純化腹水。在pH=4條件下，正辛酸可以沉淀腹水中除 IgG 免疫球蛋白外的其他雜蛋白，然后離心，棄沉淀 ；再用飽和的硫酸銨溶液沉淀 IgG 型的單克隆抗體，離心，棄上清，用 0.01M PBS 溶液（pH 7.0）溶解后，透析脫鹽，最終得到純化后的群選性單克隆抗體。
實(shí)施例3 靈敏度的測定
抗體靈敏度采用半數(shù)抑制濃度（IC 50）來表示。純化的腹水通過間接競爭酶聯(lián)免疫法（ic-ELISA）來測定單克隆抗體對(duì) 21種喹諾酮類抗生素濃度在 0-200 ng/mL 之間的抑制效果。選擇半抗原 2（H2）和雞卵清蛋白（OVA）的偶聯(lián)物（H2-OVA）作為包被原，其中，半抗原2為帕珠沙星。
半抗原 2的結(jié)構(gòu)為：
。
包被原的結(jié)構(gòu)為：
。
偶聯(lián)物（H1-KLH）以及偶聯(lián)物（H2-OVA）均可通過戊二醛法得到。
本發(fā)明在那氟沙星的哌嗪環(huán)上引入酰胺基形成那氟沙星衍生物，作為半抗原1（H1），再通過戊二醛法和血藍(lán)蛋白偶聯(lián)用作免疫原，充分暴露喹諾酮類共有的母核結(jié)構(gòu)，從而得到識(shí)別多種喹諾酮類的群選性抗體；將帕珠沙星，即半抗原2（H2），通過戊二醛法和雞卵清蛋白偶聯(lián)，形成異源包被，從而提高方法的靈敏度。
包被原 H2-OVA濃度為 0.1μg/mL，抗體的蛋白濃度為 0.08μg/mL，測定結(jié)果用 origin 8.5 軟件進(jìn)行四參數(shù)回歸擬合，根據(jù)擬合的回歸方程，計(jì)算抗體對(duì)各種喹諾酮類抗生素的 IC 50 ，檢測結(jié)果見表 1。
表1：