本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種DC細(xì)胞的制備方法。
背景技術(shù)：
樹突狀細(xì)胞簡稱DC細(xì)胞，是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，已證實(shí)，DC細(xì)胞是唯一能夠顯著刺激初始T細(xì)胞增殖的抗原提呈細(xì)胞。DC細(xì)胞可以有效誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞的增殖和活化，是機(jī)體腫瘤免疫反應(yīng)的主要啟動者和參與者，是充滿前景的治療工具。目前體外培養(yǎng)DC細(xì)胞主要是使用GM-CSF和IL-4兩種細(xì)胞因子配合DC細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行，這個方法制備得到的DC細(xì)胞個數(shù)不高，不能滿足人們對DC細(xì)胞的需求，因此，需要提供一種新的DC細(xì)胞制備方法，來提高制備得到的DC細(xì)胞個數(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種DC細(xì)胞的制備方法，本發(fā)明制備得到的DC細(xì)胞個數(shù)多，操作簡單。
本發(fā)明提出的一種DC細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
S1、用人單核細(xì)胞在培養(yǎng)基中孵育得到未成熟DC細(xì)胞溶液；
S2、取S1中得到的未成熟DC細(xì)胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7得到混合液；調(diào)節(jié)溫度至35-37℃，孵育48-52h，收集細(xì)胞。
優(yōu)選地，S1中，培養(yǎng)基為含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培養(yǎng)基，其中，IL-4的濃度為1000U/ml，GM-CSF的濃度為800U/ml。
優(yōu)選地，S1中，將人單核細(xì)胞加入DC-GROW培養(yǎng)基中混勻，培養(yǎng)得到溶液A；調(diào)節(jié)溫度至35-37℃，孵育3.5-4.5h，除去非粘附細(xì)胞，向粘附細(xì)胞中加入培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育，至有細(xì)胞集落生成時，繼續(xù)孵育23-25h得到未成熟DC細(xì)胞溶液。
優(yōu)選地，S1中，溶液A中，人單核細(xì)胞的濃度為1×106個/ml。
優(yōu)選地，S1中，在繼續(xù)孵育，至有細(xì)胞集落生成的過程中，若培養(yǎng)基顏色變黃，則補(bǔ)加培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，S2中，混合液中，IL-1β的濃度為20ng/ml，IL-6的濃度為200ng/ml，TNF-α的濃度為20ng/ml，PGE2的濃度為2μg/ml，GM-CSF的濃度為800U/ml，IL-4的濃度為1000U/ml，IL-7的濃度為20ng/ml。
上述S1中，DC-GROW培養(yǎng)基可以從市場上購得。
上述S2中，IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7均可從市場上購得。
本發(fā)明選用GM-CSF、IL-4、IL-7相互配合，可以在制備DC細(xì)胞的過程中，抑制巨噬細(xì)胞的過渡生長，從而將更多的人單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化成DC細(xì)胞，進(jìn)而大大增加了制備得到的DC細(xì)胞個數(shù)；在GM-CSF促進(jìn)人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化的過程中，IL-4和IL-7配合GM-CSF，可以抑制巨噬細(xì)胞的過渡生長，促進(jìn)得到更多的DC細(xì)胞；在人單核細(xì)胞分化成DC細(xì)胞后，GM-CSF配合IL-4、IL-7，促進(jìn)DC細(xì)胞存活，從而進(jìn)一步增加了DC細(xì)胞的個數(shù)；GM-CSF還可以提高細(xì)胞表面MHC-II類分子的表達(dá)，從而增強(qiáng)DC細(xì)胞的抗原遞呈功能；GM-CSF、IL-4、IL-7與IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2相互配合，可以進(jìn)一步促進(jìn)DC細(xì)胞的生長和成熟；本發(fā)明操作簡單，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
附圖說明
圖1為本發(fā)明所得DC細(xì)胞的含量與未添加IL-7所得DC細(xì)胞的含量的比較圖。
具體實(shí)施方式
下面，通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
實(shí)施例1
一種DC細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
S1、用人單核細(xì)胞在培養(yǎng)基中孵育得到未成熟DC細(xì)胞溶液，其中，培養(yǎng)基為含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培養(yǎng)基，其中，IL-4的濃度為1000U/ml，GM-CSF的濃度為800U/ml；
S2、取S1中得到的未成熟DC細(xì)胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7得到混合液；調(diào)節(jié)溫度至36℃，孵育50h，收集細(xì)胞，其中，混合液中，IL-1β的濃度為20ng/ml，IL-6的濃度為200ng/ml，TNF-α的濃度為20ng/ml，PGE2的濃度為2μg/ml，GM-CSF的濃度為800U/ml，IL-4的濃度為1000U/ml，IL-7的濃度為20ng/ml。
實(shí)施例2
一種DC細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
S1、將人單核細(xì)胞加入DC-GROW培養(yǎng)基中混勻，培養(yǎng)得到溶液A；調(diào)節(jié)溫度至35℃，孵育4.5h，除去非粘附細(xì)胞，向粘附細(xì)胞中加入培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育，至有細(xì)胞集落生成時，繼續(xù)孵育23h得到未成熟DC細(xì)胞溶液，其中，培養(yǎng)基為含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培養(yǎng)基，其中，IL-4的濃度為1000U/ml，GM-CSF的濃度為800U/ml，溶液A中，人單核細(xì)胞的濃度為1×106個/ml；
S2、取S1中得到的未成熟DC細(xì)胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7得到混合液；調(diào)節(jié)溫度至37℃，孵育48h，收集細(xì)胞，其中，混合液中，IL-1β的濃度為20ng/ml，IL-6的濃度為200ng/ml，TNF-α的濃度為20ng/ml，PGE2的濃度為2μg/ml，GM-CSF的濃度為800U/ml，IL-4的濃度為1000U/ml，IL-7的濃度為20ng/ml。
實(shí)施例3
一種DC細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
S1、將人單核細(xì)胞加入DC-GROW培養(yǎng)基中混勻，培養(yǎng)得到溶液A；調(diào)節(jié)溫度至37℃，孵育3.5h，除去非粘附細(xì)胞，向粘附細(xì)胞中加入培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育，至有細(xì)胞集落生成時，繼續(xù)孵育25h得到未成熟DC細(xì)胞溶液，其中，培養(yǎng)基為含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培養(yǎng)基，其中，IL-4的濃度為1000U/ml，GM-CSF的濃度為800U/ml，溶液A中，人單核細(xì)胞的濃度為1×106個/ml；
S2、取S1中得到的未成熟DC細(xì)胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7得到混合液；調(diào)節(jié)溫度至35℃，孵育52h，收集細(xì)胞，其中，混合液中，IL-1β的濃度為20ng/ml，IL-6的濃度為200ng/ml，TNF-α的濃度為20ng/ml，PGE2的濃度為2μg/ml，GM-CSF的濃度為800U/ml，IL-4的濃度為1000U/ml，IL-7的濃度為20ng/ml。
實(shí)施例4
一種DC細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
S1、將人單核細(xì)胞加入DC-GROW培養(yǎng)基中混勻，培養(yǎng)得到溶液A；調(diào)節(jié)溫度至35.5℃，孵育4.3h，除去非粘附細(xì)胞，向粘附細(xì)胞中加入培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育，至有細(xì)胞集落生成時，繼續(xù)孵育23.5h得到未成熟DC細(xì)胞溶液，其中，培養(yǎng)基為含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培養(yǎng)基，其中，IL-4的濃度為1000U/ml，GM-CSF的濃度為800U/ml，溶液A中，人單核細(xì)胞的濃度為1×106個/ml；
S2、取S1中得到的未成熟DC細(xì)胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7得到混合液；調(diào)節(jié)溫度至36.5℃，孵育49h，收集細(xì)胞，其中，混合液中，IL-1β的濃度為20ng/ml，IL-6的濃度為200ng/ml，TNF-α的濃度為20ng/ml，PGE2的濃度為2μg/ml，GM-CSF的濃度為800U/ml，IL-4的濃度為1000U/ml，IL-7的濃度為20ng/ml。
實(shí)施例5
一種DC細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
S1、將人單核細(xì)胞加入DC-GROW培養(yǎng)基中混勻，培養(yǎng)得到溶液A；調(diào)節(jié)溫度至37℃，孵育4h，除去非粘附細(xì)胞，向粘附細(xì)胞中加入培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育，至有細(xì)胞集落生成時，繼續(xù)孵育24h得到未成熟DC細(xì)胞溶液，其中，培養(yǎng)基為含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培養(yǎng)基，其中，IL-4的濃度為1000U/ml，GM-CSF的濃度為800U/ml，溶液A中，人單核細(xì)胞的濃度為1×106個/ml；
S2、取S1中得到的未成熟DC細(xì)胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4、IL-7得到混合液；調(diào)節(jié)溫度至37℃，孵育48h，收集細(xì)胞，其中，混合液中，IL-1β的濃度為20ng/ml，IL-6的濃度為200ng/ml，TNF-α的濃度為20ng/ml，PGE2的濃度為2μg/ml，GM-CSF的濃度為800U/ml，IL-4的濃度為1000U/ml，IL-7的濃度為20ng/ml。
試驗(yàn)例1
對照組DC細(xì)胞的制備方法為：在S2中，取S1中得到的未成熟DC細(xì)胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4得到混合液，其他操作同實(shí)施例5，得到細(xì)胞。
對實(shí)施例5得到的細(xì)胞和對照組得到的細(xì)胞進(jìn)行檢測，測定細(xì)胞中DC細(xì)胞的含量，檢測結(jié)果參照圖1，圖1為本發(fā)明所得DC細(xì)胞的含量與未添加IL-7所得DC細(xì)胞的含量的比較圖。由圖1可以看出，本發(fā)明所得DC細(xì)胞的含量高于未添加IL-7所得DC細(xì)胞的含量。IL-7和GM-CSF、IL-4相互配合，可以大大增加DC細(xì)胞的含量。
其中，DC細(xì)胞可以表達(dá)特定的表面標(biāo)記物HLA-DR、CD83和CD86，通常通過檢測這三種物質(zhì)的含量來體現(xiàn)DC細(xì)胞的含量。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。