本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞及臨床化制備方法。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下可以分化形成多種組織來(lái)源的細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成神經(jīng)細(xì)胞等。間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有多向分化潛能，而且還具有自我更新、歸巢、免疫調(diào)節(jié)、造血支持、分泌多種細(xì)胞因子、促進(jìn)干細(xì)胞移植等多種生物學(xué)特性，是參與組織損傷修復(fù)和組織再生的重要細(xì)胞組成部分。目前，可以從多種成體組織(如骨髓)或圍產(chǎn)期組織(如胎盤(pán))提取間充質(zhì)干細(xì)胞。

骨髓組織因其間充質(zhì)干細(xì)胞含量少(約為骨髓單個(gè)核細(xì)胞的0.0001～0.001％)，給供者造成巨大傷害等因素使其在臨床應(yīng)用中受到限制。胎盤(pán)是胎兒發(fā)育期的一個(gè)附屬組織，在胎兒生產(chǎn)后被當(dāng)作醫(yī)療垃圾廢棄掉，不僅對(duì)環(huán)境造成污染而且對(duì)醫(yī)學(xué)資源也造成重大浪費(fèi)。胎盤(pán)由絨毛板、絨毛層、蛻膜構(gòu)成，絨毛板外層由羊膜覆蓋、內(nèi)層由滋養(yǎng)層細(xì)胞覆蓋，而臍帶末梢血管則穿行其中，因此絨毛板在組織結(jié)構(gòu)上保持相對(duì)獨(dú)立性，是一種較易分離的胎盤(pán)組織。研究表明胎盤(pán)絨毛板中含有大量的間充質(zhì)干細(xì)胞，所以從胎盤(pán)絨毛板分離提取間充質(zhì)干細(xì)胞將會(huì)為間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用開(kāi)辟一條嶄新的道路。

從實(shí)體組織提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法主要采用酶消化法。酶消化法是一種快速?gòu)膶?shí)體組織提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，但這種方法獲得的細(xì)胞包含多種細(xì)胞成分，往往采取多種方法加以純化，如密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選、磁珠分選、血細(xì)胞裂解液去除血細(xì)胞等純化方法。不僅酶的種類和酶溶液的配方影響酶消化法的作用效果，而且酶的使用還會(huì)引入多種外源干擾因素。因此，酶消化法不僅增加了生產(chǎn)成本，而且使工藝變得復(fù)雜，從而影響工藝的穩(wěn)定性。

現(xiàn)有的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞制備工藝存在諸多不足，如工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高、較多的外源干擾因素等。如中國(guó)專利CN101270349A公開(kāi)了胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，該方法采用Ⅳ型膠原酶消化母體側(cè)蛻膜胎盤(pán)組織，接著擴(kuò)增獲得分離得到的細(xì)胞，然后用正負(fù)磁珠進(jìn)行分選純化得到胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞。中國(guó)專利CN102586184A公開(kāi)了建立胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)庫(kù)的方法，該方法采用組織消化酶液(含dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶I、膠原酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶)消化胎盤(pán)小葉組織，通過(guò)克隆挑取擴(kuò)增獲得胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞，上述方法在工藝簡(jiǎn)化和生產(chǎn)成本降低方面還有待進(jìn)一步提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞及臨床化制備方法，本發(fā)明以胎盤(pán)絨毛板為材料提取間充質(zhì)干細(xì)胞，提取過(guò)程中無(wú)需分選，無(wú)需浸泡，無(wú)需過(guò)濾和梯度離心，在較低代次即可得到較多細(xì)胞，大大降低了成本消耗，降低了分離時(shí)間，提高了間充質(zhì)干細(xì)胞的產(chǎn)率和純度。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

一種胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床化制備方法，包括以下步驟：

(1)采集母血，并進(jìn)行傳染病檢測(cè)，然后取出胎盤(pán)，棄去覆蓋在外側(cè)的羊膜，用無(wú)菌手術(shù)剪取胎盤(pán)絨毛板；

(2)使用無(wú)菌組織鑷剔除附著在胎盤(pán)絨毛板上的血管和絨毛組織；

(3)用無(wú)菌生理鹽水清洗步驟(2)所得的胎盤(pán)絨毛板至沒(méi)有血色；

(4)使用無(wú)菌手術(shù)剪將清洗后的絨毛板剪成1-5mm²的組織塊，然后用無(wú)菌生理鹽水清洗2-5次；

(5)將步驟(4)中的組織塊接種于完全培養(yǎng)基中，然后置于37℃、5％CO₂潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；其中完全培養(yǎng)基成分為：無(wú)血清培養(yǎng)基(Cellgenix)、30ng/mL bFGF(Cellgenix)、體積濃度為2％的GlutaMAX(invitrogen)；

(6)每隔5-10天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70-80％時(shí)，用TrypLE^TMSelect消化細(xì)胞；

(7)傳代培養(yǎng)：消化后進(jìn)行離心處理，2000r/min離心3min，收集細(xì)胞，按1×10⁴-2×10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²的密度(此處密度為細(xì)胞個(gè)數(shù)與培養(yǎng)瓶底表面積的比計(jì)算得來(lái))接種于T175培養(yǎng)瓶中，然后添加20mL完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，得胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞；

(8)針對(duì)步驟(7)所得的胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目中的至少一項(xiàng)：細(xì)胞活性、無(wú)菌檢測(cè)、細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)、核性檢測(cè)、HLA-ABC/DR配型；

(9)凍存：將傳代培養(yǎng)后的胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞按2×10⁶-8×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL密度凍存于1mL凍存液中，凍存細(xì)胞經(jīng)程序降溫至-80℃后轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存；

(10)建立包含以上信息的胎盤(pán)干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫(kù)，并使該數(shù)據(jù)庫(kù)與步驟(9)的凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。

進(jìn)一步地，步驟(1)中對(duì)胎盤(pán)的處理需在采集后72h內(nèi)進(jìn)行。

進(jìn)一步地，步驟(5)中組織塊與完全培養(yǎng)基的w/v為(0.5-2.0:10-15)g/mL。

進(jìn)一步地，步驟(7)傳代培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞密度為1×10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²。

進(jìn)一步地，步驟(9)中所述凍存液由以下組分組成且各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：80％無(wú)血清培養(yǎng)基(Cellgenix)、13％人血白蛋白(Sigma)、7％二甲基砜(Origen)。

進(jìn)一步地，步驟(9)中凍存時(shí)細(xì)胞密度為2×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL。

根據(jù)上述任一項(xiàng)方法制備得的胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明提供的一種胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞及臨床化制備方法，具有以下幾種有益效果：

(1)本發(fā)明使用的提取方法，步驟簡(jiǎn)單，分離得到胎盤(pán)絨毛板組織塊后只需直接貼壁培養(yǎng)即可得到純度高的間充質(zhì)干細(xì)胞，不僅簡(jiǎn)化了工藝流程，而且避免引入較多外源干擾因素，使得工藝穩(wěn)定性較易控制。

(2)本發(fā)明以胎盤(pán)絨毛板為材料提取間充質(zhì)干細(xì)胞，提高了從胎盤(pán)中提取間充質(zhì)干細(xì)胞的產(chǎn)率。

(3)提取過(guò)程中無(wú)需分選，無(wú)需浸泡，大大降低了成本消耗。

(4)本發(fā)明針對(duì)提取胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞耗時(shí)較長(zhǎng)的問(wèn)題，提供了一種無(wú)需過(guò)濾，無(wú)需梯度離心的組織貼壁法，大大降低了分離時(shí)間，減少了此過(guò)程中的細(xì)胞消耗。

(5)本發(fā)明在較低代次即可得到較多細(xì)胞，避免多次傳代造成的間充質(zhì)干細(xì)胞干性降低，提高了間充質(zhì)干細(xì)胞的純度。

附圖說(shuō)明

圖1為組織貼壁法培養(yǎng)細(xì)胞情況的SEM圖；其中圖1-1為貼壁培養(yǎng)7天后的細(xì)胞情況；圖1-2為貼壁培養(yǎng)14天后的細(xì)胞情況。

圖2為胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)情況的SEM圖；其中圖2-1為P1代胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞；圖2-2為P2代胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞。

圖3為胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化圖；其中圖3-1為對(duì)照組；圖3-2為成脂誘導(dǎo)分化；圖3-3為成軟骨誘導(dǎo)分化；圖3-4為成骨誘導(dǎo)分化。

圖4為胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果圖。

圖5為胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞核型分析圖；其中圖5-1為P3代細(xì)胞核型分析；圖5-2為P15代細(xì)胞核型分析。

圖6為胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞干性標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果圖。

圖7為胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果圖。

圖8為P1-P3代細(xì)胞生長(zhǎng)特性測(cè)定結(jié)果圖。

圖9為P1-P10代細(xì)胞倍增時(shí)間的測(cè)定結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞的分離

(1)與供者簽訂知情同意書(shū)，采集足月胎盤(pán)，72h內(nèi)對(duì)其進(jìn)行如下處理：用無(wú)菌止血鉗剝離覆蓋絨毛板外側(cè)的羊膜；用無(wú)菌手術(shù)剪剪取足量的胎盤(pán)絨毛板組織；

(2)使用無(wú)菌組織鑷剔除附著在胎盤(pán)絨毛板上的血管和絨毛組織；

(3)用無(wú)菌生理鹽水清洗步驟(2)所得的胎盤(pán)絨毛板至沒(méi)有血色；

(4)使用無(wú)菌手術(shù)剪將清洗后的絨毛板組織剪成2mm²的組織塊，用無(wú)菌生理鹽水清洗2-5次，清洗過(guò)程中避免使用抗生素；

(5)收集步驟(4)中的組織塊，將2g組織塊接種于T175培養(yǎng)瓶中，加入15mL完全培養(yǎng)基，然后置于5％CO₂、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每5天更換一次培養(yǎng)基；完全培養(yǎng)基成分為：無(wú)血清培養(yǎng)基(Cellgenix)、30ng/mL bFGF(Cellgenix)、體積濃度為2％的GlutaMAX(invitrogen)；組織貼壁培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，貼壁培養(yǎng)7天后有少量細(xì)胞爬出組織塊，培養(yǎng)14天后有大量細(xì)胞爬出組織塊。

實(shí)施例2胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及凍存

將分離出的胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％后，用TrypLE^TM Select(Gibco)進(jìn)行消化處理，2000r/min離心3min，然后收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞活率，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照1×10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²密度接種于T175培養(yǎng)瓶中，并加入20mL完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后將傳代后的細(xì)胞按密度2×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL重懸于凍存液(成分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)：80％無(wú)血清培養(yǎng)基(Cellgenix)、13％人血白蛋白(Sigma)、7％二甲基砜(Origen))中，凍存體積為1mL，然后經(jīng)程序降溫到-80℃后放置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。傳代培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)圖2。

實(shí)施例3胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定

1、多向誘導(dǎo)分化潛能的鑒定

將P3代胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞接種于六孔板中，每孔接種1×10⁵個(gè)細(xì)胞，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度為70％時(shí)分別加入成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Cyagen)各2mL，以添加完全培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每2-3天更換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)2-3周后，去除誘導(dǎo)培養(yǎng)基并用PBS清洗一次，加入2mL多聚甲醛溶液(4％，v/v)固定30min，然后去除多聚甲醛溶液并用PBS清洗兩次，采用染色液染色，成骨誘導(dǎo)、成軟骨誘導(dǎo)染色時(shí)間為2-3min；成脂誘導(dǎo)染色時(shí)間為30min，然后移除染色液并加入1mL PBS溶液清洗一次，最后置于倒置顯微鏡下觀察、拍攝照片，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，經(jīng)過(guò)2-3周的誘導(dǎo)培養(yǎng)，胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞能夠進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化。

2、表面標(biāo)志物檢測(cè)

將融合度為90％的P3代胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞用TrypLE^TM Select消化處理后，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)成密度為1×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸浮液，100μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后，分別加入10μL熒光標(biāo)記的細(xì)胞表面標(biāo)志物抗體于1mL細(xì)胞懸液中，置于4℃、避光條件下孵育20min，并以未進(jìn)行抗體標(biāo)記的等量細(xì)胞懸液作為空白對(duì)照；所使用的抗體有：CD11b-FITC、CD19-ECD、CD29-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PC7、CD73-PE、CD90-FITC、CD105-PE、HLA-DR-PC7、HLA-G-PE抗體；孵育完成后，用冷的生理鹽水(4℃)清洗一次，1200r/min離心5min，棄上清，加入250μL生理鹽水混勻，并加入250μL的1％多聚甲醛固定，標(biāo)記后的細(xì)胞采用Beckman公司的流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，表面含標(biāo)志物的細(xì)胞率分別為：CD11b：0.70％；CD19：0.00％；CD34：1.4％；CD45：3.0％；HLA-DR：1.6％；HLA-G：25.6％；CD29：99.90％；CD44：98.60％；CD73：99.80％；CD90：93.20％；CD105：99.60％。

經(jīng)流式檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志如CD19，幾乎不表達(dá)CD11b、CD34、CD45、HLA-DR；表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)志物如CD29、CD44、CD73、CD90、CD105；同時(shí)還低表達(dá)一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的Ⅰ類白細(xì)胞抗原分子(HLA-G)。

3、胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞核型分析

將5×10⁵個(gè)P3代細(xì)胞、5×10⁵個(gè)P15代細(xì)胞分別接種于T75培養(yǎng)瓶中，胎兒性別為男性，然后加入10mL完全培養(yǎng)基，放置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)46-72小時(shí)后收獲，收獲前加入0.2％濃度的秋水仙素，37℃，孵育4小時(shí)后收獲，收獲后通過(guò)離心、棄上清、低滲、固定、滴片，最后染色顯帶，結(jié)果見(jiàn)圖5。

經(jīng)核型分析，胎盤(pán)絨毛板來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞在連續(xù)傳代后均未出現(xiàn)明顯的染色體核型異常，所測(cè)胎盤(pán)干細(xì)胞均為胎兒來(lái)源的細(xì)胞成份，而無(wú)母體來(lái)源細(xì)胞的污染。

4、胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞干性標(biāo)志物檢測(cè)

將P3代胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞接種于六孔板中，每孔接種1×10⁵個(gè)細(xì)胞，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80-90％時(shí)，去掉培養(yǎng)基并用PBS清洗一次后加入0.5mL RNAiso Plus，從細(xì)胞中提取總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)定反應(yīng)體積為25μL、模板含量為100ng、2×Pfu PCR MasterMix 12.5μL、待測(cè)基因正反引物各1μL，其余為去離子水，β-Actin作為內(nèi)參；PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，適合溫度退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；72℃延伸5min。

其中，待測(cè)基因有Oct-4、Nanog、Sox2、TERT、β-Actin，

Oct-4的引物：

F(正向引物)5’-3’：AGTGAGAGG CAACCTGGAGA；具體見(jiàn)SEQ IDNO：1；

R(反向引物)5’-3’：GTGAAGTGAGGGCTCCCATA；具體見(jiàn)SEQ IDNO：2；

退火溫度為54℃，產(chǎn)物大小為273bp；

Nanog的引物：

F(5’-3’)：TTCTTGACTGGGACCTTGTC；具體見(jiàn)SEQ IDNO：3；

R(5’-3’)：GCTTGCCTTGCTTTGAAGCA；具體見(jiàn)SEQ IDNO：4；

退火溫度為54℃，產(chǎn)物大小為260bp；

Sox2的引物：

F(5’-3’)：GGGCAGCGTGTACTTATCCT；具體見(jiàn)SEQ IDNO：5；

R(5’-3’)：AGAACCCCAAGATGCACAAC；具體見(jiàn)SEQ IDNO：6；

退火溫度為52℃，產(chǎn)物大小為200bp；

TERT的引物：

F(5’-3’)：GAGCTGACGTGGAAGATGAG；具體見(jiàn)SEQ IDNO：7；

R(5’-3’)：CTTCAAGTGCTGTCTGATTCCAATG；具體見(jiàn)SEQ IDNO：8；

退火溫度為55℃，產(chǎn)物大小為300bp；

β-Actin的引物：

F(5’-3’)：TCCTTCTGCATCCTGTCAGCA；具體見(jiàn)SEQ IDNO：9；

R(5’-3’)：CAGGAGATGGCCACTGCCGCA；具體見(jiàn)SEQ IDNO：10；

退火溫度為58℃，產(chǎn)物大小為300bp。

取5μL擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(1.5％，g/v)。電泳結(jié)束后將凝膠置于紫外照射儀上觀察，拍照，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由結(jié)果可知，胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)干性標(biāo)志物如Oct-4、Nanog、Sox2、TERT。

5、胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子檢測(cè)

按每個(gè)T175培養(yǎng)瓶接種2×10⁶個(gè)P3代胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞，加入20mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到85％時(shí)去除培養(yǎng)基，加入10mL DMEM(Hyclone)并放置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)液，20℃、4000r/min離心20min，吸取上清液，參照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)(R&D)檢測(cè)各個(gè)細(xì)胞因子(IGF-1、PDGF-AA、HGF、EGF、FGF、VEGF)的表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由結(jié)果可知，絨毛板來(lái)源的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌較高的HGF(肝細(xì)胞因子)，少量分泌PDGF-AA(血小板生長(zhǎng)因子AA)、FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)，僅能檢測(cè)到極少量的IGF-1(胰島素樣生長(zhǎng)因子)和EGF(表皮生長(zhǎng)因子)。

6、胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)特性測(cè)定

將P1、P2、P3代細(xì)胞分別接種于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶接種細(xì)胞量為1×10⁵個(gè)細(xì)胞，并加入12mL完全培養(yǎng)基，每3天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)3周，其中每3天檢測(cè)一次培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的數(shù)量，每個(gè)檢測(cè)樣本重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)圖8。

將1×10⁶個(gè)胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞P1-P10代分別接種于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入12mL完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到85-90％時(shí)消化細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間，每個(gè)檢測(cè)樣本重復(fù)3次。細(xì)胞倍增時(shí)間計(jì)算公式為T(mén)＝t×ln2/(lnNt-lnN0)，其中t為細(xì)胞接種到細(xì)胞收獲的時(shí)間，N0為接種時(shí)的細(xì)胞數(shù)量，Nt為收獲時(shí)的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果見(jiàn)圖9。

由結(jié)果可知，胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞(P1-P3為代表)的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期約為3-5天，而P1-P10為代表細(xì)胞的倍增時(shí)間為25-40小時(shí)。

實(shí)施例4胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

1、細(xì)胞活性的檢測(cè)

利用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)凍存前后活細(xì)胞的數(shù)目。

2、細(xì)胞感染的檢測(cè)

利用少量細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞是否受到真菌和細(xì)菌的污染。利用病原學(xué)方法，檢測(cè)細(xì)胞是否受到乙肝兩對(duì)半(HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、Hbe Ab)、丙肝(HCVAb)、艾滋(HIV-1/2Ab)、巨細(xì)胞病毒(CMV-IgA)、EB病毒和梅毒感染。

3、遺傳病的檢測(cè)

利用分子遺傳學(xué)的方法，檢測(cè)凍存細(xì)胞是否存在遺傳病。

4、HLA-ABC/DR配型

檢測(cè)細(xì)胞HLA-ABC/DR表型，并記錄在案。

5、細(xì)胞來(lái)源的調(diào)查

記錄胎兒及其父母的詳細(xì)資料，并記錄在案。

6、胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

在保存正常的胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞后，建立胎盤(pán)絨毛板間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包括前五項(xiàng)資料，并建立與凍存細(xì)胞的關(guān)聯(lián)。