本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種取胚緩沖液及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
從兩性胚子結(jié)合開(kāi)始，經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、胚層形成和組織發(fā)生、特定基因表達(dá)等的復(fù)雜過(guò)程，形成了器官系統(tǒng)，組成了一個(gè)完整的生命個(gè)體。經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，人們雖然對(duì)生命的系統(tǒng)發(fā)生過(guò)程有了很多了解，但其中的許多奧秘，至今尚未被揭露。其中，豬的基因組序列和生理代謝狀況與人高度相似，因此，豬被認(rèn)為是研究人類(lèi)復(fù)雜疾病的良好模型。在豬胚快速發(fā)育的神經(jīng)胚時(shí)期，此時(shí)仔豬的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育快速，心臟、腎臟、腸道及耳朵等原基也開(kāi)始形成，因此，是研究這些組織器官的發(fā)育過(guò)程及其相關(guān)疾病的良好模型。
我國(guó)是世界生豬生產(chǎn)的第一大國(guó)，豬肉是我國(guó)居民的主要肉食來(lái)源，在肉類(lèi)的消費(fèi)比重中占到了65%左右，但我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)水平卻不高。其中，產(chǎn)仔數(shù)不高是影響生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素，而妊娠最初35天內(nèi)的損失占整個(gè)妊娠期的70%左右，提高受精卵的著床率可以顯著提高母豬的產(chǎn)仔數(shù)。豬神經(jīng)胚時(shí)期前后，呈半管狀，胚長(zhǎng)3mm左右，并開(kāi)始著床于子宮角的內(nèi)膜上，因此，此時(shí)的豬胚不能通過(guò)常規(guī)的沖胚手段獲得。而目前沒(méi)有高效收獲神經(jīng)胚時(shí)期豬胚的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種新的取胚緩沖液，高效地收獲仔豬神經(jīng)胚時(shí)期胚胎，用于開(kāi)展神經(jīng)、腎臟、耳朵等發(fā)育疾病及與豬胚著床率相關(guān)的繁殖學(xué)研究。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種取胚緩沖液，主要是由磷酸二氫鉀溶液、磷酸氫二鈉溶液、BSA干粉和蒸餾水組成，所述取胚緩沖液的配制方法為：取磷酸二氫鉀溶液和磷酸氫二鈉溶液按體積比3:7混勻，調(diào)pH至7.2，制得的1×PBS緩沖液，然后加入1×PBS緩沖液質(zhì)量的0.1%的BSA干粉，完成取胚緩沖液的配制。
所述取磷酸二氫鉀溶液和磷酸氫二鈉溶液的濃度都為0.1mol/L。
步驟如下：
（1）將取胚緩沖液置于37℃恒溫水浴備用，向培養(yǎng)皿中加入1×PBS緩沖液，冰浴備用，取出冷藏的子宮組織，將子宮組織移至37℃恒溫臺(tái)；
（2）在37℃恒溫臺(tái)上，放置2-3個(gè)培養(yǎng)皿，剪掉子宮的腸系膜，平展子宮，在遠(yuǎn)端輸卵管處剪開(kāi)子宮角，捏緊遠(yuǎn)端子宮角，剪開(kāi)近端子宮角，將子宮分成兩個(gè)部分，在剪開(kāi)的子宮角近端處，注入100-200mL備用的37℃取胚緩沖液，沖刷子宮角，從子宮角遠(yuǎn)端開(kāi)始，向子宮角近端擠壓包含取胚緩沖液在內(nèi)的子宮角內(nèi)容物到培養(yǎng)皿內(nèi)；
（3）將試驗(yàn)步驟（2）獲得的盛有子宮角內(nèi)容物培養(yǎng)皿移至體視鏡下，尋找胚胎，并逐個(gè)分離胚胎；
（4）將分離得到的胚胎，連同其相連的胚胎外組織一起轉(zhuǎn)移至裝有PBS緩沖液的冰浴培養(yǎng)皿中，漂洗胚胎并編號(hào)記錄。
所述子宮組織含有的胚胎處于神經(jīng)胚時(shí)期。
所述步驟（4）中分離胚胎：采用沿每個(gè)胚胎的胚胎外組織切斷，逐個(gè)分離的方法。
本發(fā)明的有益效果在于：
（1）本發(fā)明提供了一種取胚緩沖液的配制方法及應(yīng)用，利用該取胚緩沖液可高效地收獲神經(jīng)胚時(shí)期胚胎，且能保證所收獲胚胎的活力，收獲到的胚胎可用于細(xì)胞培養(yǎng)及發(fā)育學(xué)和繁殖學(xué)研究。
（2）本發(fā)明發(fā)現(xiàn)向pH 7.2，PBS母液里添加1×PBS母液質(zhì)量0.1%的BSA，可促進(jìn)開(kāi)始著床的豬胚無(wú)傷地從子宮角內(nèi)壁脫落，且能順暢地移出子宮角，提高了豬胚的收獲效率；同時(shí)，在收獲過(guò)程中進(jìn)行溫度控制，進(jìn)一步保證了所收獲胚胎的活力，收獲到的存活豬胚可繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)器官組織細(xì)胞的培養(yǎng)及與神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腎臟系統(tǒng)發(fā)育及繁殖等相關(guān)的研究。
附圖說(shuō)明
圖1為收獲胚胎視鏡圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明：
1、配制反應(yīng)溶液：
PBS緩沖液的配方為：0.1mol/L的磷酸二氫鉀溶液和0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液的按體積比3:7的比例混勻，調(diào)pH至7.2，完成1×PBS緩沖液的配制。
取胚緩沖液的配方為：向1×PBS緩沖液中加入0.1% BSA干粉（不含有Ca2+、Mg2+和酚紅），完成取胚緩沖液的配制。
2、高效的收獲豬胚的方法：
（1）將取胚緩沖液置于37℃水浴鍋內(nèi)恒溫備用。
（2）往直徑為3.5cm的coning培養(yǎng)皿里加入1×PBS緩沖液，置于碎冰上備用。
（3）在37℃恒溫條件下，將冷凍神經(jīng)胚時(shí)期子宮組織移至37℃恒溫臺(tái)上。
（4）在37℃恒溫臺(tái)上，放置2-3個(gè)直徑為10cm的滅菌培養(yǎng)皿，用經(jīng)過(guò)滅菌消毒的醫(yī)療剪刀剪掉子宮的腸系膜，平展子宮；在遠(yuǎn)端輸卵管處剪開(kāi)子宮角，捏緊遠(yuǎn)端子宮角，剪開(kāi)近端子宮角，將子宮分成兩個(gè)部分；使用50mL的一次性醫(yī)療注射器，在剪開(kāi)的子宮角近端處，小心注入100-200mL備用的37℃取胚緩沖液，沖刷子宮角；從子宮角遠(yuǎn)端開(kāi)始，不間斷地向子宮角近端稍用力擠壓包含取胚緩沖液在內(nèi)的子宮角內(nèi)容物到預(yù)置的10cm培養(yǎng)皿內(nèi)。
（5）將試驗(yàn)步驟（4）獲得的盛有子宮角內(nèi)容物的10cm培養(yǎng)皿移至體視鏡下，使用解剖鑷子在鏡下視野內(nèi)尋找胚胎。
（6）用解剖鑷子，沿著每個(gè)胚胎的胚胎外組織切斷，逐個(gè)分離胚胎。
（7）將分離到的胚胎，連同其相連的胚胎外組織一起轉(zhuǎn)移至冰上裝有PBS的3.5cm coning培養(yǎng)皿里，漂洗胚胎，編號(hào)記錄。
3、結(jié)果共收獲了19個(gè)胚胎，胚胎照片見(jiàn)圖1。
本發(fā)明在37℃恒溫條件下分離子宮收獲胚胎，能夠模擬豬胚在母體的生存溫度，維持豬胚的存活。使用37℃、加有0.1% BSA、pH 7.2的1×PBS緩沖液作為母液，配制的取胚緩沖液，首先能夠保持組織細(xì)胞需要的pH范圍；其次，此緩沖液的鹽濃度與體內(nèi)環(huán)境的相似，對(duì)組織細(xì)胞沒(méi)有毒性作用；最后，在不間斷地從子宮角的一端擠壓至另一端，收獲胚胎時(shí)，可以起到潤(rùn)滑作用，利于豬胚從子宮角內(nèi)膜脫落，提高豬胚收獲效率，且能收獲活的豬胚，用于后續(xù)相關(guān)組織和細(xì)胞培養(yǎng)。