專利名稱：生物樣品中多殘留磺胺類抗生素的高效分離純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分析化學、食品安全、獸藥殘留領域，具體地說，是涉及復雜生物樣品中磺胺類抗生素多殘留的高選擇性、快速分離、富集和純化方法。
背景技術：
磺胺類抗生素(Sulfonamides，SAs)是一類化學合成的抗生素，它對多數(shù)革蘭氏陽性菌及某些革蘭氏陰性菌有抑制作用，被廣泛應用于治療各種動物的細菌性感染疾病， 但是磺胺類抗生素可導致機體過敏反應、破壞機體的造血系統(tǒng)、導致各種貧血癥的發(fā)生。尤其是，目前抗生素在食品中的殘留問題十分普遍，世界上許多國家都對動物源性食品中的抗生素殘留限量作了嚴格規(guī)定，加拿大、歐盟、美國等國家規(guī)定動物組織中磺胺類藥物總量的最大殘留量是100μ g/kg ；我國農業(yè)部第235號文件規(guī)定其在動物源性食品中磺胺類抗生素的最高殘留限量(MRL)為0. lmg/kg。因此，磺胺類抗生素的檢測對保障我國動物性產品出口貿易的正常發(fā)展和人民身體健康具有重要意義。目前，對磺胺類抗生素殘留的分析檢測方法主要有分光光度法、示波極譜法、熒光光度法、毛細管電泳法(CE)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜質譜聯(lián)用法(HPLC-MQ及用于快速檢測的放射免疫法和酶聯(lián)免疫法。但是由于樣品基質的復雜性和多樣性，常規(guī)檢測方法和儀器往往無法從復雜的樣品中準確的檢測到痕量的違禁藥物殘留；而且復雜的樣品基質會影響檢測儀器的壽命，增加檢測成本。同時，在檢測過程中，樣品的前期處理占用的時間和工作量通常占整個檢測過程的60 %以上，導致檢測效率較低。中國發(fā)明專利申請CN200810052542. 8所公開的《磺胺甲惡唑分子印跡聚合物的制備方法》，該申請采用磺胺甲惡唑為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體、離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽為致孔劑、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，制備得到的分子印跡聚合物用于固相萃取和高效液相色譜填料對磺胺甲惡唑分子表現(xiàn)出較好的識別特異性。但是該申請中的分子印跡聚合物只對磺胺甲惡唑具有識別性， 對其它的磺胺類抗生素則沒有識別性。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的現(xiàn)狀提供一種生物樣品中多殘留磺胺類抗生素的高效分離純化方法，其通過利用對磺胺類抗生素特異的分子印跡聚合物作為基質固相分散萃取技術的填料，進一步通過對萃取條件的優(yōu)化，建立一種復雜生物樣品中磺胺類抗生素多殘留分離純化方法，以達到從復雜生物樣品中快速、高選擇性的分離和富集磺胺類抗生素多殘留、有效的去除樣品基質的干擾、同時提高了檢測靈敏度和準確度的目的。本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為該生物樣品中多殘留磺胺類抗生素的高效分離純化方法，其特征在于包括以下步驟(1)制備分子印跡聚合物按模板分子功能單體交聯(lián)劑的摩爾比1 2 8 25的比例配料，通過本體聚合法獲得對磺胺類抗生素具有特異識別功能的分子印跡聚合物；其中，所述的模板分子為磺胺二甲氧嘧啶，所述的功能單體為甲基丙烯酸，所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；(2)稱取0. 1-0. 3g待分離生物樣品于研缽中，用研缽磨碎，加入適量上述分子印跡聚合物，進一步勻漿后得到勻漿樣品；(3)將所述的勻漿樣品置于固相萃取小柱中，依次用2. 0-4. OmL水、 2. 0-4. OmLlOwt %乙腈水溶液淋洗，然后用3. 0-5. OmL甲醇/甲酸混合溶液洗脫；磺胺類抗生素即溶于甲醇/甲酸洗脫液中從所述的待分離生物樣品中分離出來；其中，所述甲醇/甲酸混合溶液中甲醇與甲酸的體積比為90 10。較好的，步驟O)中所述勻漿樣品中待分離生物樣品與所述分子印跡聚合物的重量比為2 5。上述各方案中所采用的固相萃取小柱為聚丙烯固相萃取小柱，其能獲得更佳的萃取效果。較好的，所述固相萃取小柱的體積可以為3-10mL。為獲得理想的分離純化效果，提高樣品回收率，上述各方案中，步驟(3)中所述勻漿樣品置于所述固相萃取小柱之前，可以先向所述的固相萃取小柱中預裝20-30mg所述的分子印跡聚合物。眾所周知，制備可同時特異識別一類物質的分子印跡聚合物及解決模板分子的滲漏對檢測結果的干擾，模板分子的選擇是關鍵。模板分子的選擇不僅對分子印跡聚合物的識別特性具有重要的影響，而且對分離純化效果也有一定的影響。本發(fā)明在大量試驗的基礎上，選擇磺胺二甲氧嘧啶為模板分子，進一步結合功能單體、交聯(lián)劑用量及比例的優(yōu)化， 制備得到一種具有固定孔穴和特定功能基團排列的高分子交聯(lián)聚合物，對磺胺類抗生素具有較好的特異識別功能，可同時實現(xiàn)對多種磺胺類抗生素的特異性識別，例如同時識別磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲氧嘧啶等，適用性廣；將其應用于基質固相分散萃取，表現(xiàn)出較好的分離、純化性能，尤其適用于復雜生物樣品中多殘留磺胺類抗生素的快速高效分離純化，并且模板分子殘留對檢測結果干擾小，檢測效率高，分離富集效果好。


圖1為本發(fā)明實施例1中分離效果的液相色譜圖；圖2為本發(fā)明實施例2中分離效果的液相色譜圖；圖3為本發(fā)明實施例3中分離效果的液相色譜圖。
具體實施例方式以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。下述各實施例中分子印跡聚合物的制備方法如下稱取適量功能單體甲基丙烯酸和模板分子磺胺二甲氧嘧啶(SDM)溶解于15mL乙腈稀釋劑中，加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA 5mL、偶氮二異丁腈引發(fā)劑120mg， 超聲脫氣5 lOmin，混合均勻后，通入氮氣10 15min，密封。置于60°C水浴中反應Mh ；聚合反應結束后，將合成的塊狀聚合物取出研磨、過篩后依次用甲醇甲酸(90 10, ν/ V)、甲醇通過索氏萃取除去模板分子，用丙酮反復沉降以除去過細的聚合物顆粒，然后將除去模板分子的聚合物在50°C真空干燥，即得到對磺胺類抗生素具有特異識別功能的分子印跡聚合物。實施例1.(一 )磺胺類抗生素分子印跡聚合物的制備準確稱取功能單體甲基丙烯酸2mmol和模板分子磺胺二甲氧嘧啶Immol溶解于 15mL乙腈中，加入交聯(lián)劑EGDMA 25mmol、引發(fā)劑偶氮二異丁腈120mg，超聲脫氣5min，混合均勻后，通入氮氣10 15min，密封。置于60°C水浴中反應24h ；聚合反應結束后，將合成的塊狀聚合物取出研磨、過篩后依次用甲醇甲酸(90 10，ν/ν)、甲醇通過索氏萃取除去模板分子，用丙酮反復沉降以除去過細的聚合物顆粒，然后將除去模板分子的聚合物在50°C 真空干燥，即得到分子印跡聚合物。( 二)磺胺類抗生素基質固相分散萃取方法，具體步驟如下選擇市購且經檢測體內無磺胺類抗生素殘留的魚作為樣品，向該魚樣品中加入磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺間二甲氧嘧啶，三種加標濃度如表1所示。稱取0. 2g加標后的魚樣品于研缽中，用研缽磨碎，加入0. 5g分子印跡聚合物，進一步勻漿后，得到勻漿樣品。(2)向下端帶有墊片的IOmL聚丙烯固相萃取小柱中預裝20mg分子印跡聚合物，然后將勻漿樣品置于聚丙烯固相萃取小柱中。(3)依次用2. OmL水、3. OmL 10wt%乙腈水溶液淋洗聚丙烯固相萃取小柱中的勻漿樣品，然后用3mL體積比為90 10甲醇/甲酸混合液進行洗脫，磺胺類抗生素即溶于甲醇/甲酸洗脫液中。(三)分離效果的檢測基質固相分散萃取獲得的甲醇/甲酸洗脫液40°C氮氣吹干后，溶于0. 5mL液相色譜流動相中，0. 22 μ m濾膜過濾后用高效液相色譜-紫外檢測器檢測。檢測結果如表1所示，其液相色譜如圖1所示。實施例2(一 )磺胺類抗生素分子印跡聚合物的制備準確稱取功能單體甲基丙烯酸4mmol和模板分子磺胺二甲氧嘧啶Immol溶解于 15mL乙腈中，加入交聯(lián)劑EGDMA 25mmol、引發(fā)劑偶氮二異丁腈120mg，超聲脫氣5 lOmin， 混合均勻后，通入氮氣15min，密封。置于60°C水浴中反應Mh ；聚合反應結束后，將合成的塊狀聚合物取出研磨、過篩后依次用甲醇甲酸(90 10，ν/ν)、甲醇通過索氏萃取除去模板分子，用丙酮反復沉降以除去過細的聚合物顆粒，然后將除去模板分子的聚合物在50°C 真空干燥，即得到分子印跡聚合物。( 二)磺胺類抗生素基質固相分散萃取方法，具體步驟如下(1)選用市場購買的、經檢測后體內無磺胺類抗生素殘留的蝦作為樣品，向該蝦樣品中加入磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺間二甲氧嘧啶。三種加標濃度如表1所示。
經檢測稱取0.2g蝦于研缽中，用研缽磨碎，加入0. Ig分子印跡聚合物，進一步勻漿后，得到勻漿樣品。(2)向下端帶有墊片的IOmL聚苯乙烯固相萃取小柱中預裝20mg分子印跡聚合物， 將勻漿樣品置于聚苯乙烯固相萃取小柱中。(2)依次用2. OmL水、3. OmL 10wt%乙腈水溶液淋洗聚苯乙烯固相萃取小柱，然后用體積比為90 10的甲醇/甲酸混合液進行洗脫，勻漿樣品中受到磺胺類抗生素即溶于甲醇/甲酸洗脫液中。(三)分離效果的檢測基質固相分散萃取獲得的甲醇/甲酸洗脫液40°C氮氣吹干后，溶于0. 5mL液相色譜流動相中，0. 22 μ m濾膜過濾后用高效液相色譜-紫外檢測器檢測。檢測結果如表1所示，其液相色譜如圖2所示。實施例3(一 )磺胺類抗生素分子印跡聚合物的制備準確稱取功能單體甲基丙烯酸Smmol和模板分子磺胺二甲氧嘧啶Immol溶解于 15mL乙腈中，加入交聯(lián)劑EGDMA 25mmol、引發(fā)劑偶氮二異丁腈120mg，超聲脫氣lOmin，混合均勻后，通入氮氣lOmin，密封。置于60°C水浴中反應Mh ；聚合反應結束后，將合成的塊狀聚合物取出研磨、過篩后依次用甲醇甲酸(90 10，ν/ν)、甲醇通過索氏萃取除去模板分子，用丙酮反復沉降以除去過細的聚合物顆粒，然后將除去模板分子的聚合物在50°C真空干燥，即得到分子印跡聚合物。( 二)磺胺類抗生素基質固相分散萃取方法，具體步驟如下(1)選擇市購且經檢測體內無磺胺類抗生素殘留的豬肉作為樣品，向該豬肉樣品中加入磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺間二甲氧嘧啶，三種加標濃度如表1所示。稱取0. 2g加標后的豬肉樣品于研缽中，用研缽磨碎，加入0. 3g分子印跡聚合物， 進一步勻漿后，得到勻漿樣品；(2)向下端帶有墊片的IOmL聚丙烯固相萃取小柱中預裝30 mg分子印跡聚合物， 將勻漿樣品置于聚苯乙烯固相萃取小柱中。(3)將獲得固相萃取小柱依次用2. OmL水、2. OmLlOwt 10%乙腈水溶液淋洗，然后用3mL甲醇/甲酸(90/10，ν/ν)洗脫，獲得對磺胺類抗生素多殘留分離純化技術。(三)分離效果的檢測基質固相分散萃取獲得的甲醇/甲酸洗脫液40°C氮氣吹干后，溶于0. 5mL液相色譜流動相中，0. 22 μ m濾膜過濾后用高效液相色譜-質譜檢測。檢測結果如表1所示，其液相色譜如圖3所示。表 權利要求
1.生物樣品中多殘留磺胺類抗生素的高效分離純化方法，其特征在于包括以下步驟(1)制備分子印跡聚合物按模板分子功能單體交聯(lián)劑的摩爾比1 2 8 25 的比例配料，通過本體聚合法獲得對磺胺類抗生素具有特異識別功能的分子印跡聚合物；其中，所述的模板分子為磺胺二甲氧嘧啶；所述的功能單體為甲基丙烯酸，所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；(2)稱取一定量待分離生物樣品于研缽中，用研缽磨碎，加入適量上述分子印跡聚合物，進一步勻漿后得到勻漿樣品；其中待分離生物樣品與分子印跡聚合物的重量比為 2 1-5。(3)將所述的勻漿樣品置于固相萃取小柱中，依次用2.0-4. OmL水、2. 0-4. OmL IOwt% 乙腈水溶液淋洗，然后用3. 0-5. OmL甲醇/甲酸混合溶液洗脫；磺胺類抗生素即溶于甲醇/ 甲酸洗脫液中從所述的待分離生物樣品中分離出來；其中，所述甲醇/甲酸混合溶液中甲醇與甲酸的體積比為90 10。
2.根據(jù)權利要求1所述的生物樣品中多殘留磺胺類抗生素的高效分離純化方法，其特征在于步驟O)中所述勻漿樣品中待分離生物樣品與所述分子印跡聚合物的重量比為2 · 5 ο
3.根據(jù)權利要求1或2所述的生物樣品中多殘留磺胺類抗生素的高效分離純化方法， 其特征在于所述的固相萃取小柱為聚丙烯固相萃取小柱。
4.根據(jù)權利要求3所述的生物樣品中多殘留磺胺類抗生素的高效分離純化方法，其特征在于所述固相萃取小柱的體積為3-10mL。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的生物樣品中多殘留磺胺類抗生素的高效分離純化方法， 其特征在于步驟(3)中所述勻漿樣品置于所述固相萃取小柱之前，先向所述的固相萃取小柱中預裝20-30mg所述的分子印跡聚合物。
6.根據(jù)權利要求3所述的生物樣品中多殘留磺胺類抗生素的高效分離純化方法，其特征在于步驟(3)中所述勻漿樣品置于所述固相萃取小柱之前，先向所述的固相萃取小柱中預裝20-30mg所述的分子印跡聚合物。
7.根據(jù)權利要求4所述的生物樣品中多殘留磺胺類抗生素的高效分離純化方法，其特征在于步驟(3)中所述勻漿樣品置于所述固相萃取小柱之前，先向所述的固相萃取小柱中預裝20-30mg所述的分子印跡聚合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種生物樣品中多殘留磺胺類抗生素的高效分離純化方法，其特征在于包括以下步驟(1)制備分子印跡聚合物按模板分子功能單體交聯(lián)劑的摩爾比1∶2～8∶25的比例配料，通過本體聚合法獲得對磺胺類抗生素具有特異識別功能的分子印跡聚合物；(2)稱取一定量待分離生物樣品于研缽中，用研缽磨碎，加入適量上述分子印跡聚合物，進一步勻漿后得到勻漿樣品；其中待分離生物樣品與分子印跡聚合物的重量比為2∶1-5。(3)將所述的勻漿樣品置于固相萃取小柱中，依次用2.0-4.0mL水、2.0-4.0mL 10wt％乙腈水溶液淋洗，然后用3.0-5.0mL甲醇/甲酸混合溶液洗脫；磺胺類抗生素即溶于甲醇/甲酸洗脫液中從所述的待分離生物樣品中分離出來。本發(fā)明所提供的方法選擇性廣、分離純化效果好。
文檔編號G01N30/14GK102279232SQ20111007622
公開日2011年12月14日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權日2011年3月24日
發(fā)明者史西志, 孫愛麗, 孟原, 李德詳, 陳炯 申請人:寧波大學