發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及新的沙門氏菌噬菌體性、其組合物以及它們的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

沙門氏菌被認(rèn)為是目前世界范圍內(nèi)最重要的食源性致病菌之一，據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，我國(guó)發(fā)生的食源性疾病，70％-80％是由沙門氏菌引起的。由于沙門氏菌血清型眾多，在自然界分布廣泛，可通過污染蛋類、肉類、奶類等食品導(dǎo)致人類食物中毒；家禽被沙門氏菌感染后出現(xiàn)禽傷寒、禽副傷寒、雞白痢等疾病。沙門氏菌屬目前有腸道沙門氏菌和邦戈?duì)柹抽T氏菌2個(gè)種。有資料報(bào)道，截止2007年底有2700種以上的血清型，分屬46個(gè)O群，而我國(guó)檢測(cè)到的血清型達(dá)290種以上。現(xiàn)今生產(chǎn)中抗生素的濫用使許多細(xì)菌出現(xiàn)了耐藥性，而耐藥菌株在臨床病人中不斷增多，特別是多耐藥株，將嚴(yán)重地危及到感染病人的治療效果。這使得沙門氏菌病原菌的防治面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

噬菌體是一類細(xì)菌依賴性病毒，可以侵染細(xì)菌，并在菌體內(nèi)繁殖使細(xì)菌裂解而殺滅細(xì)菌。噬菌體作為細(xì)菌的天然克星，在控制細(xì)菌感染方面有著突出的優(yōu)越性。早在20世紀(jì)初，用噬菌體治療細(xì)菌感染就取得過積極的效果。因其對(duì)于特異性宿主菌具有裂解作用，因此可考慮到將噬菌體作為一種抗細(xì)菌感染的制劑來使用。

李夢(mèng)哲(寬譜沙門氏菌噬菌體STP4-a的發(fā)酵制備及其在蛋雞體內(nèi)的抑菌研究[D].中國(guó)海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文，2014)發(fā)現(xiàn)沙門氏菌噬菌體STP4-a可識(shí)別沙門氏菌，其裂解率為80.04％；包紅朵等(腐敗希瓦氏菌噬菌體的性質(zhì)和防腐應(yīng)用研究[D].中國(guó)海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文，2012.)發(fā)現(xiàn)沙門氏菌 噬菌體PSA-6a可裂解5株沙門氏菌及1株大腸桿菌。

CN200980000314.9公開了新型噬菌體和包含所述噬菌體的抗菌組合物，以用于治療和預(yù)防雞沙門氏菌的傳染病的治療；CN201010508259.9公開了一株沙門氏菌噬菌體及其應(yīng)用，以用于控制沙門氏菌對(duì)食品和器具的污染。

目前，如何豐富廣譜性噬菌體資源，尋找強(qiáng)裂解性新的噬菌體是本技術(shù)領(lǐng)域?qū)τ谏抽T氏菌病原菌防治中急需解決的問題。而從污水中篩選烈性噬菌體是研發(fā)新型抑菌制劑以促進(jìn)噬菌體療法發(fā)展的一條有效途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上技術(shù)情況，本發(fā)明提供了新的沙門氏菌噬菌體、其組合物以及它們的制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明所述噬菌體為肌尾噬菌體BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌體BP-63(Myoviridae sp.BP-63)或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)，

其中所述肌尾噬菌體BP-66(Myoviridae sp.BP-66)的保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，郵編430072；保藏日期為2015年3月23日；保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015146，

所述肌尾噬菌體BP-63(Myoviridae sp.BP-63)的保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，郵編430072；保藏日期為2015年3月23日；保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015145；

所述長(zhǎng)尾噬菌體BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)的保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，郵編430072；保藏日期為2015年3月23日；保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015141。

作為本發(fā)明實(shí)施方案之一，所述肌尾噬菌體BP-66具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；肌尾噬菌體BP-63具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)肌尾噬菌體BP-66與肌尾噬菌體BP-63具有相同的核苷酸序列，它們之間卻具有不同的特性，例如包括但不限于：1、噬菌體之間的 壓力耐受性幾乎相差兩倍；2、在裂解譜測(cè)定中，對(duì)于DT193A這株細(xì)菌，肌尾噬菌體BP-66能裂解，但是肌尾噬菌體BP-63不能裂解；3、在同一濃度的裂解能力上，肌尾噬菌體BP-66的裂解能力更高。

本發(fā)明所述肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63、長(zhǎng)尾噬菌體BP-12是從加拿大蒙特利爾污水處理廠中分離出的。其中，

肌尾噬菌體BP-66的生物學(xué)特征為：在電子顯微鏡下觀察BP-66噬菌體形態(tài)發(fā)現(xiàn)，其為有尾噬菌體，無折疊，具有短收縮尾部與線性雙鏈DNA(圖4)，基于其獨(dú)特的大小及形態(tài)，根據(jù)病毒分類國(guó)際委員會(huì)(ICTV)定義，該噬菌體被系統(tǒng)分類為肌尾噬菌體科(Myoviridae)。

肌尾噬菌體BP-63的生物學(xué)特征：在電子顯微鏡下觀察BP-63噬菌體形態(tài)發(fā)現(xiàn)，其為有尾噬菌體，無折疊，具有短收縮尾部與線性雙鏈DNA(圖5)，基于其獨(dú)特的大小及形態(tài)，根據(jù)病毒分類國(guó)際委員會(huì)(ICTV)定義，該噬菌體被系統(tǒng)分類為肌尾噬菌體科(Myoviridae)。

長(zhǎng)尾噬菌體BP-12的生物學(xué)特征：在電子顯微鏡下觀察BP-12噬菌體形態(tài)發(fā)現(xiàn)，其為有尾噬菌體，無折疊，具有長(zhǎng)且無收縮尾部與線性雙鏈DNA(圖6)，基于其獨(dú)特的大小及形態(tài)，根據(jù)病毒分類國(guó)際委員會(huì)(ICTV)定義，該噬菌體被系統(tǒng)分類為長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)。

肌尾噬菌體BP-66全基因組序列大小為40kb(圖7)。將序列與局部序列排比檢索基本工具中現(xiàn)存的所有噬菌體序列進(jìn)行比對(duì)。通過BLAST程序計(jì)算比對(duì)的顯著差異。采用核酸比對(duì)程序(mega blast)搜索相似度較高的序列以及更多不相同的序列。結(jié)果表明，噬菌體BP-66與肌尾噬菌體科的相似度最高。結(jié)合形態(tài)特征和全基因組序列分析，噬菌體BP-66鑒定為肌尾噬菌體BP-66(Myoviridae sp.BP-66)。肌尾噬菌體BP-66(Myoviridae sp.BP-66)具有如SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

肌尾噬菌體BP-63全基因組序列大小為40kb(圖7)。將序列與局部序列排比檢索基本工具中現(xiàn)存的所有噬菌體序列進(jìn)行比對(duì)。通過BLAST程序計(jì)算比對(duì)的顯著差異。采用核酸比對(duì)程序(mega blast)搜索相似度較高的序列以及更多不相同的序列。結(jié)果表明，BP-63噬菌體序列與可對(duì)比噬菌體序列相似度均較低，小于70％。依其形態(tài)特征可將BP-63噬菌體分類為 肌尾噬菌體科(Myoviridae)，但序列比對(duì)結(jié)果顯示其與已知噬菌體親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，無法進(jìn)行匹配。因此BP-63可鑒定為肌尾噬菌體BP-63(Myoviridae sp.BP-63)。肌尾噬菌體BP-63(Myoviridae sp.BP-63)具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

長(zhǎng)尾噬菌體BP-12全基因組序列大小為40kb(圖7)。將序列與局部序列排比檢索基本工具中現(xiàn)存的所有噬菌體序列進(jìn)行比對(duì)。通過BLAST程序計(jì)算比對(duì)的顯著差異。采用核酸比對(duì)程序(mega blast)搜索相似度較高的序列以及更多不相同的序列。結(jié)果表明，BP-12噬菌體與長(zhǎng)尾噬菌體科Chilikevirus屬的相似度最高。結(jié)合形態(tài)特征和全基因組序列分析，BP-12噬菌體鑒定為長(zhǎng)尾噬菌體BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)。所述長(zhǎng)尾噬菌體BP-12(Chilikevirus BP-12)具有如SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

本發(fā)明所述述肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12不含毒力基因或不良基因，其中所述的不含毒力基因或不良基因是指不包括表6所記載的毒力基因或不良基因。

本發(fā)明所述肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體(Myoviridae)BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12不識(shí)別非致病性細(xì)菌；

作為實(shí)施方案之一，所述非治病性細(xì)菌包括肌尾噬菌體BP-63不可識(shí)別的57株非致病性細(xì)菌、肌尾噬菌體BP-66不可識(shí)別的56株非致病性細(xì)菌、或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12不可識(shí)別57株非致病性細(xì)菌，其中肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63和長(zhǎng)尾噬菌體BP-12均不識(shí)別的非致病性細(xì)菌包括54株非致病性細(xì)菌；其中上述所述的非致病性細(xì)菌是指表9所具體記載的肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12所不識(shí)別的非致病性細(xì)菌。

本發(fā)明所述肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12不識(shí)別非宿主性致病性細(xì)菌。

作為本發(fā)明實(shí)施方案之一，所述非宿主性致病性細(xì)菌為184株非宿主性致病性細(xì)菌；以上所述非宿主性致病性細(xì)菌是指表10所記載的肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12所不識(shí)別的非宿主性株致病性細(xì)菌。

作為本發(fā)明實(shí)施方案之一，本發(fā)明的另一目的在于提供了所述肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12在裂解沙門氏菌范圍中的應(yīng)用。

作為本發(fā)明實(shí)施方案之一，所述的沙門氏菌包括肌尾噬菌體BP-63可裂解的35株血清型腸道沙門氏菌、肌尾噬菌體BP-66可裂解的38株血清型腸道沙門氏菌、或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12可裂解的22株血清型腸道沙門氏菌。其中，所述肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63和長(zhǎng)尾噬菌體BP-12都可裂解的包括43血清型腸道沙門氏菌；其中以上所述的血清型腸道沙門氏菌是指表7所記載的肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12可裂解的血清型腸道沙門氏菌株。

作為本發(fā)明實(shí)施方案之一，所述沙門氏菌還包括肌尾噬菌體BP-63可裂解的22株不同血清型腸道沙門氏菌、肌尾噬菌體BP-66可裂解的25株不同血清型腸道沙門氏菌、或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12可裂解的24株不同血清型腸道沙門氏菌；其中肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63和長(zhǎng)尾噬菌體BP-12均可裂解的包括25株不同血清型腸道沙門氏菌；其中以上所述的不同血清型腸道沙門氏菌是指表8所示記載的肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12可裂解的血清型腸道沙門氏菌。

作為本發(fā)明實(shí)施方案之一，所述肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12的濃度為108PFU/ml、107PFU/ml、106PFU/ml、105PFU/ml。

作為實(shí)施方案之一，本發(fā)明還提供一種肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12的制備方法，所述制備方法包括：

1-1)采集加拿大蒙特利爾污水處理廠水樣離心取上清液，然后與LB液體培養(yǎng)基與處于對(duì)數(shù)期的沙門氏菌均勻混合，于37℃過夜培養(yǎng)，富集噬菌體；

1-2)將樣本富集液離心，取上清液除菌得到含有噬菌體的濾液，取濾液與其宿主沙門氏菌菌液均勻混合，靜置使其與細(xì)菌表面的受體充分結(jié)合；

1-3)將上述混合液加入半固體瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后立即鋪于已凝固的固體瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)，形成噬菌斑后取噬菌斑，接種于液體培養(yǎng)基 中，加入沙門氏菌菌液并混勻過夜培養(yǎng)，3500rpm離心10min取上清后以細(xì)菌濾膜過濾，采用雙層平板法觀察噬菌斑形態(tài)；

1-4)重復(fù)步驟3)的操作3-5次后，即可得形狀和大小一致的噬菌斑，即得肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12。其中，所述噬菌體為肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12，其中肌尾噬菌體BP-66的保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015146，肌尾噬菌體BP-63的保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015145，長(zhǎng)尾噬菌體BP-12保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015141。

經(jīng)過核苷酸測(cè)序，所述肌尾噬菌體BP-66具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；肌尾噬菌體BP-63具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

其中所述肌尾噬菌體BP-66和肌尾噬菌體BP-63具有相同的核苷酸序列。

本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12的發(fā)酵方法，所述方法包括：2-1)取肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12的菌落，接種到LB培養(yǎng)液中振蕩得到宿主菌懸液；

2-2)將菌懸液稀釋轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期并測(cè)定其菌懸液濃度；

2-3)調(diào)節(jié)噬菌體BP-66或BP-12的發(fā)酵初始pH值為6、噬菌體BP-63發(fā)酵初始pH值為2；

2-4)采用火焰接種法接種，向LB液體培養(yǎng)基中分別接入噬菌體和對(duì)數(shù)期宿主菌液并發(fā)酵，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，并加入消泡劑；

2-5)發(fā)酵結(jié)束后，將噬菌體與宿主菌的全部混合液取出并離心，上清液經(jīng)真空抽氣泵抽濾至無菌過濾器裝置內(nèi)，得到噬菌體發(fā)酵液并于4℃下保存，即得。

作為本發(fā)明實(shí)施方案之一，所述制備或發(fā)酵方法中，所述LB培養(yǎng)液或LB固體培養(yǎng)基的配方為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，蒸 餾水1000ml，pH 7.0。

作為本發(fā)明實(shí)施方案之一，本發(fā)明還提供一種噬菌體的組合物，所述組合物含有肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63和長(zhǎng)尾噬菌體BP-12中的任意兩種或三種的組合物。

作為示例性的說明，如肌尾噬菌體BP-66和肌尾噬菌體BP-63的組合物、肌尾噬菌體BP-66和長(zhǎng)尾噬菌體BP-12的組合物、肌尾噬菌體BP-63和長(zhǎng)尾噬菌體BP-12的組合物，以及肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63和長(zhǎng)尾噬菌體BP-12的組合物，它們的之間的比例關(guān)系可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合本發(fā)明以及實(shí)際的應(yīng)用領(lǐng)域以及本領(lǐng)域常識(shí)進(jìn)行確定。

作為進(jìn)一步的實(shí)施方案之一，所述噬菌體組合物包括含有肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63和長(zhǎng)尾噬菌體BP-12；作為更進(jìn)一步的實(shí)施方案之一，所述組合物中肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63和長(zhǎng)尾噬菌體BP-12的生物量比為1∶1∶1。

本發(fā)明述肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12在噬菌體效價(jià)、裂解沙門氏菌的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)、pH穩(wěn)定性、溫度及壓力對(duì)噬菌體存活的影響、存活穩(wěn)定性等方面具有如下的生理特性：具有較高的效價(jià)(參見表1)其中長(zhǎng)尾噬菌體BP-12、肌尾噬菌體BP-63及BP-66感染腸道沙門氏菌的最佳MOI分別為0.00007、0.1及0.1；并具有高度親和性及裂解能力的烈性噬菌體，可迅速裂解沙門氏菌(表2)；所述噬菌體BP-66在pH為6時(shí)生長(zhǎng)活性所受影響最小，BP-63最適pH為2，BP-12則為6(表3)；對(duì)溫度的熱穩(wěn)定性均相對(duì)較好，同時(shí)對(duì)壓力的耐受性較好；適宜4℃低溫存放。

而且肌尾噬菌體BP-66、BP-63及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12無毒力基因或不良基因；對(duì)沙門氏菌的裂解范圍：供試噬菌體具有較寬的宿主范圍，可識(shí)別除2270號(hào)菌株以外所有44株不同血清型的腸道沙門氏菌。而且在不同濃度下與沙門氏菌的互作，在低濃度下依然對(duì)宿主菌具有裂解性。

本發(fā)明所述肌尾噬菌體BP-66、BP-63及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12對(duì)非致病性細(xì)菌的裂解：僅與大腸桿菌有限的幾株菌株(29株供試菌株中的3株)反應(yīng)。更進(jìn)一步地、所述長(zhǎng)噬菌體BP-12及本發(fā)明所述肌尾噬菌體BP-66、 BP-63及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12的組合物無法識(shí)別除1株蘇云金芽孢桿菌及5株大腸桿菌外的其余非致病性細(xì)菌。

本發(fā)明肌尾噬菌體BP-66、BP-63及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12與非宿主性致病性細(xì)菌的互作，無法識(shí)別173株供試非宿主性致病性細(xì)菌中的任何一株。

本發(fā)明的所述肌尾噬菌體BP-66、BP-63及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12具有如下的優(yōu)勢(shì)：其為嚴(yán)格的烈性噬菌體且對(duì)宿主菌具有高毒性；具有較廣的宿主范圍且在低濃度下依然對(duì)宿主菌具有高毒性；其DNA無法編碼可能引起潛在健康風(fēng)險(xiǎn)的蛋白；在非致病性細(xì)菌宿主上可較好增殖；可進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)；其培養(yǎng)液可于室溫下穩(wěn)定存活，于4℃下可保存6個(gè)月。本發(fā)明未對(duì)供試噬菌體進(jìn)行任何遺傳修飾。因此，本發(fā)明肌尾噬菌體BP-66、BP-63及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12能為開發(fā)噬菌體療法提供優(yōu)良的菌株資源，并具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。

現(xiàn)有技術(shù)中，李夢(mèng)哲(2014)發(fā)現(xiàn)沙門氏菌噬菌體STP4-a僅識(shí)別沙門氏菌，其裂解率為80.04％；包紅朵等(2011)發(fā)現(xiàn)沙門氏菌噬菌體PSA-6a可裂解5株沙門氏菌及1株大腸桿菌。本發(fā)明中3株沙門氏菌噬菌體雞尾酒組合可裂解43株沙門氏菌，裂解率可達(dá)97.7％，且可識(shí)別1株蘇云金芽孢桿菌及5株大腸桿菌，具有更強(qiáng)的裂解性及更寬的宿主譜。因此本發(fā)明具有更為優(yōu)質(zhì)的技術(shù)效果。

近年來，隨著抗生素的濫用，細(xì)菌對(duì)其耐藥性逐漸增強(qiáng)，尤其是病原菌耐藥菌株的出現(xiàn)，對(duì)經(jīng)濟(jì)造成損失的同時(shí)也極大威脅著人類健康，克服細(xì)菌耐藥性已成為目前的關(guān)注重點(diǎn)。本發(fā)明所述肌尾噬菌體BP-66、BP-63、以及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12或其組合物對(duì)細(xì)菌具有專一且較強(qiáng)的殺滅能力，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的記載及本領(lǐng)域常識(shí)將本發(fā)明所述肌尾噬菌體BP-66、BP-63、以及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12或其組合物制備成應(yīng)用于醫(yī)療，檢測(cè)，消毒及食品防護(hù)等方面的各種產(chǎn)品加以工業(yè)應(yīng)用。

本發(fā)明所述肌尾噬菌體BP-66、BP-63、以及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12或其組合物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的記載和本領(lǐng)域常識(shí)制備成應(yīng)用于治療或預(yù)防由沙門氏菌引起的感染性疾病的藥劑或試劑?？杀簧抽T氏菌感染的寄主包括人類、家畜(豬、牛、羊等)、家禽(雞、鴨、鵝等)，以及 各種獸類、魚類、鼠類等。

本發(fā)明所述肌尾噬菌體BP-66、BP-63、以及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12或其組合物的產(chǎn)品形式可包括但不限于以載體攜帶、濃縮注射或藥劑浸泡等形式施用于被防治的寄主體表、口部、直腸、胸膜內(nèi)部等部位；作為實(shí)施方案之一，所述載體攜帶形式包括但不限于口服含水性載體、口服無水性載體、乳膏制劑等；濃縮注射形式包括但不限于疫苗注射、胸膜腔注射、經(jīng)脈注射等；藥劑浸泡形式包括但不限于氣霧劑、漂洗劑等。

本發(fā)明所述肌尾噬菌體BP-66、BP-63及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12可選取一株或多株被制備成作為有效成分應(yīng)用于沙門氏菌的快速檢測(cè)試劑或試劑盒。其包括但不限于以試紙、試劑盒等形式對(duì)目標(biāo)樣本中的沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，或?qū)εR床樣本中的目標(biāo)致病菌進(jìn)行篩選，可有效確保檢測(cè)的靈敏度。

本發(fā)明所述肌尾噬菌體BP-66、BP-63、以及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12或其組合物被制備常作為有效成分應(yīng)用于環(huán)境消毒的各種產(chǎn)品，例如包括但不限于以液體浸泡、噴灑、與含水性載體聯(lián)合使用等形式對(duì)配水系統(tǒng)、醫(yī)療設(shè)施、養(yǎng)殖業(yè)設(shè)施、公共及私人設(shè)施或其他環(huán)境表面進(jìn)行消毒去污，可有效控制目標(biāo)細(xì)菌的生長(zhǎng)及活性。所述液體浸泡、噴灑形式包括但不限于洗滌劑、消毒劑、去污劑等；所述含水性載體包括但不限于磷酸鹽緩沖液、LB培養(yǎng)基、氯游離水等。

本發(fā)明所述肌尾噬菌體BP-66、BP-63、及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12或其組合物還被制做成作為有效成分應(yīng)用于食品防護(hù)的各種產(chǎn)品。本發(fā)明包括但不限于以液體浸泡、噴灑、與合成組分聯(lián)合使用等形式對(duì)由沙門氏菌侵染所導(dǎo)致的食品腐壞進(jìn)行預(yù)防，尤其適用于熟食或不宜滅菌的食品。所述液體浸泡、噴灑形式包括但不限于食品除菌劑、食品消毒劑、食品防腐劑等；本發(fā)明中合成組分包括但不限于苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸、山梨酸鉀、丙酸鈣等。

附圖說明

圖1是肌尾噬菌體BP-66噬菌體平板培養(yǎng)照片；

圖2是肌尾噬菌體BP-63噬菌體平板培養(yǎng)照片；

圖3是長(zhǎng)尾噬菌體BP-12噬菌體平板培養(yǎng)照片；

圖4是肌尾噬菌體BP-66噬菌體透射電子顯微鏡照片；

圖5是肌尾噬菌體BP-63噬菌體透射電子顯微鏡照片；

圖6是長(zhǎng)尾噬菌體BP-12噬菌體透射電子顯微鏡照片；

圖7是肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12噬菌體基因組大小。

所述肌尾噬菌體BP-66(Myoviridae sp.BP-66)的保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，郵編430072；保藏日期為2015年3月23日；保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015146，

所述肌尾噬菌體BP-63(Myoviridae sp.BP-63)的保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，郵編430072；保藏日期為2015年3月23日；保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015145；

所述長(zhǎng)尾噬菌體BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)的保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，郵編430072；保藏日期為2015年3月23日；保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015141。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但不以任何的方式限制本發(fā)明的有效范圍。

以下實(shí)例中，所涉及菌株代號(hào)均以本公司的命名方式編號(hào)。

以下實(shí)例中，LB液體培養(yǎng)基的配方為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000ml，pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基的配方為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH 7.0。

半固體瓊脂培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂7g，蒸餾水1000ml，pH 7.0。

SM液配方為：氯化鈉8.5g，硫酸鎂2g，1mol/L TrisHCl 50ml，明膠 0.25g，蒸餾水1000ml。

肌尾噬菌體P-66、肌尾噬菌體BP-63和長(zhǎng)尾噬菌體BP-12的組合物(1∶1∶1)均為按照實(shí)施例13的方法制備。

實(shí)施例1肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12的分離純化

采集加拿大蒙特利爾污水處理廠水樣50ml，3500rpm離心10min后取9ml上清液，將其與1ml 10倍LB液體培養(yǎng)基及1ml處于對(duì)數(shù)期的沙門氏菌(10⁸cfu/ml)均勻混合，于37℃過夜培養(yǎng)，富集噬菌體。將樣本富集液3500rpm離心10min，取上清液過0.22μm的微孔濾膜除菌得到含有噬菌體的濾液。取濾液50μl與其宿主沙門氏菌菌液300μl均勻混合，靜置15min使其與細(xì)菌表面的受體充分結(jié)合。將上述混合液加入4ml冷卻至47℃的半固體瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后立即鋪于已凝固的固體瓊脂平板上，待瓊脂凝固后于37℃倒置培養(yǎng)6-8h，觀察噬菌斑生長(zhǎng)情況。在形成噬菌斑的雙層平板上，用無菌槍頭挑取大而透亮的噬菌斑，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，加入0.1ml沙門氏菌菌液并混勻，37℃過夜培養(yǎng)，3500rpm離心10min取上清后以細(xì)菌濾膜過濾，采用雙層平板法觀察噬菌斑形態(tài)。重復(fù)操作3-5次后，即可得形狀和大小一致的噬菌斑。

自蒙特利爾污水中共分離得到3株沙門氏菌噬菌體，其分別為肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12。BP-66與BP-63噬菌體在沙門氏菌菌苔上均產(chǎn)生單一的大而透明的圓形噬菌斑，直徑為10mm(參見圖1、圖2)。BP-12噬菌體在沙門氏菌菌苔上產(chǎn)生單一的大而不透明的圓形噬菌斑，直徑為11mm(參見圖3)；BP-66噬菌體、BP-63噬菌體、BP-12噬菌體透射電子顯微鏡照片參見圖4-6。

肌尾噬菌體BP-66(Myoviridae sp.BP-66)的保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015146，肌尾噬菌體BP-63(Myoviridae sp.BP-63)的保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015145，長(zhǎng)尾噬菌體BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015141。

經(jīng)過核苷酸測(cè)序，所述肌尾噬菌體BP-66具有SEQ ID NO：1的核苷酸 序列；肌尾噬菌體BP-63具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或長(zhǎng)尾噬菌體BP-12具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。圖7是肌尾噬菌體BP-66、肌尾噬菌體BP-63及長(zhǎng)尾噬菌體BP-12噬菌體基因組大小。

實(shí)施例2噬菌體BP-66、BP-63及BP-12效價(jià)的測(cè)定

用SM液做稀釋液，將噬菌體BP-66、BP-63及BP-12原液分別10倍梯度稀釋至10⁷倍。分別取10⁵、10⁶及10⁷稀釋度的噬菌體培養(yǎng)液100μl與其宿主菌多重耐藥性鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 700408)菌液300μl均勻混合，靜置15min使其與細(xì)菌表面的受體充分結(jié)合。將上述混合液加入4ml冷卻至47℃的半固體瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后立即鋪于已凝固的固體瓊脂平板上，待瓊脂凝固后于37℃倒置培養(yǎng)6-8h。每個(gè)稀釋度需做三個(gè)平行樣，計(jì)數(shù)時(shí)取此稀釋度的三個(gè)平行樣的平均數(shù)。其中，噬菌體效價(jià)(PFU/ml)＝平均噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10

從表1可以得出，噬菌體BP-66、BP-63及BP-12培養(yǎng)12h后均具有10⁸PFU/ml以上的效價(jià)。

表1 連續(xù)培養(yǎng)條件下噬菌體BP-66、BP-63及BP-12的效價(jià)

實(shí)施例3噬菌體BP-66、BP-63及BP-12對(duì)沙門氏菌最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)的測(cè)定

挑取腸道沙門氏菌單個(gè)菌落，接種到盛有3ml LB培養(yǎng)液的試管中，37℃搖床中160rpm振蕩培養(yǎng)12h，得到宿主菌懸液。將菌懸液以1∶100比例轉(zhuǎn)接到10ml LB培養(yǎng)液，37℃160rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期。按照感染復(fù)數(shù)比例分別加入噬菌體BP-66、BP-63及BP-12純培養(yǎng)液和宿主菌(MOI＝噬菌體數(shù)量/細(xì)菌數(shù)量)，加入LB液體培養(yǎng)基使各管總體積相同。在37℃搖床中160rpm振蕩培養(yǎng)4h。培養(yǎng)完畢后10000g離心10min并收集上清，測(cè)定噬菌 體效價(jià)。各點(diǎn)均作雙份復(fù)管培養(yǎng)取平均值，以產(chǎn)生最高噬菌體效價(jià)的MOI為最佳感染復(fù)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)果如表2所示，噬菌體BP-12效價(jià)達(dá)到最高(2x10⁸PFU/ml)時(shí)，其MOI＝0.00007；噬菌體BP-63效價(jià)達(dá)到最高(7.7x10⁹PFU/ml)時(shí)，其MOI＝0.1；噬菌體BP-66效價(jià)達(dá)到最高(1.4x10⁸PFU/ml)時(shí)，其MOI＝0.1；因而可以確定噬菌體BP-12、BP-63及BP-66感染腸道沙門氏菌的最佳MOI分別為0.00007、0.1及0.1。

表2 不同感染復(fù)數(shù)下噬菌體BP-66、BP-63及BP-12的效價(jià)

實(shí)施例4噬菌體BP-66、BP-63及BP-12的pH穩(wěn)定性試驗(yàn)

取無菌EP管分別加入不同pH(2、4、6、9)的LB培養(yǎng)基900μl后將上述EP管置于37℃的恒溫水浴中，待溫度平衡后加入100μl菌體純培養(yǎng)液，恒溫反應(yīng)120min。待反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后將樣品做適當(dāng)稀釋后采用雙層平板法 測(cè)定噬菌體效價(jià)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

結(jié)果如表3所示，噬菌體BP-66在pH為6-9的范圍內(nèi)的效價(jià)相對(duì)較穩(wěn)定，BP-63的pH范圍為2-4，BP-12則為4-6。

表3 反應(yīng)不同時(shí)間后噬菌體BP-66、BP-63及BP-12的pH值穩(wěn)定性

a.BP-66的pH值穩(wěn)定性(起始濃度：10⁶PFU/ml)

b.BP-63的pH值穩(wěn)定性(起始濃度：10⁸PFU/ml)

c.BP-12的pH值穩(wěn)定性(起始濃度：107PFU/ml)

注：ND：未測(cè)定。

實(shí)施例5噬菌體BP-66、BP-63及BP-12的熱度及壓力穩(wěn)定性試驗(yàn)

各取100μl噬菌體純培養(yǎng)液分裝于無菌EP管中，分別于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴中作用5min；使用弗氏細(xì)胞壓碎器使噬菌體置于極高壓力條件下(1000psi)放置5min。作用時(shí)間結(jié)束后取出樣品管并立即置于冰浴中冷卻，經(jīng)適當(dāng)稀釋后采用雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)果如表4所示，BP-66最適存活溫度為50℃，BP-63最適存活溫度為60℃，而BP-12最適存活溫度為60℃。3株噬菌體對(duì)溫度的熱穩(wěn)定性相對(duì)較好，在60℃水浴作用下仍有較高的效價(jià)，但當(dāng)水浴溫度增加至70℃后，其效價(jià)難以檢查，對(duì)溫度的耐受性不高，不宜長(zhǎng)時(shí)間在高溫下作用。而供試噬菌體對(duì)壓力耐受性均較好，在壓力為1000psi時(shí)仍有較高效價(jià)。

表4 噬菌體BP-66、BP-63及BP-12于不同溫度及壓力下的效價(jià)

實(shí)施例6噬菌體BP-66、BP-63及BP-12的存活穩(wěn)定性試驗(yàn)

各取1ml噬菌體BP-66、BP-63及BP-12的純培養(yǎng)液分裝于無菌EP管中，分別于4℃、25℃、37℃下放置，定期經(jīng)適當(dāng)稀釋后采用雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)。

結(jié)果如表5所示，4℃條件下噬菌體BP-66與BP-63可存放259d，且對(duì)宿主菌的侵染力均大于95％，BP-12則可存放161d；25℃下噬菌體BP-66與BP-63分別可于168d及126d內(nèi)保持對(duì)宿主的高侵染性，而BP-12僅能維持14d；37℃下噬菌體BP-66與BP-63分別可在15d及37d內(nèi)維持高侵染性，BP-12則僅可維持2d。說明3株供試噬菌體適宜4℃低溫存放。

表5 噬菌體BP-66、BP-63及BP-12于不同保存溫度下的存活穩(wěn)定性

實(shí)施例7噬菌體BP-66、BP-63及BP-12的毒力基因或不良基因缺失檢測(cè)試驗(yàn)

選取65種經(jīng)鑒定源自病原細(xì)菌體內(nèi)溶源性噬菌體的毒力基因(表6)，通過測(cè)定噬菌體BP-66、BP-63及BP-12的全基因組并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以確定其是否含有上述毒力基因。

結(jié)果顯示，3株供試噬菌體均不含有下列毒力基因。供試噬菌體無不良基因。

表6 病原細(xì)菌體內(nèi)溶源性噬菌體的主要已知毒性基因

實(shí)施例8噬菌體BP-66、BP-63及BP-12對(duì)沙門氏菌裂解范圍試驗(yàn)

采用點(diǎn)滴法來測(cè)定噬菌體的裂解譜。挑取44株不同血清型腸道沙門氏 菌的單菌落分別接種于盛有3ml LB的試管中，160rpm培養(yǎng)8h，制得各株細(xì)菌菌液。取300μl菌懸液分別與半固體培養(yǎng)基混合鋪于普通瓊脂平板上，分別取5μl噬菌體培養(yǎng)液及含有BP-66、BP-63及BP-12(比例為1∶1∶1)的培養(yǎng)液滴于平板的不同位置上，加樣時(shí)各噬菌體培養(yǎng)液間不可接觸，以免影響試驗(yàn)結(jié)果。待自然風(fēng)干后37℃培養(yǎng)6-8h，觀察結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)三次。

結(jié)果如表7所示，BP-66、BP-63及BP-12具有較寬的宿主范圍。BP-63可裂解35株血清型腸道沙門氏菌，BP-66可裂解38株，BP-12可裂解22株。更重要的是，含有BP-66、BP-63及BP-12的雞尾酒(比例為1∶1∶1)可識(shí)別除2270號(hào)菌株以外的所有供試沙門氏菌。說明這些噬菌體具有較寬的宿主譜且在噬菌體治療方面具有極大的應(yīng)用潛力。

表7 BP-66、BP-63、BP-12的裂解譜測(cè)定結(jié)果

注：+++：完全裂解；++：大部分裂解；+：裂解；+/-：微弱裂解；-：未裂解

實(shí)施例9噬菌體BP-66、BP-63及BP-12在不同濃度下與沙門氏菌的互作試驗(yàn)

挑取25株不同血清型腸道沙門氏菌單菌落分別接種于盛有3ml LB的試管中，160rpm培養(yǎng)8h，制得各株細(xì)菌菌液。取300μl菌懸液分別與半固體培養(yǎng)基混合鋪于普通瓊脂平板上。用SM液做稀釋液，將噬菌體BP-66、BP-63及BP-12原液分別調(diào)整濃度至10⁸PFU/ml、10⁷PFU/ml、10⁶PFU/ml與10⁵PFU/ml后，分別取5μl噬菌體培養(yǎng)液滴于平板的不同位置上，加樣時(shí)各噬菌體培養(yǎng)液間不可接觸，以免影響試驗(yàn)結(jié)果。待自然風(fēng)干后37℃培養(yǎng)6-8h，觀察結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)三次。

結(jié)果如表8所示，BP-66可裂解25株細(xì)菌，其在10⁸與10⁷PFU/ml濃度下對(duì)所有供試菌株均具有強(qiáng)裂解性；BP-63可裂解22株細(xì)菌，其在10⁸PFU/ml濃度下對(duì)20株細(xì)菌菌株具有強(qiáng)裂解性，對(duì)2株細(xì)菌具有裂解性，對(duì)3株細(xì)菌無裂解性；BP-12可裂解24株細(xì)菌，其在10⁸PFU/ml濃度下對(duì)19株細(xì)菌具有強(qiáng)裂解性，對(duì)5株細(xì)菌具有裂解性。

表8a-c 不同濃度下噬菌體BP-66、BP-63及BP-12的交互反應(yīng)

8a.不同濃度下BP-66的交互反應(yīng)

8b.不同濃度下BP-63的交互反應(yīng)

8c.不同濃度下BP-12的交互反應(yīng)

注：+++：完全裂解；++：大部分裂解；+：裂解；+/-：微弱裂解；-：未裂解

實(shí)施例10噬菌體BP-66、BP-63及BP-12對(duì)非致病性細(xì)菌的裂解試驗(yàn)

挑取包括芽孢桿菌屬、大腸桿菌等在內(nèi)的61株非致病性細(xì)菌單菌落分別接種于盛有3ml LB的試管中，160rpm培養(yǎng)8h，制得各株細(xì)菌菌液。取300μl菌懸液分別與半固體培養(yǎng)基混合鋪于普通瓊脂平板上。分別取5μl噬菌體培養(yǎng)液及含有BP-66、BP-63及BP-12(比例為1∶1∶1)的雞尾酒組合培養(yǎng)液滴于平板的不同位置上，加樣時(shí)各噬菌體培養(yǎng)液間不可接觸，以免影響試驗(yàn)結(jié)果。待自然風(fēng)干后37℃培養(yǎng)6-8h，觀察結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)三次。

結(jié)果如表9所示，在本研究中，BP-66、BP-63及BP-12分別與30株供試大腸桿菌菌株中的5株、4株及3株反應(yīng)，同時(shí)BP-12及雞尾酒組合無法識(shí)別除1株蘇云金芽孢桿菌及6株大腸桿菌外的其他非致病性細(xì)菌。即，BP-63對(duì)57株供試細(xì)菌無裂解性，BP-66對(duì)56株供試細(xì)菌無裂解性，BP-12對(duì)57株供試細(xì)菌無裂解性。這類交互反應(yīng)對(duì)于噬菌體療法的應(yīng)用具有極大 幫助。

表9 沙門氏菌噬菌體及雞尾酒與61株非致病性細(xì)菌的交互反應(yīng)

注：+++：完全裂解；++：大部分裂解；+：裂解；+/-：微弱裂解；-：未裂解

實(shí)施例11噬菌體BP-66、BP-63及BP-12與非宿主性致病性細(xì)菌的互作試驗(yàn)

挑取185株非宿主性致病性細(xì)菌單菌落分別接種于盛有3ml LB的試管中，160rpm培養(yǎng)8h，制得各株細(xì)菌菌液。取300μl菌懸液分別與半固體培養(yǎng)基混合鋪于普通瓊脂平板上。分別取5μl噬菌體培養(yǎng)液及含有BP-66、BP-63及BP-12(比例為1∶1∶1)的雞尾酒組合培養(yǎng)液滴于平板的不同位置上， 加樣時(shí)各噬菌體培養(yǎng)液間不可接觸，以免影響試驗(yàn)結(jié)果。待自然風(fēng)干后37℃培養(yǎng)6-8h，觀察結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)三次。

將噬菌體與非宿主性致病性細(xì)菌進(jìn)行交互反應(yīng)，結(jié)果顯示，BP-66、BP-63及BP-12僅可識(shí)別185株供試非宿主性致病性細(xì)菌中的1株(表10)。

表10 沙門氏菌噬菌體及雞尾酒與185株致病性細(xì)菌的交互反應(yīng)

注：+++：完全裂解；++：大部分裂解；+：裂解；+/-：微弱裂解；-：未裂解

實(shí)施例12噬菌體BP-66、BP-63及BP-12的發(fā)酵制備

挑取腸道沙門氏菌單個(gè)菌落，接種到盛有3ml LB培養(yǎng)液的試管中，37℃搖床中160rpm振蕩培養(yǎng)12h，得到宿主菌懸液。將菌懸液以1∶100比例轉(zhuǎn)接到500ml LB培養(yǎng)液，37℃160rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期并測(cè)定其菌懸液濃度。沙門氏菌噬菌體BP-66、BP-63及BP-12發(fā)酵制備的體系為8L，發(fā)酵培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。以3株噬菌體最適pH值為參數(shù)調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值，其中噬菌體BP-66與BP-12的發(fā)酵初始pH值為6，噬菌體BP-63發(fā)酵初始pH值為2。采用火焰接種法接種，以其相應(yīng)的最佳感染復(fù)數(shù)比例向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接入80ml的噬菌體(10⁸PFU/ml)和對(duì)數(shù)期宿主菌液(10⁹CFU/ml)。發(fā)酵過程中通入無菌空氣，并加入3‰消泡劑，發(fā)酵制備時(shí)間為12h。自發(fā)酵開始起每2h自取樣口取20ml噬菌體與宿主菌的混合液于無菌容器中，6000rpm離心15min，取上清液過0.22μm的微孔濾膜除菌得到含有噬菌體的濾液并測(cè)定其效價(jià)，方法參照實(shí)施例2。待發(fā)酵結(jié)束后，將噬菌體與宿主菌的全部混合液自取樣口取出接入無菌容器中，6000rpm離心15min，取上清液經(jīng)真空抽氣泵抽濾至無菌過濾器裝置內(nèi)，得到噬菌體發(fā)酵液并于4℃下保存。

由表11可知，噬菌體BP-66與BP-12均于發(fā)酵6h時(shí)效價(jià)達(dá)最高，分 別為4x10¹⁰PFU/ml與2.5x10¹⁰PFU/ml；噬菌體BP-63則于發(fā)酵8h時(shí)效價(jià)最高(3.5x10¹⁰PFU/ml)。其后3株噬菌體的效價(jià)雖有所下降，但整體數(shù)量級(jí)未發(fā)生變化，12h發(fā)酵結(jié)束后各噬菌體效價(jià)均由初始的10⁸PFU/ml升高至10¹⁰PFU/ml，提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，利用發(fā)酵法進(jìn)行噬菌體的大規(guī)模工業(yè)制備是切實(shí)可行的。

表11 沙門氏菌噬菌體BP-66、BP-63及BP-12的發(fā)酵動(dòng)態(tài)

實(shí)施例13噬菌體BP-66、BP-63及BP-12組合物的制備

分別取效價(jià)為1x10⁸PFU/ml噬菌體BP-66、BP-63及BP-12的原液，將3株噬菌體等體積均勻混合于SM液中，制成BP-66、BP-63及BP-12的1∶1∶1的雞尾酒組合。選取實(shí)施例8中3株噬菌體對(duì)44株不同血清型腸道沙門氏菌具有不同裂解能力的菌株，共33株，挑取其單菌落分別接種于盛有3ml LB的試管中，160rpm培養(yǎng)8h，制得各株細(xì)菌菌液。取300μl菌懸液分別與半固體培養(yǎng)基混合鋪于普通瓊脂平板上，分別取5μl噬菌體雞尾酒組合的培養(yǎng)液滴于平板的不同位置上。待自然風(fēng)干后37℃培養(yǎng)6-8h，觀察結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)三次。

結(jié)果如表12所示，BP-66、BP-63及BP-12分別對(duì)該33株沙門氏菌具有不同的裂解能力，其中BP-63可裂解25株供試沙門氏，BP-66可裂解28株，BP-12可裂解12株。而3株噬菌體的雞尾酒組合可識(shí)別所有供試沙門氏菌且將其被裂解能力最大化。說明噬菌體雞尾酒組合可彌補(bǔ)噬菌體單一應(yīng)用時(shí)宿主譜的局限性。

表12 噬菌體BP-66、BP-63及BP-12組合物的裂解譜測(cè)定結(jié)果